不同部位脂肪源性干细胞的生物学特性比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：大鼠不同部位来源的脂肪源性干细胞在体外培养时的特性是否存在差异目前尚无定论。
目的：比较同一只大鼠不同部位来源的脂肪源性干细胞在体外培养时的生长特性和成脂诱导分化能力的差异。
方法：无菌操作下取F344大鼠腹股沟及腹腔大网膜脂肪组织各5 mL，Ⅰ型胶原酶酶解法分离出脂肪源性干细胞，细胞计数后进行体外培养，观察其形态特征和生长状态，MTT法测定不同部位细胞的倍增时间。取不同部位来源的第2代脂肪源性干细胞进行成脂诱导，诱导14 d进行油红O染色，观察不同部位来源的脂肪源性干细胞的成脂分化能力。
结果与结论：在同一只大鼠内脏大网膜脂肪获得的脂肪源性干细胞数目为(281±10)×107 L-1，明显多于腹股沟皮下脂肪的(85±5)×107 L-1(P < 0.01)。从内脏大网膜脂肪与腹股沟皮下脂肪获得的脂肪源性干细胞分别于第5，6天进入指数增长期；第9，10天到达平台期；倍增时间为50 h和60 h左右。传代后的细胞生长分化活跃，呈成纤维细胞样，成脂诱导后，大网膜组织来源的脂肪源性干细胞的成脂诱导分化率明显高于腹股沟组织来源的脂肪源性干细胞[(38.90±2.86)%，(35.30±3.29)%，P < 0.01]。可见同一只大鼠不同部位脂肪组织分离得到的脂肪源性干细胞数目不同，体外成脂诱导分化能力亦存在差异。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 腹股沟, 腹腔大网膜, 脂肪组织, 不同部位, 差异, 生物学特性, 大鼠, 细胞分化, 种子细胞, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Whether the differences exist between adipose-derived stem cells isolated from different parts of rats when cultured in vitro has been poorly understood.
OBJECTIVE: To compare the growth characteristics and adipogenic ability of adipose-derived stem cells isolated from different parts of rats.
METHODS: Freshly isolated adipose-derived stem cells were obtained from 5 mL inguinal groove and greater omentum adipose tissue of F344 rats using type Ⅰ collagenase digestion method. Then, adipose-derived stem cells were counted and cultured in vitro. Morphological and growth characteristics of adipose-derived stem cells derived from the two sites were observed. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay was utilized to examine the doubling time of adipose-derived stem cells from different parts. The passage 2 adipose-derived stem cells were induced adipogenically. Fourteen days after being induced, the differentiated cells were stained with oil red O and the positive cells were counted. The adipogenic differentiation ability of adipose-derived stem cells from the different parts was assessed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The number of adipose-derived stem cells from the greater omentum fat tissue in the same group was (281±10)×107/L, which was significantly higher than that from the inguinal groove fat tissue [(85±10)×107/L] (P < 0.01). Adipose-derived stem cells from the greater omentum and inguinal groove fat tissue achieved the exponential growth period on days 5 and 6, respectively, and achieved the platform period on days 9 and 10, respectively. The corresponding doubling time was 50 hours and 60 hours, respectively. After being passaged, adipose-derived stem cells grew in fibroblast-like shape actively. The adipogenic differentiation rate of adipose-derived stem cells from the greater omentum fat tissue was higher than that from the inguinal groove fat tissue [(38.90±2.86)% vs. (35.30±3.29)%, P < 0.01]. This shows that the number and the adipogenic differentiation ability of adipose-derived stem cells from different parts of the same F344 rat are different.

Key words: stem cells, adipose-derived stem cells, inguinal groove, greater omentum, adipose tissue, different parts, difference, biological characteristics, rats, cell differentiation, seed cells, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验共纳入20只大鼠，均进入结果分析。
2.2 不同部位脂肪组织获得的脂肪源性干细胞的数目和形态在同一只大鼠内脏大网膜脂肪获得的脂肪源性干细胞数目为(281±10)×107 L-1，腹股沟皮下脂肪获得的脂肪源性干细胞数目为(85±5)×107 L-1，配对t 检验发现二者比较差异有显著性意义(P < 0.01)。
脂肪组织初分离细胞接种6 h后，细胞开始贴壁；24 h完全贴壁。初为类圆形，细胞大小不等，核质比较大，细胞核几乎充满胞质。48 h内细胞生长处于停滞状态，细胞形态呈小的梭形，色深。48 h后，逐渐伸展开，大多数细胞为长梭形，两端尖细，呈成纤维细胞样，宽度增加至20 μm左右。有的细胞为多角形，立体感较强。核椭圆形，较大，有的细胞内可见双核(应处于分裂相)，核仁较清晰。6 d左右细胞大量繁殖，8 d左右生长接近单层汇合。传代后细胞仍呈成纤维细胞样生长。不同部位原代脂肪源性干细胞形态无明显差异，见图1。

