同位素标记相对和绝对定量评价非创伤性股骨头坏死患者的血清蛋白组学分析

doi:10.12307/2023.662

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (29): 4664-4669.doi: 10.12307/2023.662

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同位素标记相对和绝对定量评价非创伤性股骨头坏死患者的血清蛋白组学分析

张恩景，蔡进奎，许海甲，李天航，李章华

武汉市第三医院(武汉大学同仁医院)，湖北省武汉市 430060

收稿日期:2022-08-09 接受日期:2022-09-22 出版日期:2023-10-18 发布日期:2022-12-02
通讯作者: 李章华，博士，主任医师，博士生导师，武汉市第三医院(武汉大学同仁医院)，湖北省武汉市 430060
作者简介:张恩景，1975年生，湖北省恩施市人，汉族，2009年湖北中医药大学毕业，硕士，副主任药师，主要从事医院临床药学及研究。
基金资助:
武汉市卫生健康委员会资助项目(2019WZ19Z35)，项目负责人：张恩景

Serum proteomics based on isobaric tags for relative and absolute quantitation technology in patients with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head

Zhang Enjing, Cai Jinkui, Xu Haijia, Li Tianhang, Li Zhanghua

Wuhan Third Hospital (Tongren Hospital of Wuhan University), Wuhan 430060, Hubei Province, China

Received:2022-08-09 Accepted:2022-09-22 Online:2023-10-18 Published:2022-12-02
Contact: Li Zhanghua, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Wuhan Third Hospital (Tongren Hospital of Wuhan University), Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Zhang Enjing, Master, Associate chief pharmacist, Wuhan Third Hospital (Tongren Hospital of Wuhan University), Wuhan 430060, Hubei Province, China
Supported by:
A Grant from the Wuhan Municipal Health Commission, No. 2019WZ19Z35 (to ZEj)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

iTRAQ技术：是由AB SCIEX公司研发的一种基于体外等重同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用4种或8种同位素试剂标记多肽末端氨基或赖氨酸侧链氨基基团，经高分辨质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白质表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。

背景：非创伤性股骨头坏死是一类以髋关节疼痛、功能障碍进行性加重为主要症状的疾病，严重危害人体健康。它的发病机制、早期诊断和治疗仍是临床骨科医生所面临的重大挑战。
目的：采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术，用蛋白质组学筛选可能与非创伤性股骨头坏死相关的关键蛋白。通过分析这些蛋白的表达特性及潜在的生物学功能，为进一步研究非创伤性股骨头坏死病因及分子机制奠定基础。
方法：提取非创伤性股骨头坏死患者和健康人血清蛋白，应用iTRAQ技术标记蛋白，联合液相色谱和串联质谱分离和分析肽段。采用Proteome Discoverer 2.1软件对两组人群蛋白进行鉴定和定量分析，获得差异蛋白，再对这些表达差异蛋白进行GO注释、KEGG通路注释和功能富集聚类分析。
结果与结论：①质谱鉴定共得到1 006个蛋白，通过分析得到137个差异表达蛋白，其中54个蛋白表达上调，83个蛋白表达下调；②与非创伤性股骨头坏死发生相关的表达差异显著的蛋白质包括载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白A2(ApoA2)、载脂蛋白E(ApoE)、补体C4和C7等；③KEGG信号通路富集分析结果显示，关键靶点的主要信号通路为p53信号通路、转录生长因子 β信号通路、扩张型心肌病信号通路；④该结果提示，载脂蛋白与非创伤性股骨头坏死发生密切相关，并发现了与非创伤性股骨头坏死相关的活跃信号通路，为非创伤性股骨头坏死发生及分子机制奠定一定的实验基础。
https://orcid.org/0000-0002-6743-399X (张恩景)；https://orcid.org/0000-0002-9919-8111 (李章华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 非创伤性股骨头坏死, 同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术, 质谱, 蛋白质差异表达

