耐受性树突状细胞可抑制胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞的焦亡

doi:10.12307/2023.498

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (33): 5363-5369.doi: 10.12307/2023.498

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耐受性树突状细胞可抑制胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞的焦亡

龙调玉1，包伦敏2，万秀方1，李红红1，张云东2，蒋红梅1

1贵州医科大学医学检验学院临床微生物学及免疫学教研室，贵州省贵阳市 550025；2安顺市人民医院医学检验科，贵州省安顺市 561000

收稿日期:2022-06-16 接受日期:2022-07-27 出版日期:2023-11-28 发布日期:2023-03-30
通讯作者: 蒋红梅，博士，教授，博士生、硕士生导师，贵州医科大学医学检验学院临床微生物学及免疫学教研室，贵州省贵阳市 550025
作者简介:龙调玉，女，1998年生，贵州省锦屏县人，苗族，贵州医科大学在读硕士，初级检验师，主要从事免疫相关性疾病的机制和防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区科学基金(81960393)，项目负责人：蒋红梅；贵州省普通本科高校自然科学研究创新群体项目(黔教合KY字[2021]016)，项目领衔人：蒋红梅

Tolerogenic dendritic cells can inhibit pyroptosis of spleen cells in collagen-induced arthritis rats

Long Tiaoyu1, Bao Lunmin2, Wan Xiufang1, Li Honghong1, Zhang Yundong2, Jiang Hongmei1

1Department of Clinical Microbiology and Immunology, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; 2Department of Laboratory Medicine, People’s Hospital of Anshun City, Anshun 561000, Guizhou Province, China

Received:2022-06-16 Accepted:2022-07-27 Online:2023-11-28 Published:2023-03-30
Contact: Jiang Hongmei, MD, Professor, Doctoral supervisor, Master’s supervisor, Department of Clinical Microbiology and Immunology, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
About author:Long Tiaoyu, Master candidate, Department of Clinical Microbiology and Immunology, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Supported by:
the Regional Science Fund Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81960393 (to JHM); the Project of Natural Science Research Innovation Group of General Undergraduate Colleges in Guizhou Province, No. KY[2021]016 (to JHM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

耐受性树突状细胞：耐受性树突状细胞在共刺激分子表达方面介于未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞之间的中间表型，可诱导T淋巴细胞的低反应性或无能，具有免疫抑制能力，产生高水平抗炎细胞因子白细胞介素10、低水平白细胞介素12和白细胞介素23。
焦亡：是一种全新的程序性细胞死亡模式，涉及炎症小体多蛋白复合物的激活，主要特征是细胞膜穿孔、细胞肿胀、内容物释放，引起炎症反应。

背景：课题组前期利用核因子κB寡核苷酸诱骗剂成功构建了抗原特异性耐受性树突状细胞，并用其对胶原诱导性关节炎大鼠模型进行了有效干预，但治疗机制仍有待进一步研究。
目的：探讨耐受性树突状细胞对胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞焦亡的影响。
方法：提取骨髓源树突状细胞，利用核因子κB寡核苷酸诱骗剂构建耐受性树突状细胞。取9只SD大鼠，采用随机数字表法随机分为正常组、模型组、治疗组，每组3只，模型组、治疗组建立胶原诱导性关节炎模型(初次免疫：左足跖部皮内注射牛Ⅱ型胶原乳剂；加强免疫：初次免疫后第14天，尾根部多点注射牛Ⅱ型胶原乳剂)，初次免疫后第20天分别尾静脉注射生理盐水、耐受性树突状细胞，初次免疫后第35天，进行相关检测。

