金天格胶囊治疗维甲酸诱导骨质疏松大鼠的蛋白质组学分析

doi:10.12307/2023.823

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5634-5641.doi: 10.12307/2023.823

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金天格胶囊治疗维甲酸诱导骨质疏松大鼠的蛋白质组学分析

张驰，章晓云，柴源，陈锋

广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2022-10-08 接受日期:2022-11-16 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-02
通讯作者: 章晓云，博士，副主任医师，硕士生导师，广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011
作者简介:张驰，男，1993年生，湖北省武汉市人，汉族，广西中医药大学在读博士，主要从事脊柱疾病的中医药防治研究。
基金资助:
金天格中青年科研培养基金(项目61)，项目负责人：章晓云；广西自然科学基金(2021GXNSFAA220089)，项目负责人：陈锋；广西自然科学基金(2020GXNSFBA159053)，项目负责人：章晓云；广西中医药适宜技术开发与推广项目(GZSY22-36)，项目负责人：章晓云；广西中医药大学2021年校级青年创新研究团队项目 (2021TD001)，项目负责人：章晓云；广西研究生教育创新计划资助项目(YCBZ2021075)，项目负责人：张驰；黄有荣桂派中医大师培养项目(桂中医药科教发[2022]6号)，项目参与人：章晓云

Proteomic study of Jintiange capsule in the treatment of retinoic acid-induced osteoporosis rats

Zhang Chi, Zhang Xiaoyun, Chai Yuan, Chen Feng

Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-10-08 Accepted:2022-11-16 Online:2023-12-18 Published:2023-06-02
Contact: Zhang Xiaoyun, MD, Associate chief physician, Master's supervisor, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang Chi, MD candidate, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Jintiange Scientific Research and Training Fund for Middle-aged and Young People, No. Project 61 (to ZXY); the Natural Science Foundation of Guangxi, Nos. 2021GXNSFAA220089 (to CF) and 2020GXNSFBA159053 (to ZXY); The Development and Promotion Project of Chinese Medicine Appropriate Technology in Guangxi, No. GZSY22-36 (to ZXY); 2021 School-level Youth Innovation Research Team Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2021TD001 (to ZXY); Innovation Project of Guangxi Graduate Education, No. YCBZ2021075 (to ZC); Huang Yourong Guipai TCM Master Training Project, No. GZYKJF [2022]6 (to ZXY [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

定量蛋白质组学：是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量的科学，可用于筛选和寻找任何因素引起的样本之间的差异表达蛋白，结合生物信息学揭示细胞生理病理功能，同时也可对某些关键蛋白进行定性和定量分析。
骨质疏松症：是一种以骨转换增加、骨量减少和骨组织微结构损坏为特征的代谢性骨病，患者因骨脆性增加而易生骨折，可发生于任何年龄，但多见于绝经后女性和老年男性人群。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类，原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症和特发性骨质疏松症。绝经后骨质疏松症一般发生在女性绝经后5-10年内，老年性骨质疏松症一般指70岁以后发生的骨质疏松，特发性骨质疏松症主要发生在青少年人群。继发性骨质疏松症指由任何影响骨代谢的疾病、药物及其他明确病因导致的骨质疏松。

背景：金天格胶囊抗原发性骨质疏松症的疗效已得到临床研究证据证实和临床应用指南推荐，但其抗继发性骨质疏松症的作用及靶点仍未明确。
目的：探讨金天格胶囊治疗继发性骨质疏松症的药效靶点与作用机制。
方法：将24只雌性SD大鼠随机分为4组，每组6只：空白组不做任何处理；模型组通过灌胃给予维甲酸建立骨质疏松模型，造模14 d后灌胃给予生理盐水；金天格组和阳性对照组通过灌胃给予维甲酸建立骨质疏松模型，造模14 d后分别灌胃给予金天格、阿仑膦酸钠，各组连续给药14 d。给药结束后，取股骨做micro-CT扫描和串联质谱标签定量蛋白质组学，采用生物信息学分析差异蛋白涉及的功能、信号通路及蛋白互作关系，并筛选核心蛋白。

