基于尿液代谢组学数据评价不同刮痧方案干预腰椎间盘突出症模型大鼠的效果

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1307

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (23): 3654-3659.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1307

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基于尿液代谢组学数据评价不同刮痧方案干预腰椎间盘突出症模型大鼠的效果

丁欢1，陈丽虹1，陈宇婧1，岳容兆1，杨敏1，徐桂华2

(1南京中医药大学护理学院，江苏省南京市 210046；2南京中医药大学，江苏省南京市 210046)

收稿日期:2019-02-23 出版日期:2019-08-18 发布日期:2019-08-18
通讯作者: 徐桂华，博士，教授，南京中医药大学，江苏省南京市 210046
作者简介:丁欢，女，1995年生，江苏省常州市人，汉族，南京中医药大学护理学院在读硕士，主要从事中医护理研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81473791)，项目负责人：徐桂华；江苏省研究生科研与实践创新计划项目(SJCX18_0444)，项目负责人：陈丽虹

Efficacy of different scraping protocols in the intervention of rat models of lumbar disc herniation based on urine metabolomics

Ding Huan1, Chen Lihong1, Chen Yujing1, Yue Rongzhao1, Yang Min1, Xu Guihua2

(1School of Nursing, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, Jiangsu Province, China; 2Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, Jiangsu Province, China)

Received:2019-02-23 Online:2019-08-18 Published:2019-08-18
Contact: Xu Guihua, MD, Professor, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, Jiangsu Province, China
About author:Ding Huan, Master candidate, School of Nursing, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81473791 (to XGH); the Postgraduate Research and Practice Innovation Program of Jiangsu Province, No. SJCX18_0444 (to CLH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
腰椎间盘突出症：主要是因为腰椎间盘各部分(髓核、纤维环及软骨板)，尤其是髓核，有不同程度的退行
性改变后，在外力因素的作用下，椎间盘的纤维环破裂，髓核组织从破裂之处突出(或脱出)于后方或椎管内，导致相邻脊神经根遭受刺激或压迫，从而产生腰部疼痛，一侧下肢或双下肢麻木、疼痛等一系列临床症状。
刮痧：是以中医经络腧穴理论为指导，通过特制的刮痧器具和相应的手法，蘸取一定的介质，在体表进行反复刮动、摩擦，使皮肤局部出现红色粟粒状，或暗红色出血点等“出痧”变化，从而达到活血透痧的作用。

摘要
背景：刮痧干预腰椎间盘突出症在临床得到广泛应用，利用代谢组学等分析技术对其作用机制进行研究。
目的：使用气相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法，探讨刮痧治疗腰椎间盘突出症大鼠尿液内源性代谢物的变化与其作用机制，并分析不同刮痧方案的疗效差异，以期规范标准化刮痧疗法，为临床应用提供参考和依据。
方法：将48只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、循经出痧组、穴位出痧组、循经不出痧组以及穴位不出痧组，各8只。选用自体髓核移植法复制腰椎间盘突出症大鼠模型，从造模第5天始，用不同刮痧方案干预，隔日1次，共9次。实验于2017年1月获得南京中医药大学实验动物伦理委员会审理批准。
结果与结论：①同造模前相比，刮痧组及造模后的模型组机械痛阈值下降(P < 0.01)；②筛选后共得出15种潜在生物标志物和6条代谢通路。刮痧后3-(3-羟基苯基)丙酸、天冬氨酸和谷氨酰含量降低，甘氨酸、柠檬酸、环腺苷酸含量上升，通过调节丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路以镇痛，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢和三羧酸循环以抗炎；③循经出痧组调节代谢物效果优于其他3组，推测其为治疗最佳刮痧方案。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-9726-4701(徐桂华)

关键词: 尿液代谢组学, 刮痧, 循经取穴, 腰椎间盘突出, 气相色谱-质谱, 组织构建, 代谢通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Scraping has been extensively applied in the treatment of lumbar disc herniation, and the underlying mechanism was explored by metabolomics.
OBJECTIVE: To investigate the changes of endogenous metabolites in urine of rats with lumbar disc herniation and its mechanism of action by gas chromatography-mass spectrometry metabolomics method, and to analyze the difference in efficacy of different scraping schemes, in order to standardize the scraping therapy, and provide reference and basis for clinical application.
METHODS: Forty-eight male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank, model and scraping groups (passing the sputum, acupuncture, sputum, and acupoint groups) (n=8 per group). The rat model of lumbar disc herniation was replicated by autologous nucleus pulposus transplantation. From the 5th day of modeling, the scraping group was intervened with different scraping schemes, once every other day, totally nine times. The study was approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine in January 2017.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with before modeling, the mechanical pain threshold in the scraping and the model groups after modeling was decreased (P < 0.01). (2) A total of 15 potential biomarkers and 6 metabolic pathways were obtained after screening. After scraping, the content of 3-(3-hydroxyphenyl)propionic acid, aspartic acid and glutamic acid decreased, and the content of glycine, citric acid and cyclic adenosine increased, by adjusting alanine, aspartic acid and glutamine. The acid metabolism pathway was anti-inflammatory with analgesic, glycine, serine and threonine metabolism, glyoxylic acid and dicarboxylic acid metabolism, and a tricarboxylic acid cycle. (3) To conclude, the effect of regulating metabolites in the sputum group is better than that in the other three groups, which is presumed to be the best cure plan.