结果与结论：①关节炎指数评分：治疗组大鼠关节炎指数评分低于模型组(P < 0.05)；②足踝关节大体与病理观察：模型组大鼠踝关节严重肿胀，治疗组大鼠踝关节轻度肿胀；苏木精-伊红染色显示，与正常组相比，模型组大鼠足踝关节滑膜明显增生，伴有炎性细胞浸润和骨侵蚀；与模型组相比，治疗组大鼠足踝关节滑膜增生减低、骨侵蚀和炎性细胞浸润减少；③血清白细胞介素1β水平：模型组大鼠血清白细胞介素1β水平高于正常组(P < 0.05)，治疗组大鼠血清白细胞介素1β水平低于模型组(P < 0.05)；④脾脏相关蛋白表达：Western blot检测显示，与正常组相比，模型组大鼠脾脏NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD-NT、白细胞介素1β前体、白细胞介素1β的蛋白表达均增高(P < 0.05)；与模型组大鼠相比，治疗组大鼠脾脏NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD-NT、白细胞介素1β前体、白细胞介素1β的蛋白表达均下降(P < 0.05)；⑤结果表明，耐受性树突状细胞可能通过抑制脾脏细胞焦亡和促炎细胞因子白细胞介素1β的释放，缓解胶原诱导性关节炎模型大鼠的炎症反应。

https://orcid.org/0000-0001-8247-7598(龙调玉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 耐受性树突状细胞, 胶原诱导性关节炎, NLRP3, 白细胞介素1β, 细胞焦亡, 类风湿关节炎

Abstract: BACKGROUND: In our previous study, we successfully constructed antigen-specific tolerogenic dendritic cells using nuclear factor-kappa B oligodeoxynucleotide decoy, and used them to effectively intervene a collagen-induced arthritis rat model. However, the therapeutic mechanism remains to be further studied.
OBJECTIVE: To investigate the effect of tolerogenic dendritic cells on pyroptosis of spleen cells in collagen-induced arthritis rats.
METHODS: Bone marrow-derived dendritic cells were extracted and used to construct tolerogenic dendritic cells using nuclear factor-kappa B oligodeoxynucleotide decoy. Nine Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, model group, and treatment group, with three rats in each group. The latter two groups were used to establish rheumatoid arthritis models. Initial immunization was subcutaneous injection of bovine type II collagen emulsion on the left foot plantar; booster immunization was multiple injections of bovine type II collagen emulsion at the base of the tail on the 14th day after the initial immunization. Rats in the model and treatment groups were given normal saline and tolerogenic dendritic cells into the tail vein, respectively, on the 20th day after the initial immunization. Relevant measurements were performed on the 35th day after the initial immunization.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, arthritis index score in the treatment group decreased significantly (P < 0.05). (2) Gross and pathological observations showed the ankle joints of the rats were severely swollen in the model group and slightly swollen in the treatment group. Hematoxylin-eosin staining results showed that compared with the control group, the synovium of the ankle joint had obvious hyperplasia, accompanied by inflammatory cell infiltration and bone erosion; compared with the model group, the treatment group had reduced synovial hyperplasia, bone erosion and inflammatory cell infiltration of the ankle joint. (3) Serum interleukin 1β level was higher in the model group than the control group (P < 0.01) and lower in the treatment group than the model group (P < 0.01). (4) Western blot results showed that compared with the control group, the protein expressions of NLR family pyrin domain containing 3, pro-caspase-1, caspase-1, GSDMD-NT, pro-interleukin 1β, and interleukin 1β in the spleen were significantly increased in the model group (P < 0.05). Compared with the model group, the protein expressions of spleen NLR family pyrin domain containing 3, pro-caspase-1, caspase-1, GSDMD-NT, pro-interleukin 1β, and interleukin 1β were all decreased in the treatment group (P < 0.05). (5) In conclusion, tolerogenic dendritic cells may alleviate inflammatory responses in collagen-induced arthritis rats by inhibiting the pyroptosis of spleen cells and the expression of interleukin-1β.

Key words: tolerogenic dendritic cell, collagen-induced arthritis, NLRP3, interleukin 1β, pyroptosis, rheumatoid arthritis

中图分类号:

龙调玉, 包伦敏, 万秀方, 李红红, 张云东, 蒋红梅. 耐受性树突状细胞可抑制胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞的焦亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5363-5369.