Abstract: BACKGROUND: Nontraumatic osteonecrosis of the femoral head is a group of diseases characterized by progressive worsening of hip pain and dysfunction, which seriously endangers human health. Its pathogenesis, early diagnosis and treatment remain a major challenge for clinical orthopedic surgeons.
OBJECTIVE: Using isobaric tags for relative and absolute quantitation technology, proteomics was used to screen key proteins that may be associated with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head. Analysis of the expression characteristics and potential biological functions of these proteins laid the foundation for further research on the etiology and molecular mechanisms of nontraumatic osteonecrosis of the femoral head.
METHODS: Serum proteins were extracted from nontraumatic osteonecrosis of the femoral head patients and healthy humans, and then labeled using isobaric tags for relative and absolute quantitation technology. Liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry was performed to separate and analyze the peptides. Differentially expressed proteins were obtained through identifying and quantifying the proteins using Proteome Discoverer 2.1 software and analyzed via GO annotation, KEGG pathway annotation, and functional enrichment clustering analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A total of 137 differentially expressed proteins were obtained from 1 006 proteins identified by mass spectrometry, of which the expression of 54 and 83 proteins was up-regulated and down-regulated, respectively. (2) The differentially expressed proteins associated with the development of nontraumatic osteonecrosis of the femoral head included apolipoprotein B, apolipoprotein A2, apolipoprotein E, complement C4 and C7, etc. (3) The analysis results of KEGG signaling pathway enrichment showed that the major signaling pathways of key targets comprised p53 signaling pathway, transcriptional growth factor β signaling pathway, and dilated cardiomyopathy signaling pathway. It is concluded that apolipoproteins were closely related to nontraumatic osteonecrosis of the femoral head. This study provides insight into the molecular mechanisms underlying nontraumatic osteonecrosis of the femoral head.

Key words: nontraumatic osteonecrosis of the femoral head, isobaric tags for relative and absolute quantitation, mass spectrometry, differentially expressed protein

中图分类号:

张恩景, 蔡进奎, 许海甲, 李天航, 李章华. 同位素标记相对和绝对定量评价非创伤性股骨头坏死患者的血清蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4664-4669.

Zhang Enjing, Cai Jinkui, Xu Haijia, Li Tianhang, Li Zhanghua. Serum proteomics based on isobaric tags for relative and absolute quantitation technology in patients with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(29): 4664-4669.

图/表（结果） 6

2.1 参与者数量分析参加试验健康组30人，非创伤性股骨头坏死组30人，均进入结果分析，无脱落。
2.2 基线分析结果两组的年龄、性别、身高、体质量及体质量指数比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性，见表1。

2.3 试验流程图见图1。

2.4 SDS-PAGE电泳结果去除高丰度蛋白后，高峰度蛋白对低丰度蛋白的掩饰遮蔽作用明显减少，血清中条带明显变多，而且条带较为清晰，见图2。

2.5 质谱数据经过Mascot 2.5和Proteome Discoverer 2.1软件对UNIprot数据库进行检索，报告置信度在95%以上的蛋白质共3 775个，其中可定量蛋白质有1 006个。依据蛋白质丰度水平，符合表达差异倍数大于1.2倍(上下调)且P < 0.05筛选标准的差异蛋白质有137个，54个蛋白上调，83个蛋白下调，见表2。

.6 生物信息分析
2.6.1 GO注释利用DIVID网站对差异表达蛋白进行GO功能富集分析，包括3个部分，分别是细胞组分、分子功能、生物过程，结果见图3。蛋白质参与代谢过程(90.85%)、调节过程(96.67%)、刺激应答(93.50%)、单一生物过程(61.35%)、生物过程调控(94.81%)和定位(92.60%)等过程。蛋白质主要具备催化活性(43.61%)、结合(94.90%)、转运因子(8.78%)等活性。细胞组分类别中，蛋白主要定位于细胞外间隙(95.12%)、细胞(87.56%)、细胞器(38.62%)和细胞膜(38.51%)。差异蛋白主要位于细胞间隙，主要参与内吞、免疫过程和防御反应，而其他蛋白质分布较多的为应激反应、转运和补体激活等过程。