2.3 不同部位来源脂肪源性干细胞生长曲线和倍增时间内脏大网膜脂肪与腹股沟皮下脂肪的脂肪源性干细胞生长曲线基本一致，分别于第5，6天左右进入指数增长期；第9，10天左右到达平台期；其倍增时间约为50 h和60 h，见图2。

2.4 大鼠不同部位脂肪源性干细胞的成脂诱导分化能力见图3。

倒置相差显微镜下见成脂诱导3 d时，细胞胞浆开始回缩，体积变小，折光性增强，由诱导前长梭形变成小方形、圆形。诱导7 d时，细胞增殖力明显降低，形态发生明显变化，胞浆内开始出现发亮圆形小脂滴。诱导2周时，胞浆内见大量细小脂滴聚集成单个较大脂滴，细胞体积更加缩小，形态已十分接近成熟脂肪细胞单房脂滴结构，非诱导组没有脂滴出现。
红油O染色证实诱导组细胞胞浆内可见许多大小不等的橙红色颗粒，非诱导组均为阴性，见图3。大网膜组织来源的脂肪干细胞的成脂诱导分化率为(38.90± 2.86)%，腹股沟组织来源的脂肪干细胞的成脂诱导分化率为(35.30±3.29)%，两者相比差异具有显著性意义 (P < 0.01)。

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引言

各种原因所造成的原发与继发性软组织缺损及发育不良是整形外科所面临的主要挑战之一。近年来，随着脂肪组织工程的发展，利用干细胞移植来修复组织缺损成为整形美容外科研究的新方向。
成体干细胞因在体内分布广泛、增殖活性强、具有多向分化潜能，而且定向诱导分化技术较为成熟等优点逐渐受到组织工程研究人员的青睐，目前已经成为组织工程种子细胞研究的热点。2001年，Zuk等^[1]从脂肪抽吸物中成功分离培养出具有多向分化潜能的细胞，脂肪源性干细胞才真正被人们所认识。此后的许多研究也证实了脂肪源性干细胞的多向分化潜能^[2-3]，包括向脂肪细胞、内皮细胞等的分化^[4]。此外，脂肪源性干细胞还能够分泌与血管形成有关的细胞因子，如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等^[5]。由于脂肪源性干细胞在生物学特性及分化潜能等方面与骨髓间充质干细胞非常相似，并且存在来源丰富、易获取、对供体创伤小、增殖快等优势，已成为组织工程种子细胞研究领域的重要种子细胞^[6]。
在整形美容外科领域，脂肪源性干细胞能够参与脂肪重构，在细胞辅助脂肪移植修复组织缺损以及隆胸、面部轮廓重塑等方面发挥着重要的作用^[7-9]。因此，对脂肪源性干细胞各种生物学特性的研究具有比较重要的临床意义。
当前，已有许多关于不同年龄、不同个体所获取的脂肪源性干细胞在增殖和分化特性方面的比较研究^[10-12]，但对同一个体不同部位来源的脂肪源性干细胞的生物学特性的比较研究还较少。文献报道，大鼠不同部位的脂肪源性干细胞的成神经细胞分化能力没有显著性差异^[13]。也有研究报道，兔不同部位的脂肪源性干细胞在体外培养时细胞倍增时间存在差异^[14]。对于同一种属不同部位来源的脂肪源性干细胞体外培养的生物学特性究竟是否存在差异目前尚无定论。然而，在干细胞移植治疗疾病过程中，种子细胞数量的多少、扩增时间的长短以及分化特性等在修复过程中也起到不可忽视的作用^[8]。因此，作为一种理想的种子细胞，对同一种属不同部位来源的脂肪源性干细胞的生物学特性的比较研究具有非常重要的意义。
F344大鼠属于近交系大鼠，其基因型一致，遗传组成和遗传特性亦相同，广泛应用于组织移植和干细胞研究中^[15-16]。因此，实验以F344大鼠为研究对象，对同一个体、相同体积、不同部位来源的脂肪组织获得的脂肪源性干细胞进行计数分析，并对其在体外培养时的生长特性和成脂诱导分化能力进行比较，以期为脂肪源性干细胞的进一步研究和应用提供实验依据。

材料方法

设计：细胞学体外对比观察实验。

时间及地点：于2011年3月至2012年8月在烟台毓璜顶医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级近交系F344雄性大鼠20只，4-8周龄，体质量300-400 g，由上海交通大学医学院附属第九人民医院动物中心提供，许可证号：SYXK(沪) 2012-0007。