结果与结论：①与空白组相比，模型组大鼠股骨骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量显著降低(P < 0.05)，骨小梁分离度增高(P < 0.05)；与模型组相比，阳性对照组与金天格组大鼠股骨骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量增高(P < 0.05)，骨小梁分离度降低(P < 0.05)；②共筛选出模型组与空白组间差异蛋白2 749个，涉及ATP代谢过程、缺氧反应、细胞铁离子稳态等生物学进程，铁死亡、低氧诱导因子1信号通路、脂肪酸代谢等信号通路；金天格组与模型组间差异蛋白773个，涉及骨化、过氧化氢生物合成、缺氧反应等生物学进程，低氧诱导因子1信号通路、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等信号通路；③共得到金天格胶囊治疗骨质疏松症的靶点453个，包含转铁蛋白、核糖体蛋白S14、核糖体蛋白S21等49个一级核心蛋白，核糖体蛋白S6、核糖体蛋白S20、核糖体蛋白S28等15个二级核心蛋白；④结果显示，金天格胶囊可能通过下调长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶、转铁蛋白、CREB结合蛋白抑制脂质过氧化和铁蓄积而负调控铁死亡，改善骨质疏松症大鼠的骨量减少和骨小梁微结构破坏。

https://orcid.org/0000-0002-4143-170X (张驰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 金天格胶囊, 骨质疏松症, 蛋白质组学, 维甲酸, 铁死亡

Abstract: BACKGROUND: The therapeutic effect of Jintiange capsule on primary osteoporosis has been confirmed by clinical research evidence and recommended by clinical application guidelines, but its effects and targets against secondary osteoporosis remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic target and mechanism of Jintiange capsule in the treatment of secondary osteoporosis.
METHODS: Twenty-four female Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=6 per group): blank group (with no treatment), model group, Jintiange capsule group, and positive control group. Animal models of osteoporosis were prepared in the latter three groups by intragastric administration of retinoic acid. Fourteen days after modeling, the model group was intragastrically given normal saline, while the Jintiange capsule and positive control groups were given Jintiange capsule and alendronate sodium, respectively, for 14 days. After treatment, the femurs were taken for micro-CT scanning and tandem mass tags quantitative proteomics. Bioinformatics was used to analyze the function, signal pathway and protein interaction of the differential proteins and to screen the core proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank group, bone volume fraction, trabecular thickness and trabecular number of the femur were significantly decreased (P < 0.05) and trabecular separation was significantly increased (P < 0.05) in the model group. Compared with the model group, bone volume fraction, trabecular thickness and trabecular number of the femur were increased (P < 0.05) and trabecular separation was decreased (P < 0.05) in the positive control and Jintiange capsule groups. A total of 2 749 differential proteins were screened between the model group and the blank group, involved in multiple biological processes such as ATP metabolism, hypoxia response, and cellular iron homeostasis as well as signal pathways such as ferroptosis, hypoxia-inducible factor 1 signal pathway, and fatty acid metabolism. A total of 773 differential proteins were screened between Jintiange capsule group and model group, involved in biological processes such as ossification, hydrogen peroxide biosynthesis, and hypoxia reaction as well as signal pathways such as hypoxia-inducible factor 1 signal pathway, fatty acid metabolism, and oxidative phosphorylation. A total of 453 targets of Jintiange capsule for treating osteoporosis were identified, including 49 primary core proteins, such as transferrin, ribosomal protein S14, and ribosomal protein S21, and 15 secondary core proteins, such as ribosomal protein S6, ribosomal protein S20, and ribosomal protein S2. These findings indicate that Jintiange capsule may negatively regulate ferroptosis by down-regulating long chain lipoacyl-CoA synthase 1, arachidonic acid-15- lipooxygenase, transferrin, and CREB binding protein to inhibit lipid peroxidation and iron accumulation, thereby modifying osteopenia and trabecular bone microstructure damage in osteoporotic rats.