2.6.2 KEGG 分析根据KEGG分析，差异蛋白涉及通路共129个，大部分蛋白与一些重大疾病发生的通路相关联，包括癌症、红斑狼疮、肺结核、老年痴呆症、风湿性关节炎和疟疾等；此外，还有一些蛋白参与氨基酸、糖以及其他类次级代谢产物的合成途径。通过数据库对差异蛋白进行注释后发现差异蛋白参与红斑狼疮途径、P53信号通路、转化生长因子β信号通路、癌症转录失调、IgA的肠道免疫网络、扩张型心肌病等重要信号传导通路，显示了非创伤性股骨头坏死患者与健康人的蛋白质表达差异显著，对差异表达蛋白前20位进行KEGG信号通路富集分析，结果见图4。将健康人组与非创伤性股骨头坏死组的组间差异蛋白进行聚类分析，最终筛选出非创伤性股骨头坏死发生过程中表达差异的蛋白质：载脂蛋白A2(ApolipoproteinA，ApoA2)、载脂蛋白B(ApolipoproteinB，ApoB)、载脂蛋白E(ApolipoproteinE，ApoE)、补体C4和C7等。

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引言

材料方法

1.1 设计提取非创伤性股骨头坏死患者和正常人血清蛋白，应用iTRAQ技术标记蛋白，联合LC-MS/MS分离和分析肽段。采用Proteome Discoverer 2.1软件对两组人群蛋白进行鉴定和定量分析，获得差异蛋白，再对这些表达差异蛋白进行GO注释、KEGG通路注释和功能富集聚类分析，筛选与非创伤性股骨头坏死发生相关的表达差异显著的蛋白质。
1.2 时间及地点实验于2018年7-10月在武汉市第三医院骨科招募健康人群及非创伤性股骨头坏死患者。
1.3 对象 2018年7-10月招募30名健康志愿者和30例非创伤性股骨头坏死患者，平均年龄(63.4±13.2)岁，且无用药史。所有参与者彼此之间没有血缘关系，均完全了解试验内容、过程和目的，并签署知情同意书，该项目研究方案已通过武汉市第三医院伦理委员会批准(KY2018-048)。
非创伤性股骨头坏死患者纳入标准：所有参与者年龄在24-70岁，性别不限，诊断标准依据2016年、2020年发布的《中国成人股骨头坏死临床诊疗指南》[11-12]。排除标准：①有慢性基础疾病；有关节感染及全身系统性疾病；②属于创伤性股骨头坏死或特发性股骨头坏死；③长期服用其他影响骨代谢的药物。
健康组纳入标准：①没有严重疾病或激素使用史的健康个体；②没有酒精性股骨头坏死；③既往无饮酒史；④年龄24-70岁之间。
两组受试者抽取静脉血2 mL置入EDTA抗凝管中，室温下静置2 h，3 000×g离心10 min，收集上清液，液氮速冻，-80 ℃保存。
1.4 材料 1260 infinity II HPLC系统(Agilent，美国)；色谱系统(EASY-nLC™ 1200，Thermo scientific，美国)；质谱仪(Q ExactiveTM Plus，Thermo，美国)；低温高速离心机(Eppendorf，德国)；NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific，美国)；XBridge Peptide BEH C18 Column反相色谱柱(Waters，美国)；Acclaim PepMap RSLC C18 反相色谱柱(Thermo scientific，美国)；酶标仪(Multiskcan FC，Thermo scientific，美国)；高丰度亲和色谱柱(Agilent，美国)；iTRAQ 试剂盒(ABI，美国)；二硫苏糖醇(DTT)、脲(Bio-Rad，美国)；胰酶(Promega，美国)；尿素、碘乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵、甲酸铵、乙腈、甲酸(Sigma，美国)。
1.5 方法