实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求^[17]。

分离培养大鼠脂肪干细胞及诱导其成脂分化所用的主要试剂：

方法：

大鼠不同部位脂肪源性干细胞的分离与计数：将大鼠脱颈处死，常规备皮、消毒，无菌操作下取F344大鼠腹股沟及腹腔大网膜脂肪组织各5 mL，加入等体积的体积分数0.25%氯霉素浸泡20 min，PBS反复冲洗2遍；将两个部位的脂肪组织分别移入培养皿中，分离肉眼可见的筋膜和血管，用眼科剪将组织剪至0.8-1.0 mm³大小的脂肪颗粒。加入等体积的以含血清的低糖DMEM配制的1 g/LⅠ型胶原酶，在37 ℃恒温摇床消化1 h，1 800 r/min离心10 min，获得高密度的细胞沉淀物，轻轻倾去上清液和漂浮的黄色组织，将细胞振荡混匀，加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液2 mL吹打均匀，加至7 mL，进行细胞计数并移入100 mm塑料培养皿中。

脂肪源性干细胞生长形态的观察、培养与传代：将接种好细胞的培养皿置于37 ℃、体积分数5%CO₂、100%饱和湿度条件下培养24 h进行首次换液。倒置相差显微镜下可见大量漂浮的脂滴和少量刚贴壁的长梭形细胞，PBS反复冲洗去除漂浮的血细胞和脂滴，重新注入新鲜含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，计数并继续在相同条件下培养。中间每隔三四天半量换液，直至细胞接近80%融合进行传代。传代前以少量PBS洗涤1次，加入2.5 g/L胰蛋白酶和体积分数0.02%EDTA组成的消化液2 mL，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入2 mL含血清的低糖DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以(0.5-1.0)× 10⁴/cm²细胞浓度接种于新的培养皿内。五六天达到融合状态，继续传代培养。

脂肪源性干细胞生长曲线和倍增时间的测定：2.5 g/L胰蛋白酶和体积分数0.02%EDTA消化两个部位第2代细胞，将细胞悬液混匀、计数，调整细胞浓度为(3-5)× 10⁷ L^-¹，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，从第2天起每日取9孔以MTT比色法测定吸光度。

取各时相点吸光度的平均值，以时间(d)为横坐标，吸光度值(表示细胞相对数量)为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

成脂诱导和检测：取第2代脂肪源性干细胞经胰酶消化后，按1×10⁴/孔接种于24孔板，分诱导组和非诱导组，细胞生长达80%融合时，诱导组进行成脂诱导，诱导液成分为含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM和0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛，每周换液2次。非诱导组以常规高糖DMEM培养。诱导14 d时，吸去培养液，PBS冲洗，体积分数4%甲醛4 ℃固定1 h，加入体积分数60%异丙醇，室温放置1 min，吸尽后加入体积分数2%油红试剂，室温放置5-10 min，体积分数60%异丙醇洗去多余染料，蒸馏水冲洗，甘油封固，显微镜下观察。每孔计数任意10个100倍视野下300个细胞中油红O染色阳性细胞数，得到每种细胞的平均成脂分化率。

主要观察指标：①大鼠不同部位等量的脂肪组织获得的脂肪源性干细胞数目。②不同部位脂肪源性干细胞的形态。③不同部位脂肪源性干细胞在体外培养时的生长曲线及倍增时间。④不同部位脂肪源性干细胞成脂诱导分化的能力。

统计学分析：所有检测指标均以x(_)±s表示，由第一作者应用SPSS 13.0软件包对各定量指标用配对t 检验进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

通过自体脂肪颗粒移植修复组织缺损是整形外科的一项重要手段，但是植入的脂肪容易出现吸收、液化、钙化、囊性样变等并发症^[18]，限制了其广泛的临床应用。随着组织工程的发展，临床上逐渐应用脂肪源性干细胞辅助自体脂肪颗粒移植来修复组织缺损^[7-9]。和间充质干细胞一样，脂肪源性干细胞具有多向分化潜能^[1]，可作为多种组织工程的种子细胞^[19-20]。而且，与间充质干细胞相比，脂肪源性干细胞在人体内分布范围更广，可利用的细胞总量更多，而且所需的脂肪组织可经整形外科吸脂术获得，该手术操作简单，创伤小，还能对患者进行体型重塑。对此种细胞获得率的研究发现，平均350 mL脂肪抽吸物可分离出1×10⁸个单个核细胞，数量非常可观^[21-22]。将脂肪源性干细胞放在脂肪诱导培养基中，可以表达脂蛋白脂肪酶、过氧化物酶体增殖物激活受体γ等脂肪细胞相关基因^[23-24]。在动物体内将脂肪源性干细胞种植到天然(胶原和透明质酸)或合成的支架上^[25-26]，可以形成脂肪组织。此外，脂肪源性干细胞能够促进血管新生、免疫调节等^[27]，在细胞辅助脂肪移植时提高脂肪颗粒的成活中发挥重要的作用^[7]。因此，脂肪源性干细胞是脂肪组织工程领域很有前景的种子细胞。