Key words: urine metabolomics, scraping, sputum, lumbar disc herniation, gas chromatography-mass spectrometry, tissue construction, metabolic pathways, the National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R454
R363

丁欢, 陈丽虹, 陈宇婧, 岳容兆, 杨敏, 徐桂华 . 基于尿液代谢组学数据评价不同刮痧方案干预腰椎间盘突出症模型大鼠的效果[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(23): 3654-3659.

Ding Huan, Chen Lihong, Chen Yujing, Yue Rongzhao, Yang Min, Xu Guihua . Efficacy of different scraping protocols in the intervention of rat models of lumbar disc herniation based on urine metabolomics [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(23): 3654-3659.

图/表（结果） 5

2.1 实验大鼠数量分析共纳入48只大鼠无一死亡，状态良好，均纳入结果分析。

2.2 不同刮痧方案对腰椎间盘突出模型大鼠行为的影响干预前各组大鼠均出现焦躁不安、撕扯肢体毛发等表现，刮痧后大鼠症状明显改善，且造模创面无明显炎症反应和瘢痕。

2.3 不同刮痧方案对腰椎间盘突出模型大鼠机械痛阈的影响与造模前相比，造模后大鼠的机械痛阈值明显下降(P < 0.01)，见表1。

2.4 不同刮痧方案对腰椎间盘突出模型大鼠尿液内源性代谢物的影响 GC-MS分析结果显示，模型组、空白组、循经出痧组、穴位出痧组、循经不出痧组和穴位不出痧组的总离子流图见图1，保留时间集中在0-15.33 min。

把各组大鼠尿液代谢物的数据矩阵输入SIMCA-P13.0中构建主成分分析，以此考察模型的可靠程度。此模型参数R²_X=0.759，R²_Y=0.809，Q²=0.245，因为样本量较小，故模型的解释度好但预测性一般。从图2中可以看出各组区分明显，并且没有交叉重叠，表示通过刮痧可影响腰椎间盘突出大鼠尿液中的物质代谢。

根据主成分分析与潜在结构判别分析，得出与疾病联系紧密的异常代谢物(潜在结构判别分析模型中变量投影重要度>1，且单因素方差分析结果P < 0.05)。共发现38个差异内源性代谢物，并根据在线数据库和相关文献，共鉴定出15种潜在差异内源性代谢物及含量见图3：①天冬氨酸：循经出痧组含量最低，穴位不出痧组含量最高；②谷氨酰胺：循经出痧组的谷氨酰胺含量最低；③甘氨酸：除了循经出痧组，其余3个刮痧组均与模型组差异无显著性意义；④3-(3-羟基苯基)丙酸：除穴位不出痧组，其余3组均与模型组差异有显著性意义(P < 0.01)；⑤柠檬酸：刮痧组与模型组相比差异有显著性意义，且循经出痧组柠檬酸含量最高；⑥环腺苷酸：刮痧组与模型组相比差异有显著性意义，且循经出痧组柠檬酸含量最高(P=0.00)。据此推测，循经出痧组的干预效果优于其他刮痧3组。

2.5 不同刮痧方案影响的腰椎间盘突出模型大鼠尿液代谢通路将鉴定出的15个差异代谢物导入Meta Analyst3.0进行代谢通路分析，代谢通路重要值> 0.02的通路则选作潜在靶标路径。共发现6条代谢通路，见图4。按代谢通路重要值从高到低排列，分别为：①丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；②甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；③乙醛酸和二羧酸代谢；④三羧酸循环；⑤原发性胆汁酸生物合成；⑥精氨酸和脯氨酸代谢。其中，与刮痧干预腰椎间盘突出最为相关是前4种。