Key words: Jintiange capsule, osteoporosis, proteomics, retinoic acid, ferroptosis

中图分类号:

张驰, 章晓云, 柴源, 陈锋. 金天格胶囊治疗维甲酸诱导骨质疏松大鼠的蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5634-5641.

Zhang Chi, Zhang Xiaoyun, Chai Yuan, Chen Feng. Proteomic study of Jintiange capsule in the treatment of retinoic acid-induced osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5634-5641.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析 36只大鼠全部进入结果分析。
2.2 成功复制维甲酸诱导骨质疏松症大鼠模型造模期满后，股骨micro-CT扫描结果表明，与空白组相比，维甲酸诱导组大鼠股骨远端松质区骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量显著降低(P < 0.001)，骨小梁分离度显著升高(P < 0.001)，见图1A、表1。说明维甲酸诱导后大鼠股骨远端骨量减少，骨小梁厚度和数目减少，骨小梁间隙增大，推测维甲酸诱导组大鼠已形成骨质疏松症模型。

2.3 金天格胶囊对骨质疏松症大鼠骨小梁结构的影响干预期满后，股骨micro-CT扫描结果表明，各组的骨体积分数(P < 0.001)、骨小梁厚度(P=0.011)、骨小梁分离度(P < 0.001)和骨小梁数量(P < 0.001)均存在显著差异，见图1B、表2。进一步两两比较显示，与空白组相比，模型组骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量显著降低(P < 0.001，P=0.011，P < 0.001)，骨小梁分离度显著增高(P < 0.001)；与模型组相比，阳性对照组骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量显著增高(P < 0.001，P=0.002，P < 0.001)，骨小梁分离度显著降低(P < 0.001)；与模型组相比，金天格组骨体积积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量显著增高(P < 0.001，P=0.009，P < 0.001)，骨小梁分离度显著降低(P < 0.001)；与阳性对照组相比，金天格组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁分离度和骨小梁数量均无明显变化(P > 0.05)。说明采用金天格胶囊和阿仑膦酸钠片均能够改善骨质疏松症大鼠的骨量流失，增加骨小梁厚度和数目，减少骨小梁间隙，两种药物作用效果无差异。

2.4 骨质疏松症的疾病靶点与金天格胶囊的药效靶点根据筛选标准获得模型组与空白组之间差异蛋白2 749个，其中上调蛋白1 395个，下调蛋白1 354个(图2A)，它们可作为骨质疏松症的疾病靶点；获得金天格组与模型组之间差异蛋白773个，其中上调蛋白499个，下调蛋白274个(图2B)，它们可作为金天格胶囊的药效靶点(表3)。

2.5 GO功能与KEGG通路富集结果将模型组与空白组之间差异蛋白以及金天格组与模型组之间差异蛋白分别导入DAVID数据库。富集结果表明(图3)，模型组与空白组之间差异蛋白涉及ATP代谢过程、骨化、缺氧反应、细胞铁离子稳态、成骨细胞分化的调节等382条生物学进程；线粒体、吞噬囊泡、胞质核糖体、黏着斑等204条细胞组分；ATP酶活性、谷胱甘肽转移酶活性、氧转运蛋白活性、L-乳酸脱氢酶活性等153条分子功能(图3A)；铁死亡、脂肪酸代谢、低氧诱导因子1信号通路、氧化磷酸化等82条信号通路(图3C)。金天格组与模型组之间差异蛋白涉及骨化、过氧化氢生物合成、缺氧反应、酰基辅酶A脱氢酶催化脂肪酸β氧化等91条生物学进程；线粒体、外泌体、胞质囊泡、核糖体等57条细胞组分；谷胱甘肽转移酶活性、ATP酶活性、转录辅因子活性等32条分子功能(图3B)；低氧诱导因子1信号通路、脂肪酸代谢、氧化磷酸化、细胞外基质受体相互作用等24条信号通路(图3D)。其中，关于铁死亡信号通路，模型组的长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶、溶血卵磷脂酰基转移酶3、转铁蛋白受体、前列腺六次跨膜蛋白3表达比空白组高，转铁蛋白、铁蛋白重链1、铁蛋白轻链1表达比空白组低(图4A)；而金天格组的长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶、转铁蛋白表达比模型组低(图4B)。