Long Tiaoyu, Bao Lunmin, Wan Xiufang, Li Honghong, Zhang Yundong, Jiang Hongmei. Tolerogenic dendritic cells can inhibit pyroptosis of spleen cells in collagen-induced arthritis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(33): 5363-5369.

图/表（结果） 6

2.1 树突状细胞形态学观察各组细胞培养至第6天，大部分呈半贴壁生长，均有细胞集落形成，其中未成熟树突状细胞表面毛发样突起短且少，成熟树突状细胞表面毛发样突起长且多；与空白对照组相比，诱骗剂组可见较少毛发样突起细胞，脂多糖对照组中毛发样突起细胞明显增多；与脂多糖对照组相比，脂多糖-诱骗剂组中毛发样突起细胞明显减少，见图1。

2.2 树突状细胞的鉴定为鉴定大鼠骨髓源树突状细胞的纯度，采用流式细胞术检测其表面特异性标记物OX-62的表达情况，结果显示：OX-62+细胞在空白对照组、诱骗剂组、脂多糖对照组和脂多糖-诱骗剂组中的表达分别为(96.8±1.5)%，(96.3±1.7)%，(98.7±0.4)%和(97.2±1.0)%；为了评价tolDC的稳定性，实验加入脂多糖刺激细胞成熟，然后采用流式细胞术检测CD80和CD86的表达，评价树突状细胞的成熟度，结果显示：与空白对照组相比，诱骗剂组CD80+、CD86+细胞阳性率明显降低(P < 0.01，P < 0.05)；与脂多糖对照组相比，脂多糖-诱骗剂组CD80+、CD86+细胞阳性率明显降低(P < 0.01)，见图2，说明制备的tolDC纯度高、稳定性好，符合后续实验要求。

2.3 动物实验结果
2.3.1 实验动物数量分析 9只大鼠中正常组3只，剩余6只进行了类风湿关节炎造模，关节炎指数评分均≥4，提示造模成功进行后续实验。
纳入实验的9只大鼠实验过程中无感染或死亡，均进入结果分析。
2.3.2 各组大鼠关节炎指数评分正常组大鼠关节正常。与正常组比较，模型组大鼠关节炎指数评分明显增加 (P < 0.05)；与模型组比较，治疗组大鼠关节炎指数评分于初次免疫第28，35天明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，见图3，说明tolDC可减轻胶原诱导性关节炎大鼠的关节炎指数评分。

2.3.3 各组大鼠关节肿胀情况及足踝关节病理形态学观察从初次免疫的第7天起，与正常组相比，模型组和治疗组大鼠关节明显肿胀，第21天到达高峰；与模型组相比，治疗组于初次免疫第28，35天关节肿胀明显缓解，见图4A。
踝关节苏木精-伊红染色显示，正常组滑膜组织光滑，滑膜细胞排列整齐有序，由1-3层细胞组成，滑膜下层由脂肪细胞和成纤维细胞组成，无血管增生或炎性细胞浸润；模型组滑膜细胞明显增生，并伴有炎性细胞浸润，滑膜细胞不规则地排列成数十层，滑膜组织几乎占据整个关节腔，软骨和软骨下骨质被侵蚀，导致关节结构明显异常；与模型组相比，治疗组滑膜细胞增殖程度明显减低，滑膜细胞层数减少，排列更整齐，关节软骨表面更完整，无明显的软骨或软骨下骨质侵蚀，见图4B。说明tolDC可缓解胶原诱导性关节炎大鼠滑膜增生与骨损伤。

2.3.4 各组大鼠血清白细胞介素1β水平与正常组相比，模型组大鼠血清中白细胞介素1β水平升高(P < 0.01)；与模型组相比，治疗组大鼠血清中白细胞介素1β水平降低(P < 0.01)，见图5。