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引言

腰椎间盘突出是造成患者腰腿痛的最常见的原因^[1]，其发病率逐年增长，并呈复杂化、年轻化的趋势^[2]，严重影响患者生活质量。治疗腰椎间盘突出通常采用手术或保守治疗，其中由于手术治疗存在一定风险且费用较高，因而大多数患者通常选择保守治疗。有研究显示，80%-90%的腰椎间盘突出患者可通过保守治疗得到恢复^[3]。

中医护理技术因其简便易行价廉且安全有效的优势，逐步应用于临床^[4]?其中刮痧作为一项中医护理技术^[5]，具有活血化瘀、疏通经络、调畅气血、解表祛邪等优势^[6]，且腰椎间盘突出在中医理论中属于中医“痹症”范畴^[7]，肾气虚疲、筋脉失养是其发病内因，加之外伤劳损，或外感风寒湿邪，致使经络阻痹，气血不调，不通则痛^[8]。故通过刮痧干预，可有效缓解其症状，是刮痧临床优势病种之一^[9]。

作者所在课题组前期研究已从临床试验与蛋白质组学的角度证实刮痧治疗腰椎间盘突出具有抗炎、提高免疫、即时镇痛的效果^[10-12]。此次实验拟从代谢组学的角度进一步探索刮痧干预腰椎间盘突出的生物代谢物及可能代谢途径，阐述其作用机制，并比较不同刮痧方案干预腰椎间盘突出大鼠代谢物的变化。目前已从腰椎间盘突出大鼠血液代谢物中分析，共找出14种潜在生物标志物和7条代谢通路以说明刮痧可通过抗炎、镇痛的效果来治疗腰椎间盘突出。此次实验拟进一步阐明刮痧干预腰椎间盘突出的代谢组学研究，从腰椎间盘突出大鼠的尿液代谢物中分析，完善临床应用刮痧治疗腰椎间盘突出提供理论基础，并为制定刮痧疗法的规范和标准提供参考?

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计尿液代谢组学分析随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2017年7至12月在南京中医药大学SPF级动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 48只SPF级雄性健康SD大鼠，体质量180-250 g，均购自浙江省实验动物中心，动物合格许可证号：SCXK(浙)2014-0001。实验于2017年1月获得南京中医药大学实验动物伦理委员会审理批准。

1.3.2 实验用主要试剂和仪器正己烷、吡啶购自美国Thermo公司，甲醇与乙腈购自美国Tedia公司，1，2-13C肉蔻酸购自德国Sigma-Alorch公司，甲氧胺盐购自德国Sigma-Aldtich公司，1%三甲基-氯硅烷的N，O-双三甲基三氟乙酰胺购自BSTFA公司，超纯水购自美国Millipore公司，尿素酶购自Sigma-Aldrich公司，刮痧板(水牛角MNJ-3412型)购自派朗公司，高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，Tracel310/TSQ8000 GC-MS仪购自美国Thermo公司，Savant SPD 1010 SpeedVac浓缩仪购自美国Thermo公司，Electric Von Frey test电子Von Frey购自上海玉研科学仪器有限公司，样本均质仪购自美国Dragonlab公司，DMIL型倒置显微镜购自德国LEICA公司，TG-5MS毛细血管色谱柱购自美国Thermo，电子测痛仪(IITC 2390)购自Life Seienee Inc.，代谢笼由南京中医药大学动物实验中心提供。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 48只大鼠随机分为空白组、模型组以及4种刮痧组(循经出痧组、循经不出痧组、穴位出痧组、穴位不出痧组)，每组各8只。模型组及4种刮痧组手术建立腰椎间盘突出模型，模型组不予治疗，刮痧组采用不同刮痧方案干预。