关于低氧诱导因子1信号通路，模型组的核糖体蛋白S6、转铁蛋白的表达比空白组低，转铁蛋白受体蛋白表达比空白组高(图5A)；而金天格组的核糖体蛋白S6蛋白表达比模型组高，转铁蛋白、CREB结合蛋白表达比模型组低(图5B)。上述蛋白可能是金天格胶囊通过铁死亡、低氧诱导因子1信号通路发挥抗骨质疏松症作用的靶点。

2.6 金天格胶囊抗骨质疏松症的核心靶点将此次研究中骨质疏松症的2 749个疾病靶点与金天格胶囊的773个药效靶点取交集，得到金天格胶囊抗骨质疏松症的治疗靶点共453个。上述治疗靶点经Uniprot数据库校对、STRING数据库分析后，得到由328个蛋白、1 161条互作关系构成的总网络(图6A)；经第1次筛选后得到由64个蛋白、361条互作关系构成的一级子网络(图6B)；经第2次筛选后得到由15个蛋白、80条互作关系构成的二级子网络(图6C)。其中，蛋白互作网络中有转铁蛋白、核糖体蛋白S14、核糖体蛋白S21等49个一级核心蛋白，核糖体蛋白S6、核糖体蛋白S20、核糖体蛋白S28等15个核心程度更高的二级核心蛋白，它们可能是金天格胶囊发挥抗骨质疏松症作用的重要靶点。

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引言

骨质疏松症是一种以骨转换增加和骨量减少为特征的骨科常见病。根据一项临床流行病学研究预测，从2020-2050年，中国骨质疏松症人群总体增长率为104.70%，超过50岁人群骨质疏松症标准化患病率将从2020年的15.77%上升至2050年的23.43%[1]，说明中国骨质疏松症人群数量可能在未来大幅攀升。骨质疏松症最严重的并发症是骨折，而老年人骨折后较难恢复，临床并发症多，且手术耐受性差、风险高，极大地影响了老年人群的健康。因此，强化推进骨质疏松症的防治研究刻不容缓。
中医学将骨质疏松症归纳为“骨痿”，《医学衷中参西录》记载用振颓汤治痿废：“骨痿废者，加鹿角胶、虎骨胶各二钱”，目的是取其“以骨补骨”的作用。其中，虎骨的药用研究历史悠久，最早起源于汉晋时期，发展至明代达到顶峰；但由于持续猎杀，导致虎数量锐减，现已成为濒危野生动物，虎骨被禁用，故目前药用选择虎骨代用品[2]。金天格胶囊的成分为人工虎骨粉，其抗原发性骨质疏松症作用已得到高质量的多中心临床研究证据证实[3]，并已得到临床应用指南推荐[4]，目前已有网络药理学研究初步预测金天格胶囊抗原发性骨质疏松症的潜在靶点[5]。但金天格胶囊抗继发性骨质疏松症的作用及机制仍有待进一步探索。随着蛋白质组学技术的进步与推广，目前该技术已被应用于抗骨质疏松症的生物标志物和药效靶点研究[6-7]。因此，实验拟通过维甲酸诱导继发性骨质疏松症大鼠模型，通过串联质谱标签定量蛋白质组学分析骨质疏松症的疾病靶点及金天格胶囊的药效靶点，为研究金天格胶囊抗骨质疏松症机制提供方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，应用独立样本t检验比较两组数据之间的差异，应用单因素方差分析比较多组数据之间的差异。