2.3.5 各组大鼠脾脏相关蛋白表达与正常组比较，模型组大鼠脾脏组织中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD-NT、白细胞介素1β及其前体蛋白表达升高(P < 0.05)；与模型组相比，治疗组大鼠脾脏组织中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD-NT、白细胞介素1β及其前体蛋白表达降低(P < 0.05)，见图6，说明tolDC干预后可下调胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞焦亡相关蛋白表达。

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引言

类风湿关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，其主要特征是持续性滑膜炎、软骨丧失和骨侵蚀，最终导致残疾[1]，其全球发病率约为1%，女性发病率是男性的两三倍，可发生在任何年龄段[2]。传统的风湿性关节炎药物并不能治愈疾病，只能改善炎症和减缓疾病进程。虽然这些药物有一定的疗效，但由于有明显的不良反应，如胃肠道损伤、心脏并发症和免疫抑制引起的机会性感染，导致其使用受到限制[3]。因此，开发一种新的有效疗法对类风湿关节炎的治疗有重要意义。
近年来，耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells，tolDC)因其可建立免疫耐受、恢复免疫失衡而被应用于自身免疫病的治疗，并有可能成为治疗类风湿关节炎的新途径[4]。课题组前期利用核因子κB寡核苷酸诱骗策略竞争性地与核因子κB结合，抑制树突状细胞成熟[5]，负载牛Ⅱ型胶原得到了具有良好稳定性和特异性tolDC，用其对胶原诱导性关节炎大鼠进行了有效干预，但治疗机制仍有待进一步研究。许多证据表明，细胞焦亡与类风湿关节炎的发病机制密切相关[6]。CHOULAKI等[7]研究发现，活动期类风湿关节炎患者外周血细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体活性增强。NLRP3炎症小体在先天免疫和炎症中发挥重要作用，可激活caspase-1和其他炎性caspase，caspase-1剪切Gasdermin D(GSDMD)，使成孔活性GSDMD-NT插入膜上形成膜孔；caspase-1还能剪切白细胞介素1家族的非活性前体，从而产生成熟的细胞因子，如白细胞介素1β和白细胞介素18；白细胞介素1通过膜孔得以释放，并通过焦亡驱动裂解细胞死亡[8]，从而扩大炎症反应[9-10]。在佐剂诱导性关节炎大鼠巨噬细胞中NLRP3、caspase-1、GSDMD-NT表达增加，白细胞介素1β和白细胞介素18水平升高，提示焦亡可能参与了关节炎的发病机制[11]，因此，作者推测tolDC可能通过抑制脾脏细胞焦亡和促炎细胞因子释放缓解炎症反应。此次实验分析了tolDC对胶原诱导性关节炎大鼠中脾脏细胞焦亡相关分子和血清促炎细胞因子表达的影响，旨在为tolDC治疗类风湿关节炎提供更多的理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2021 年7-12月在贵州医科大学动物中心、贵州医科大学医学检验学院临床检验诊断实验教学示范中心和贵州医科大学附属医院临床研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性SD大鼠10只，8周龄，SPF级，体质量 (120±13) g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0014。饲养环境：在温度(22±2) ℃，湿度55%，12 h光照/黑暗循环的环境饲养，可自由获得食物和水。适应性饲养1周后进行后续实验。
动物实验方案获得贵州医科大学动物伦理审查委员会批准，批准号：No.2000463。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规，实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂 RPMI 1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(sciencell公司)；白细胞介素4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(peprotech公司)；牛Ⅱ型胶原(Chondrex公司)；红细胞裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；弗氏完全佐剂(Sigma公司)； Alexa Fluor 647标记的抗OX-62抗体、藻红蛋白标记的抗CD80抗体、异硫氰酸荧光素标记的抗CD86抗体(Biolegend公司)；大鼠白细胞介素1β ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)； HRP标记的羊抗兔和羊抗小鼠二抗(上海优宁维公司)；NLRP3、β-actin、caspase-1抗体(万类生物科技有限公司)；白细胞介素1β、GSDMD-NT抗体(Novus公司)；pro-caspase-1抗体(santa cruz 公司)；0.45 μm和0.22 μm PVDF膜(millipore公司)。