1.5.1 蛋白抽提加入适量SDT裂解液于样品中，按照Agilent去高丰度试剂盒提取蛋白。蛋白质浓度用考马斯亮蓝进行染色测定，采用12% SDS-PAGE电泳(电泳条件：恒压250 V，40 min)评价样品质量。取各组样品30 μL加入二硫苏糖醇至终浓度为100 mmol/L，于沸水中煮5 min，加入200 μL UA buffer，放入30 kD超滤离心管中(14 000×g离心15 min)，弃滤液，加入100 μL 10倍稀释的溶解缓冲液，14 000×g离心15 min (重复该步骤2次)，加入40 μL胰蛋白酶缓冲溶液(含4 μg 胰蛋白酶)，于600 r/min振荡器中振荡1 min，最后于37 ℃放置16 h，更换收集管，14 000×g离心15 min，再加入40 μL溶解缓冲液(10倍稀释)，14 000×g离心15 min，收集滤液，冰箱低温保存。
1.5.2 iTRAQ标记取各组样品100 μg肽段，用iTRAQ进行标记，采用反相色谱(Agilent 1260 infinity II HPLC)，以A液(10 mmol/L HCOONH4，5%乙腈，pH 10.0)平衡，流速：1 mL/min。液相条件：0-25 min，B液(0%)；25-30 min，B液(10 mmol/L HCOONH4，85%乙腈，pH 10.0)，0%-7%；30-65 min，B液(7%-40%)；65-70 min，B液(40%-100%)；70-85 min，B液(100%)。在1260 infinity II HPLC系统上于214 nm波长处检测吸光度值，每2 min收集1次洗脱组分。
1.5.3 质谱分析采用C18 色谱柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)。A液组分：0.1%甲酸水，B液组分：0.1%甲酸-乙腈水溶液(乙腈为80%)。以100%的A液平衡色谱柱，流速：300 nL/min。
采用Q-Exactive Plus质谱仪进行分析。
1.6 主要观察指标质谱鉴定及定量分析采用软件Mascot 2.5和Proteome Discoverer 2.1进行，将原始图谱文件(.raw文件)转化为.mgf文件，通过软件内置的工具提交到MASCOT服务器进行数据库检索。然后再通过Proteome Discoverer将MASCOT服务器上形成的查库文件(.dat文件)传回软件，一级离子质量容差Precursor Mass Tolerance设置为10×10-6，二级离子质量容差Fragment Mass Tolerance 设置为0.05 Da，可变修饰设置为Oxidation (M)，Acetyl (Protein N-term)，固定修饰设置为Carbamidomethyl (C)，Max Missed Cleavages允许的最大漏切位点数设置为2，根据FDR < 0.01的标准对数据进行筛选，获得高度可信的定性结果。
1.7 统计学分析质谱鉴定及定量分析采用软件Mascot 2.5和Proteome Discoverer 2.1进行[13]。将每个蛋白在比较样品对中的所有生物重复定量值均值的比值作为差异倍数。为了判断差异的显著性，将每个蛋白在两个比较对样品中的相对定量值进行了t检验，并计算相应的P值，通常以P值≤0.05作为显著性指标。在此次分析符合表达差异倍数大于1.2倍且P值< 0.05筛选标准的蛋白质视为差异表达蛋白质。当差异倍数≥1.2，同时P值≤0.05 时，蛋白表现为表达量上调，当差异倍数≤ 0.80，同时P值≤ 0.05 时，蛋白表现为表达量下调。通过GO注释、KEGG通路注释和功能富集聚类分析等对鉴定的差异蛋白进行功能注释分类。采用SPSS 21.0进行统计学处理。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法通过临床骨科李章华专家审核。