1.4.2 刮痧干预从造模后第5天起，对4组刮痧组使用刮痧板，从上到下依次刮拭。刮痧手法及选穴参考课题组前

期研究^[12-13]。干预方案^[15]：①循经出痧组：后背督脉大椎穴(DU14)[解剖定位：大鼠后正中线上，C₇椎棘下凹陷中]至后海穴(GV1)[解剖定位：大鼠右侧髂后上棘上2 cm，脊柱旁开5 cm处]、大椎穴。右后肢(足太阳膀胱经)，刮至出痧；②穴位出痧组：选取命门穴(DU4)[解剖定位：大鼠后正中线上，L₂棘突下凹陷中]、肾俞(BL23) [解剖定位：在大鼠L₂棘突旁开4.5 cm处]、委中穴(BL40)[解剖定位：大鼠腘横纹中点，当股二头肌腱与半腱肌肌腱的中间]，点刮至出痧；③循经不出痧组：同循经出痧组，但不要求刮至出痧；④穴位不出痧组：同穴位出痧组，但不要求刮至出痧。干预时间：每次干预间隔1 d，3次为1疗程，共3个疗程，治疗9次，即造模后21 d时结束干预。干预手法：①循经刮痧：自上而下按经脉循行走向，每刮一次，长度至少5 cm；②穴位刮痧：以穴位处为圆心点压、按揉，移动半径不超过5 cm；③出痧：每次刮拭力度为4.0-5.0 kg，速度超过30次/min，时间相对较长，刮至皮肤出现紫红或暗紫色血斑、血泡为止；④不出痧：每次刮拭力度为2.0-3.0 kg，速度不超过30次/min，刮痧时间相对较短，至皮肤潮红或出现散在出血点为止。

1.4.3 行为学观察评估者对动物分组情况盲。于每日10：00至12：00观察各组大鼠有无烦躁、食欲下降或者足外翻、步态不稳等行为症状^[16]。

1.4.4 机械缩足反射阈值分别于造模前1 d和造模后的第4天，把各组大鼠放进透明容器里适应0.5 h，用探棒等力均速刺激大鼠右后底中心部，发生抬足或缩足反应^[17]。采用电子测痛仪重复记录3次，每次间隔10 min，结果取平均值。

1.4.5 尿液内源性代谢物分析第9次干预结束禁食不禁水12 h后，采用代谢笼收集每组大鼠24 h尿液，并迅速保存至-80 ℃的冰箱内备用。代谢组学分析前，把解冻后的尿液样本(37 ℃)，离心10 min后(4 ℃，12 000 r/min)，取其上清液200 μL，加入30 μL尿素酶溶液(30 U)后，置于 37 ℃孵育20 min，加入内标有10 μg的甲醇800 μL，涡旋10 min，最后再离心10 min(4 ℃，12 000 r/min)，取上清200 μL，放于离心浓缩仪中挥干2h进样。

色谱条件：石英毛细管色谱柱(0.25 μm/min× 0.25 mm×30 m)，高纯氦气，流速恒定(1.2 L/min)，分流模式(分流比20∶1)，柱前压100 kPa，进样量1 μL，进样口250 ℃。升温程序：0-1.0 min，60 ℃；2.0-5.0 min，50-320 ℃。质谱条件：电离方式EI，碰撞能量70 eV，离子源温度280 ℃，离子传输线温度250 ℃，溶剂延迟时间4 min。扫描方式：全扫描，60-600 m/z(质荷比)。

1.5 主要观察指标 ①大鼠行为；②机械痛阈值；③尿液内源性代谢物。

1.6 统计学分析利用MS-DIAL软件(LECO公司)和NIST数据库(http://srdata.nist.gov/)，对质谱原始数据进行基线校正、峰提取、对齐、计算面积等预处理^[18]。用对矩阵数据集进行总离子流和Pareto scalling归一化，并将得到的数据导入SIMCA-P13.0进行主成分分析、正交偏最小二乘判别分析等多元统计分析。使用MetaboAnalysis 3.6网页版(https:// www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml)和SPSS 22.0(美国IBM SPSS公司)软件确定差异性代谢物(fold change>1.2且单因素方差分析结果P < 0.05时，差异有显著性意义)。最后使用MetaboAnalyst 3.6分析得出相关代谢通路。另外使用SPSS 22.0软件分析造模前后大鼠的机械痛阈值，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

刮痧治疗腰椎间盘突出有镇痛效果，天冬氨酸、谷氨酰胺参加丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。在谷氨酰胺酶的催化下，谷氨酰胺可转成谷氨酸^[19]，作为中枢神经系统的兴奋性神经递质^[20]，谷氨酸和天冬氨酸共同参与神经元通信、神经可塑性以及神经病理异常等生命进程^[21]。它们能促成并维持神经病理性痛痛敏，诱导自发性疼痛和痛觉过敏等神经病理性疼痛的发生^[22]。因此，通过抑制其释放或拮抗其同有关受体的结合，可达到减轻疼痛的目的。模型组大鼠天冬氨酸、谷氨酰胺含量较空白组明显升高(P < 0.05)，提示造模成功。刮痧干预后，尿液中天冬氨酸、谷氨酰胺含量下降，其合成和释放神经病理性痛敏能力减弱。闫丽萍等^[23]采用电针干预神经病理性痛大鼠，并对大鼠氨基酸类递质水平进行研究，发现通过减少兴奋性氨基酸递质的释放，大鼠疼痛改善，与此次研究结论一致，提示刮痧可减轻机体疼痛，且根据代谢通路的代谢通路重要值，说明刮痧对腰椎间盘突出的镇痛效果最为显著。