参考TIAN等[12]使用的核因子κB寡核苷酸诱骗剂序列，正义序列为：5′-AGG GAC TTT CCG CTG GGG ACT TTC C-3′，下划线标出的碱基序列表示与核因子κB 特异性结合的位点，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.3 主要仪器酶标仪(Multiskan FC，Thermo Fisher，美国)；流式仪器(FC500，Beckman，美国)；凝胶电泳及转膜系统 (Bio-Rad，美国)；凝胶成像系统 (ChemiDoc™ XRS+，Bio-Rad，美国)。
1.4 方法
1.4.1 tolDC制备及鉴定参考马贵兰等[13]文献提取骨髓源树突状细胞。取1只雌性SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)麻醉，当大鼠四肢软弱无力、呼吸变深慢，翻正反射消失，表明麻醉诱导成功，随后取双侧胫骨。小心剪去胫骨两端暴露骨髓腔，用10 mL注射器吸取5 mL PBS反复冲洗骨髓腔直至变白。吸取骨髓腔冲洗液在200目筛网中研磨过滤，随后1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液破坏红细胞。离心弃上清，用PBS洗涤2遍，重悬于RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为1×109 L-1。将2 mL细胞悬液接种在6孔板中，在37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养90 min。随后用预热PBS洗2次，获得单核细胞。
将收获的单核细胞在完全培养基(89%RPMI 1640培养基、体积分数10%胎牛血清、1%双抗)中继续培养。细胞实验分4组：①空白对照组：提取细胞当天加终浓度20 ng/mL白细胞介素4、30 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子直接诱导培养；②诱骗剂组：提取细胞当天加终浓度20 ng/mL白细胞介素4、30 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、10 μmol/L的核因子κB寡核苷酸诱骗剂；③脂多糖对照组：提取细胞当天加终浓度20 ng/mL白细胞介素4、30 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，第5天加终浓度10 μg/L脂多糖继续培养24 h；④脂多糖-诱骗剂组：提取细胞当天加终浓度20 ng/mL白细胞介素4、30 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、10 μmol/L的核因子κB寡核苷酸诱骗剂，第5天加终浓度10 μg/L脂多糖继续培养24 h。每3 d半量换液，同时补充细胞因子，培养至第6天收获细胞进行检测。流式细胞仪检测OX-62、CD80和CD86表达来评估树突状细胞的纯度和成熟度。用100 μL PBS重悬细胞后，依次加入2 μL OX-62抗体、1.25 μL
CD80抗体、2 μL CD86抗体。设阴性对照管，不加任何抗体。避光孵育30 min后，用PBS洗涤1遍，加入400 μL PBS重悬，所得单细胞悬液用流式细胞仪检测，数据用Flowjo分析。实验重复3次。后续实验以诱骗剂组方法制备tolDC。
1.4.2 大鼠分组干预及胶原诱导性关节炎大鼠模型的建立
实验分组及干预：取9只SD大鼠，采用随机数字表法随机分为正常组、模型组、治疗组，每组3只。治疗组在构建胶原诱导性关节炎模型的第20天，经大鼠尾静脉输注0.5 mL 5×106个tolDC(于培养细胞第5天时加75 μL pH 值≈7的牛Ⅱ型胶原负载tolDC)；模型组在构建胶原诱导性关节炎模型的第20天，尾静脉注射0.5 mL生理盐水；正常组不建模，于相同时间点注射0.5 mL生理盐水。
建模方法：参考课题组前期的方法建立胶原诱导性关节炎模型[14]。将牛Ⅱ型胶原干粉用0.1 mol/L冰醋酸溶液溶解(终浓度为2 mg/mL，4 ℃过夜)。将弗氏完全佐剂与等体积的牛Ⅱ型胶原溶液混合，在冰上充分混匀，得到1 mg/mL的牛Ⅱ型胶原乳剂。将200 μL牛Ⅱ型胶原乳剂在模型组、治疗组大鼠左足跖部皮内初次免疫，初次免疫后第14天，于大鼠尾根部多点注射等量牛Ⅱ型胶原乳剂进行加强免疫。正常组大鼠于相同时间点、相同部位注射等量的生理盐水。于初次免疫后第35天，腹腔注射3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)麻醉大鼠，进行同步取材。