1.2 时间及地点实验于2022年4-6月在广西中医药科学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄雌性SD大鼠36只，SPF级，体质量(210±10) g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。在广西中医药科学实验中心开展实验，使用许可证号：SYXK(桂)2019-0001。实验动物房环境设定温度20-22 ℃，湿度50%-65%，昼夜光照周期为12 h光照、12 h黑暗，大鼠饲养密度为每笼两三只，自由饮水进食，将所有大鼠适应性饲养至3月龄后开始实验。
1.3.2 实验主要药品、试剂与仪器金天格胶囊(金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂，国药准字Z20030080)，处方组成为马鹿骨、梅花鹿骨、猪骨、羊骨；阿仑膦酸钠片(北京福元医药股份有限公司，国药准字H20059029)；维甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度98%)；40 g/L多聚甲醛组织固定液(BIOSHARP)；异氟烷(瑞普(天津)生物药业有限公司)；小动物麻醉机(美国Harvard Apparatus)；TMT标记试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；小动物micro-CT(型号Skyscan-1176，德国Bruker公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 实验分组与干预将36只大鼠随机编入2组，其中空白组12只，维甲酸诱导组24只。维甲酸诱导组大鼠接受维甲酸诱导法造模[8]，灌胃给予维甲酸70 mg/(kg·d)，空白组灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药2周。造模2周后，分别从空白组及维甲酸诱导组中随机抽取6只大鼠，麻醉后处死取股骨做模型鉴定。将维甲酸诱导组剩余18只大鼠随机分为模型组、阳性对照组和金天格组，每组6只，按照临床等效剂量，金天格组灌胃给予大鼠324 mg/(kg·d)金天格胶囊，阳性对照组灌胃给予0.9 mg/(kg·d)阿仑膦酸钠，模型组和空白组予等体积(10 mL/kg)生理盐水灌胃，1次/d，连续干预2周。