讨论

基因多态性的研究已发现了一系列非创伤性股骨头坏死相关基因，但其机制仍未完全清晰。该研究基于iTRAQ技术的绝对相对定量蛋白组学对非创伤性股骨头坏死患者血清蛋白样品进行研究，初步筛选非创伤性股骨头坏死相关差异表达蛋白，并找到了对应蛋白质。研究显示长期饮酒、使用激素导致的脂代谢紊乱会引发股骨头缺血坏死[14-23]，血脂异常与股骨头坏死有着重要关系[24-25]，载脂蛋白B对体内脂类转运、代谢以及维持体内恒定的血脂水平起到重要作用。陈卫衡等[26]临床研究发现，股骨头坏死患者中ApoB升高，这与该研究通过差异蛋白质组学研究得出的结果一致。HIRATA等[27]对158例肾移植后出现股骨头坏死患者研究发现，多数患者ApoB基因中有C7623T存在且他们的ApoB/ApoA比值更大。另外，他们认为低分子量型ApoA是肾移植患者发生股骨头坏死的一个危险因素[28]，在该研究中作者也发现股骨头坏死患者的ApoA2表达量偏高。作者还发现患者红斑狼疮发病信号通路活跃，NIGOLIAN等[29]也发现红斑狼疮病患者血清中ApoA含量较高。股骨头坏死是红斑狼疮常见并发症[30]，红斑狼疮患者长期大剂量使用激素，致肝脂肪酶活性下降，产生高脂血症，高脂血症从多个环节影响股骨头微循环导致股骨坏死。脂代谢紊乱易引发非创伤性股骨头坏死[6]，ApoE也可能从炎症反应(免疫细胞的增殖活化)方面参与和影响股骨头缺血坏死，血脂异常参与股骨头坏死的病理和修复过程。ApoE基因多态性已被发现与非创伤性股骨头坏死发生具有相关性[31-32]。补体通路涉及差异蛋白数量较多，其中C4、C7在非创伤性股骨头坏死组中均出现上调，表明非创伤性股骨头坏死可激活人体补体免疫系统。
SUN等[33]研究表明地塞米松通过 p53信号通路诱导激素性股骨头坏死成骨细胞铁死亡。细胞损伤后，增加了p53诱导Bax转录的能力，引发细胞凋亡[34]。研究表明，在骨髓间充质干细胞中下调p53表达能有效抵抗应激诱导的骨髓间充质干细胞凋亡和衰老，提高骨髓间充质干细胞移植对早期激素诱导的股骨头坏死的治疗作用[35]。通过p53信号通路上调胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)致细胞周期停滞、细胞衰老或细胞凋亡，引起非创伤性股骨头坏死。转录因子p53调节无数基因以维持正常的细胞功能[36]，有证据表明p53在心脏中具有调节作用，在很大程度上促进了心血管疾病的发展，特别是扩张型心肌病。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是扩张型心肌病的中枢通路。转化生长因子β信号的转导参与绝大多数细胞过程，如增殖、凋亡、分化和迁移都受到转化生长因子β家族成员的调节，转化生长因子β信号通路与股骨头坏死间存在密切的联系[37]，在不同的组织或生理环境中，细胞对转化生长因子β的反应可能是多种多样的，甚至是相反的[38]。TAO等[39]研究发现非创伤性股骨头坏死标本中存在转化生长因子β1表达明显降低，促进转化生长因子β信号通路转导，能够有效抑制成骨细胞凋亡。WU等[40]报道转化生长因子β在软骨形成和成骨中的重要作用，转化生长因子β信号传导的突变会导致人类广泛的骨骼疾病。转化生长因子超家族成员在骨生长、骨伤口愈合、骨骼肌修复和细胞免疫反应中发挥重要作用，成骨细胞中转化生长因子β信号诱导可能是miR-27a调节类固醇诱导股骨头坏死的潜在机制[41]。其他研究也证实了转化生长因子β通路与股骨头坏死有关[42-44]。这与该研究结果相吻合，说明转化生长因子β参与了股骨头坏死的病变过程。
总之，利用iTRAQ 技术对非创伤性股骨头坏死进行蛋白质组学研究，发现载脂蛋白与非创伤性股骨头坏死发生密切相关，并发现了与非创伤性股骨头坏死相关的活跃信号通路：p53信号通路、转化生长因子β信号通路、扩张型心肌病信号通路。但研究样本量较少，后续将扩大样本量，为深入研究差异蛋白的获得与表达途径以及解析非创伤性股骨头坏死发生的分子机制奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

同位素标记相对和绝对定量评价非创伤性股骨头坏死患者的血清蛋白组学分析

Serum proteomics based on isobaric tags for relative and absolute quantitation technology in patients with nontraumatic osteonecrosis of the femoral head

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