1.4.3 评估大鼠关节炎指数初次免疫第 7，14，21，28，35 d，对模型组与治疗组大鼠进行评分。没有关节红肿记为0分，趾关节轻微红肿记为1分，足趾关节以下部位肿胀记为2分，踝关节以下均肿胀记为3分，全部足爪肿胀记为4 分，总分最高可达16分。

1.4.4 苏木精-伊红染色检测大鼠足踝关节病变情况取各组大鼠足踝关节，于40 g/L多聚甲醛中固定后进行脱钙。石蜡包埋、切片，进行常规苏木精-伊红染色，观察大鼠足踝关节病变情况。
1.4.5 ELISA 测定大鼠外周血白细胞介素1β水平采用心脏采血方法收集大鼠外周血。采集的血液3 000 r/min 离心15 min分离出血清，采用 ELISA 测定大鼠血清白细胞介素1β的水平。操作步骤严格按照大鼠白细胞介素1β ELISA 试剂盒说明书进行。
1.4.6 Western blot法检测大鼠脾脏组织相关蛋白表达取适量脾脏组织匀浆，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，使用超声破碎仪破碎组织，12 000 r/min离心15 min，取上清，根据 BCA 试剂盒说明书测蛋白浓度。匀浆上清与上样缓冲液4∶1的比例充分混匀，然后使用恒温金属浴100 ℃煮10 min，电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭。分别加兔抗NLRP3(1∶1 000)、鼠抗pro-caspase-1(1∶1 000)、兔抗caspase-1(1∶1 000)、兔抗GSDMD-NT(1∶1 000)、兔抗白细胞介素1β(1∶2 000)、兔抗β-actin(1∶1 000)于4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，分别加HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶10 000)和山羊抗小鼠二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h。TBST洗涤3次后，加入ECL发光试剂显影。采用凝胶成像仪采集图像，用Image J软件对各条带进行半定量分析，计算目的蛋白与内参蛋白的比值。
1.5 主要观察指标 ①流式细胞术检测树突状细胞表面OX-62、CD80、CD86表达情况；②各组大鼠关节肿胀情况并进行关节炎评分；③各组大鼠左足踝关节病理形态学观察；④各组大鼠血清白细胞介素1β水平；⑤各组大鼠脾脏NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD-NT、白细胞介素1β及其前体蛋白的表达水平。
1.6 统计学分析使用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，所有数据先进行正态性分析和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐时采用单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较，两两比较采用 LSD 检验进行；不符合正态分布时采用秩和检验，方差不齐时采用 Tamhane’s 检验；两组比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。该文统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