1.4.2 样本取材干预期结束后，采用异氟烷吸入式麻醉大鼠，麻醉机设定异氟烷起始输入浓度2%，3 min后逐渐增加浓度至5%，观察大鼠姿态确认麻醉诱导完成后，改为维持浓度2.5%。处死大鼠后解剖分离双侧股骨，左侧股骨常温存于40 g/L多聚甲醛，用作micro-CT扫描；右侧股骨-80 ℃冻存，用作蛋白质组学检测。
1.4.3 micro-CT扫描分析大鼠离体股骨采用小动物micro-CT检测大鼠左侧股骨远端，每例样本均选取骨骺线以内相同位置松质骨作为感兴趣区域。设定扫描像素18 μm，采用N-Recon软件执行三维重构，采用CT-AN软件分析股骨远端松质区参数，分别为骨体积分数、骨小梁分离度、骨小梁厚度、骨小梁数量。
1.4.4 蛋白的提取、标记、质谱检测、鉴定与定量委托深圳华大基因科技服务有限公司执行串联质谱标签定量蛋白质组学系列分析，检测空白组、模型组和金天格组大鼠右侧股骨样本各3例。取股骨样本研磨裂解、离心后取上清液，采用Bradford法定量计算蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白条带。经确认各组样本的蛋白总量≥100 μg，胶图完整性、重复性良好，样本质量合格。每组取100 μg蛋白样品，采用Trypsin(1∶20)酶解，低速离心1 min，37 ℃孵育4 h，随后进一步除盐、冷冻抽干。依照串联质谱标签标记试剂盒说明书进行肽段标记，100 μg肽段与41 μL 串联质谱标签试剂快速混匀后振荡离心，室温放置2 h。采用岛津LC-20AD液相系统为每份样本做液相分离，结合色谱洗脱峰图获得20个组分，冷冻抽干，复溶、离心后取上清进样，采用Thermo公司EasynLC 1200进行分离。随后采用串联质谱仪Oritrap Exploris 480执行质谱分析，设置离子源2 100 V电压。一级质谱扫描范围350-1 600 m/z，分辨率为60 000；二级质谱起始固定为100 m/z，分辨率为15 000。离子碎裂模式为HCD，在Orbitrap中检测碎片离子，动态排除时间设置为30 s。设定AGC为一级1E6、二级1E5。
原始数据采用Mascot软件比对Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)鉴定蛋白，物种设置为Rattus_norvegicus。采用IQuant软件分析蛋白质串联质谱标签定量值[9]，以FDR≤0.01在肽段水平和蛋白水平进行2次筛选，以控制显著差异蛋白的假阳性率[10]。
1.4.5 差异蛋白分析登陆华大基因Dr.Tom平台(https://biosys.bgi.com/#/main)获取各组大鼠股骨差异蛋白信息，筛选条件为倍数变化> 1.2或< 0.833，且Q < 0.05。采用TBtools 1.098软件绘制差异蛋白火山图[11]。
1.4.6 功能与通路富集分析通过DAVID 2021数据库(https://david.ncifcrf.gov/)分析差异蛋白涉及的京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路和基因本体(Gene Ontology，GO)功能，以P < 0.05作为富集结果的筛选标准[12]。分别采用GraphPad Prism 8.0.1软件绘制功能富集分析图，OmicShare云平台工具(https://www.omicshare.com/tools/)制作通路富集气泡图，KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)绘制带有颜色分类标签的信号通路图[13]。
1.4.7 蛋白互作网络与核心蛋白的筛选蛋白数据集经 Uniprot数据库校对分析后，通过STRING 11.5数据库(https://cn.string-db.org/)以互作得分≥0.4筛选蛋白互作关系[14]，并采用Cytoscape 3.7.0软件的CytoNCA插件分析蛋白节点的6个参数[15]，分别为Degree Centrality、Closeness Centrality、 Betweenness Centrality、Local Average Connectivity-based method、Eigenvector Centrality和Network Centrality，将上述参数的中位值作为筛选指标，采集6个参数指标同时高于中位值的蛋白构建子网络[16]，通过2次筛选得到一级和二级核心蛋白。
1.5 主要观察指标各组大鼠股骨远端松质区域micro-CT各参数水平，模型组与空白组之间差异蛋白，金天格组与模型组之间差异蛋白，差异蛋白富集的生物学功能、信号通路与互作关系。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0软件分析数据。若数据同时满足正态性和方差齐性，应用独立样本t检验比较两组数据之间的差异，应用单因素方差分析比较多组数据之间的差异，并进一步采用最小显著差异法执行组间多重比较。若数据不满足正态性或方差齐性，则应用非参数检验比较组间差异。若P < 0.05则判定为差异有显著性意义。该文统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