刮痧治疗腰椎间盘突出能起到抗炎作用。甘氨酸参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。甘氨酸是中枢神经系统的一个抑制性神经递质^[24]，作为全身炎症级联调节剂^[25]，能调节炎症细胞因子转录、减少炎性因子合成、抗氧化应激^[26]。模型组比空白组甘氨酸含量高(P < 0.05)，原因是模型组大鼠受炎症刺激，合成大量炎性因子，激活甘氨酸转录因子表达增加，从而抑制炎症的发生^[15]，侧面表明造模成功。经刮痧干预，尿液中甘氨酸含量增加，机体抗炎效果增强。沈淑洁等^[27]的实验得出，通过提高甘氨酸含量，可增强机体抗氧化应激、减少细胞损伤，从而达到抗炎效果，与此次实验的结果相符，提示刮痧可调节甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，增强机体抗炎反应。

3-(3-羟基苯基)丙酸、柠檬酸、环腺苷酸参与三羧酸循环。3-(3-羟基苯基)丙酸可在3-甲氧基-4-羟基-苯乙醇酸单加氧酶的催化下转化为2，3-二羟基苯丙酸酯，后经水解酶将环－裂变产物转化为琥珀酸，丙酮酸和乙酰辅酶A^[28-29]?作为三羧酸循环的重要组分，柠檬酸被发现是氧化代谢中的中间物质^[30]，可通过减少多形核细胞脱颗粒、减少髓过氧化物酶、弹性蛋白酶、白细胞介素1β和血小板因子4的释放，降低脂质过氧化，降低炎症反应^[31]。环腺苷酸是细胞内重要的生物活性物质，有抗炎及免疫调节作用^[32]。研究证实，三羧酸循环是炎症发展的中间代谢途径^[31]，其在循环过程中，产生一些代谢中间体是炎症信号。此次实验中，同空白组相比，在模型组大鼠中与三羧酸循环相关的3-(3-羟基苯基)丙酸、环腺苷酸含量有不同程度升高，而柠檬酸则出现下降趋势(P < 0.01)，可能与机体糖代谢加速有关。在炎症过程中，释放大量炎性因子，模型组大鼠的能量需求急剧增加，代谢增强，导致过度柠檬酸过度消耗，三羧酸循环受抑制，故模型组中柠檬酸含量降低，而由3-(3-羟基苯基)丙酸转化成的琥珀酸无法及时参与代谢，含量升高。经刮痧干预后，3-(3-羟基苯基)丙酸含量降低、柠檬酸、环腺苷酸含量升高，表明刮痧对腰椎间盘突出有良好的抗炎作用。同时，柠檬酸也参与乙醛酸和二羧酸代谢。乙醛酸和二羧酸代谢与体内的氧化反应有关，可通过影响三羧酸循环关键酶的活性导致三羧酸循环中的各种反应物和产物水平异常^[33]。此次实验中，模型组大鼠柠檬酸含量较空白组大鼠降低(P < 0.01)，能量消耗增加，三羧酸循环加速，各种反应物和产物消耗过度，导致与乙醛酸和二羧酸代谢通路相关的代谢产物含量均有所降低，而刮痧后，柠檬酸等相关生物代谢物回调，起到抗炎作用。

综上所述，通过气相色谱-质谱方法分析得出，刮痧对腰椎间盘突出症模型大鼠相关代谢紊乱有调节作用，具体可通过丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢和三羧酸循环4条途径，下调3-(3-羟基苯基)丙酸、天冬氨酸和谷氨酰含量，升高甘氨酸、柠檬酸、环腺苷酸含量，以达镇痛抗炎效果。另外，循经出痧组对相关代谢物调节作用优于其他3组，推测其临床疗效也较好。建议临床以作者所在课题组的实验研究为理论基础，针对腰椎间盘突出开展循经出痧的刮痧手法，进行多中心大样本的高质量临床试验以期更全面的解释刮痧干预腰椎间盘突出症的疗效。但此次实验同时也存在以下不足：①未对腰椎间盘突出症的4种证型进行分型研究；②尚未对一次刮拭的长短、次数进行规范性探究；③尚未对刮痧全程的总时间进行研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于尿液代谢组学数据评价不同刮痧方案干预腰椎间盘突出症模型大鼠的效果

Efficacy of different scraping protocols in the intervention of rat models of lumbar disc herniation based on urine metabolomics

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