在脂肪源性干细胞辅助脂肪移植以提高脂肪颗粒成活率的过程中，往往需要脂肪源性干细胞达到比较理想的数量而且能够具有比较良好的分化特性，由此细胞向脂肪细胞、血管内皮细胞等的迅速分化与增殖才能够在整个治疗过程中起到促进作用^[8]。而当前国内外关于同一个体、不同部位所获得的脂肪源性干细胞数量和生物学特性比较研究的基础实验科学依据不多，故实验拟在相同培养条件下从不同的角度来比较来源于F344大鼠同一个体、不同部位脂肪组织所获得的脂肪源性干细胞数量、增殖和成脂能力的差异，为进一步利用脂肪源性干细胞进行相关研究时对于取材部位的选择可能对实验结果的影响提供依据和参考。

实验结果表明，相同体积的内脏大网膜脂肪的脂肪源性干细胞数目与腹股沟皮下脂肪的脂肪源性干细胞数目具有显著性差异，这可能与不同的取脂部位存在着组织结构的差异有关。高倍镜下观察，腹腔大网膜脂肪细胞略大于腹股沟皮下脂肪细胞，腹股沟皮下脂肪组织中可见较多的腺体组织，这可能使相同体积的皮下脂肪组织中含有的脂肪细胞数目及脂肪源性干细胞数目相对减少。同样，在人体，不同部位的脂肪组织存在着结构和体积的差异。有学者对 20例行脂肪抽吸术者的腹部板状层及大腿内侧板状层相同体积脂肪进行观察发现，不同部位相同个体所取脂肪的脂肪细胞数目、大小、密度均有显著差异^[28]。因此，在临床使用脂肪源性干细胞辅助治疗中，应该适当考虑不同的来源部位对种子细胞获取数目的影响。而通过对不同部位来源的脂肪源性干细胞生长曲线的观察，发现其倍增时间存在差异，来源于大网膜脂肪组织的脂肪源性干细胞的倍增时间小于来自腹股沟脂肪组织的脂肪源性干细胞。文献证明，临床上通过吸脂术获得的原代脂肪源性干细胞，又称血管基质成分，实际上是一类混杂的干细胞，其各种干细胞的比例大约是：脂肪干细胞占70%-90%、血管内皮祖细胞占3%-9%、血管周皮细胞占2%-5%，还有其他类干细胞^[9^，^29]，因此，可以认为同一个体不同部位来源的脂肪源性干细胞可能在干细胞的数目及组成比例上存在某种差异，而正是这种差异导致了细胞生长速度的不同。

通过对不同部位来源的脂肪源性干细胞在相同的条件下进行体外成脂肪诱导后，实验发现，二者在成脂分化能力上存在显著性差异。进一步说明同一个体不同部位的脂肪细胞的生物学行为不同，可能对某种特殊的脂肪生成刺激也存在差异^[30]。Hudson等^[31]发现人体不同部位的脂肪组织的脂蛋白脂肪酶活性存在差异，大腿脂肪组织的脂蛋白脂肪酶活性高于其他部位。还有研究表明，皮下脂肪和大网膜脂肪组织对儿茶酚胺类引起的脂肪分解反应程度明显不同，这可能与这两个部位的脂肪细胞表面的α受体的数目或者功能不同有关^[32]。这可能反应了细胞或细胞克隆的本质是有差异的。这些细胞之间的内在差异可能引起不同区域的细胞与细胞之间信息传导模式的不同，旁分泌和自分泌的介质也不相同。实验结果显示，来源于大网膜的脂肪源性干细胞不仅细胞增殖速度比腹股沟来源的脂肪源性干细胞快，而且其分化潜能也大于后者。这可能与细胞的基因表达不同有关，此外，也可能与干细胞的组成成分不同有关。大网膜脂肪来源的脂肪源性干细胞与腹股沟脂肪来源的脂肪源性干细胞相比，其成分中可能含有更“年轻”、更有分化潜力的细胞。然而，其具体的机制有待进一步深入的研究，这对今后脂肪源性干细胞在脂肪组织工程中的应用具有非常重要的参考价值。

综上所述，实验发现，大鼠不同部位来源的脂肪源性干细胞在细胞的组成、数目、分化能力等方面存在差异，提示今后在从事脂肪组织工程时选取脂肪源性干细胞作为种子细胞时对不同的来源部位对结果的影响要有所考虑。然而，人体脂肪组织结构毕竟不同于大鼠，因此，还应该在临床上对人体各部位来源的脂肪源性干细胞的生物学特性进行深入、系统的比较研究，探讨其作用机制，以期为使用脂肪源性干细胞修复组织缺损时提供有益的参考。