临床研究表明，骨质疏松症椎体压缩性骨折患者在经皮球囊椎体后凸成形术后口服金天格胶囊，能够提升骨密度，增加血清骨钙素水平、降低血清Ⅰ型胶原C末端肽水平[17]，但其作用机制仍有待进一步研究。由于临床上骨质疏松症的骨样本较难获取，故有必要开展动物实验研究金天格胶囊抗骨质疏松症的作用靶点与机制。由药物影响骨代谢所诱导的骨质疏松症属于继发性骨质疏松症，维甲酸诱导的继发性骨质疏松症已得到文献证实，其造模效果稳定且起效周期短[8]。因此，此次实验采用维甲酸诱导骨质疏松症大鼠模型，并通过micro-CT抽样验证造模结果，各参数指标证实70 mg/(kg·d)维甲酸灌胃干预14 d能够诱导大鼠骨量减少及骨小梁微结构破坏，故实验成功复制了骨质疏松症大鼠模型。随后进一步平行分组给药干预，发现金天格胶囊能够改善骨质疏松症大鼠的骨量减少和骨小梁微结构破坏，且该效应与阳性对照药物阿仑膦酸钠相当。在证实金天格胶囊能够有效治疗骨质疏松症大鼠模型的基础上，采用蛋白质组学技术全面分析了金天格胶囊抗骨质疏松症的治疗靶点。实验参考了林若慧等[18]学者的研究思路，将模型组与空白组之间的差异蛋白作为骨质疏松症疾病靶点，将金天格组与模型组之间的差异蛋白作为金天格胶囊的药效靶点，分别研究上述两组靶点的功能与信号通路；然后将上述两组靶点取交集，得到金天格胶囊治疗骨质疏松症的靶点共453个，约占药效靶点的58.6%，并进一步分析治疗靶点的蛋白互作关系，筛选核心蛋白。该思路极大地缩小了蛋白的筛选范围，一定程度上减少了非骨质疏松症相关蛋白对靶点筛选过程的干扰。富集结果反映金天格胶囊治疗骨质疏松症的作用机制中，铁死亡和低氧诱导因子1信号通路占有重要地位。
其中，脂质过氧化是铁死亡的一个关键因素，多不饱和脂肪酸易发生过氧化，破坏脂质双层的稳定性，导致细胞膜解体[19]。细胞膜中多不饱和脂肪酸的合成和改造依赖长链脂酰辅酶A合成酶4和溶血卵磷脂酰基转移酶3。长链脂酰辅酶A合成酶4催化游离多不饱和脂肪酸与CoA结合，形成多不饱和脂肪酸-CoA，然后在溶血卵磷脂酰基转移酶3的催化下生成多不饱和脂肪酸-PE，并由花生四烯酸-15-脂加氧酶介导脂质过氧化产生多不饱和脂肪酸-PE-OOH；当多不饱和脂肪酸-PE-OOH增多、积累，与二价铁离子作用后发生芬顿反应，产生活性氧，推动铁死亡的进程[20-21]。CHEN等[22]的研究表明，去势雌性小鼠骨质疏松症模型中长链脂酰辅酶A合成酶1转录水平增高，且长链脂酰辅酶A合成酶1在骨髓间充质干细胞成脂分化早期亦呈现异常高表达。KLEIN等[23]的研究证实，花生四烯酸-15-脂加氧酶是小鼠峰值骨密度的负调节因子，抑制花生四烯酸-15-脂加氧酶能够改善去势雌性大鼠骨质疏松症模型的骨密度和骨强度，花生四烯酸-15-脂加氧酶可作为治疗骨质疏松症的靶点。此次实验结果显示，模型组的长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶、溶血卵磷脂酰基转移酶3蛋白表达高于空白组，说明骨质疏松症状态下脂质过氧化进程被推进，可能会造成一定程度的多不饱和脂肪酸-PE-OOH积累，从而促进铁死亡。而金天格组的长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶蛋白表达低于模型组，且GO富集分析中长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶蛋白富集于脂质氧化、脂质生物合成过程，细胞组分主要在细胞质和脂质颗粒。故金天格胶囊纠正了骨质疏松症状态下长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶蛋白的异常高表达，可能通过下调长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶蛋白表达抑制脂质过氧化水平，从而负调控铁死亡进程。
此外，铁离子代谢也是影响铁死亡进程的关键因素。体外研究表明，铁过载会抑制成骨细胞分化和矿化，并诱导成骨细胞铁死亡；体内研究表明，铁过载小鼠骨密度降低、骨小梁微结构破坏、骨生长减缓、血清骨形成标志物水平降低，而铁死亡抑制剂能够挽救铁过载引起的上述骨质疏松症相关表型[24]。三价铁离子与转铁蛋白形成复合物后通过转铁蛋白受体进入细胞，前列腺六次跨膜蛋白3将三价铁离子还原为二价铁离子，转铁蛋白-二价铁离子复合物被金属转运体脱去蛋白后释放入不稳定铁池，积累的二价铁离子能够与多不饱和脂肪酸-PE-OOH发生芬顿反应，促进铁死亡的进程。转铁蛋白介导的铁吸收促进了铁死亡，而促进转铁蛋白降解能够抑制细胞内铁积累和随后的氧化损伤介导的铁死亡[25]。SHANG等[26]研究发现，蛋清卵转铁蛋白通过抑制核因子κB受体激活因子配体诱导的核因子κB和MAPK信号通路，抑制破骨细胞分化和钙磷吸收能力，并诱导成熟破骨细胞凋亡，可用于防治骨质疏松症。铁蛋白是一个由铁蛋白重链1和铁蛋白轻链1组成的铁储存蛋白复合物，它能够作为一个强大的缓冲器维持铁代谢平衡[27]。此次实验结果表明，模型组的铁蛋白重链1、铁蛋白轻链1和转铁蛋白表达低于空白组，转铁蛋白受体、前列腺六次跨膜蛋白3表达高于空白组，说明铁储存水平下调，铁摄入水平可能上调或下调；而金天格组的转铁蛋白表达低于模型组，铁蛋白重链1、铁蛋白轻链1蛋白表达与模型组无显著差异，故金天格胶囊未影响铁储存水平，主要通过下调转铁蛋白表达降低铁摄入水平，从而负调控铁死亡进程。
骨骼与骨髓腔微环境为天然低氧浓度状态，为低氧诱导因子1信号通路的激活提供了条件[28]。最新研究表明，低氧诱导因子1α特异性抑制剂能够通过铁自噬诱导破骨细胞铁死亡，从而改善去势雌性骨质疏松症小鼠模型的骨丢失，可能作为抗骨质疏松症的一种替代疗法[29]。在低氧状态下脯氨酸羟化酶活性被抑制，脯氨酸羟化酶羟基化低氧诱导因子1α的进程受阻，导致细胞内低氧诱导因子1α积累并与低氧诱导因子1β结合后入核，在募集E1A结合蛋白P300和CREB结合蛋白后启动下游基因的转录[30]。该过程在常氧状态下会被中断，是由于低氧诱导因子1α被羟基化后进入泛素化降解流程，从而导致低氧诱导因子1α入核水平减少[31]。BEI等[32]采用三碘甲状腺素成功诱导甲亢骨质疏松症大鼠模型，micro-CT检测结果表明大鼠股骨骨密度降低、骨量减少，且骨组织中CREB结合蛋白表达增高，可能影响下游目标蛋白的乙酰化或转录。此次实验发现，金天格组的CREB结合蛋白、转铁蛋白表达低于模型组，而CREB结合蛋白、转铁蛋白均富集在低氧诱导因子1信号通路上，转铁蛋白是低氧诱导因子1信号通路的下游基因，故金天格胶囊可能通过下调CREB结合蛋白从而影响转铁蛋白的转录，并进一步负调控铁代谢进程。虽然金天格组的核糖体蛋白S6蛋白表达高于模型组，且该蛋白为蛋白互作网络中的二级核心蛋白，但其未能够促进低氧诱导因子1α的表达水平，故金天格胶囊是否通过低氧诱导因子1信号通路发挥抗骨质疏松症的作用仍有待进一步实验论证。
综上所述，实验在micro-CT证实金天格胶囊抗骨质疏松症作用的基础上，通过串联质谱标签定量蛋白质组学分析骨质疏松症的疾病靶点和金天格胶囊抗骨质疏松症的药效靶点，初步发现金天格胶囊可能通过下调长链脂酰辅酶A合成酶1、花生四烯酸-15-脂加氧酶、转铁蛋白、CREB结合蛋白抑制脂质过氧化和铁蓄积而负调控铁死亡进程，从而改善骨质疏松症大鼠的骨量减少和骨小梁微结构破坏。实验结果为探索人工虎骨粉治疗骨质疏松症的作用机制提供了实验依据和研究方向，同时对骨质疏松症的病机、新靶点开发和临床应用具有指导价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

金天格胶囊治疗维甲酸诱导骨质疏松大鼠的蛋白质组学分析

Proteomic study of Jintiange capsule in the treatment of retinoic acid-induced osteoporosis rats

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