类风湿关节炎是一种慢性自身炎症性疾病，影响多个关节并导致患者活动受限[15]，目前，抗风湿性药物和生物药物的广泛应用已经改善了类风湿关节炎患者的预后，但往往有许多不良反应[16]，不能治愈疾病[17]。而近些年来，具有致耐受性的tolDC过继转移的策略备受关注，有望成为治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病的新方法。树突状细胞是一类重要的专职抗原提呈细胞，在激活T细胞方面起着核心作用，是目前所知唯一能够激活初始型T细胞的抗原提呈细胞。研究表明，树突状细胞与类风湿关节炎的发生和发展有着密切的关系[18-19]。树突状细胞是体内最有效的抗原提呈细胞，它可以通过提供共刺激信号给初始型T细胞，活化T淋巴细胞，从而打破自身免疫平衡状态，诱导自身免疫反应。研究表明树突状细胞具有双重免疫调节作用，其功能的变化是调节免疫耐受和免疫活化的核心机制。在自身免疫过程中，树突状细胞一方面可能激活 T 细胞，另一方面也可能使T细胞对自身抗原耐受而抑制自身免疫反应。而树突状细胞驾驭免疫反应的方向和程度与其成熟状态有关[20]。成熟树突状细胞可刺激 T 细胞的免疫反应性；未成熟树突状细胞因表面共刺激分子(如 CD80、CD86)的低表达可诱导T淋巴细胞的低反应性或无能，因而被认为是“耐受性”树突状细胞。tolDC表面共刺激分子的表达介于未成熟和成熟树突状细胞之间[21-22]，能产生大量免疫抑制分子，如白细胞介素10[23]。自身免疫耐受的破坏以及免疫效应细胞的激活与类风湿关节炎发生和发展关系密切，不同的树突状细胞类型可诱导不同的T细胞产生，使免疫反应向不同甚至相反的方向发展，由此可设想通过调节树突状细胞的功能抑制自身反应性T细胞活化，诱导抗原特异性耐受，从而治疗自身免疫性疾病。
目前临床常用的免疫抑制剂在体外或多或少都有抑制树突状细胞成熟的作用，但其毒性大，抑制树突状细胞成熟的作用弱且不完全，并且很容易被细胞因子所逆转[20]。转基因技术是将一些免疫抑制分子基因导入树突状细胞的方法，往往因腺病毒等载体对树突状细胞的刺激作用而抵消导入基因的效应[24]。课题组前期使用核因子κB寡核苷酸诱骗剂来阻断树突状细胞中核因子κB的激活，核因子κB在树突状细胞的成熟信号传导通路中起着决定性作用，核因子κB的激活是树突状细胞刺激T细胞活化的必要条件[25]，寡核苷酸诱骗策略是一项新的反义技术，使用与核因子κB靶基因的κB位点相一致的寡核苷酸序列，竞争性地占据核因子κB上靶基因启动区结合部位，削弱甚至阻断受转录因子调节的靶基因的表达，从而抑制树突状细胞的表型和功能成熟。流式细胞术检测结果显示，tolDC高表达OX-62，低表达共刺激分子CD80和CD86，对脂多糖刺激成熟有一定的抗性，并将其负载牛Ⅱ型胶原，成功构建了性能稳定且具有牛Ⅱ型胶原特异性的“专”tolDC。胶原诱导性关节炎具有与类风湿关节炎相似的病理改变和临床特征，被认为是研究类风湿关节炎的理想动物模型[26]，因此，此次实验通过建立胶原诱导性关节炎大鼠模型进行了研究。胶原诱导性关节炎大鼠经tolDC干预后，大鼠关节炎指数评分在第28，35天下降，踝关节苏木精-伊红染色也证实tolDC显著降低了胶原诱导性关节炎大鼠的病理损伤，这些结果提示tolDC可以缓解胶原诱导性关节炎的症状，但其干预机制有待进一步研究。
焦亡是一种促炎程序性细胞死亡模式，诱导强烈的炎症反应，以保护宿主免受微生物感染，然而，过度的焦亡可导致各种炎症性疾病[27]。研究发现，NLRP3炎症小体在类风湿关节炎等多种自身免疫性疾病的发生发展中发挥重要作用[28]，其激活可能导致炎症和骨质破坏[29]。据报道，NLRP3炎症小体的激活主要发生在类风湿关节炎患者和胶原诱导性关节炎小鼠滑膜浸润的单核细胞、巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞[30-31]，抑制剂 MCC950可有效改善胶原诱导性关节炎小鼠的关节炎症状，表明 NLRP3可能参与类风湿关节炎发病机制[32]。此次实验结果显示，胶原诱导性关节炎大鼠脾脏中NLRP3蛋白表达量增加，tolDC干预后下降，说明NLRP3在胶原诱导性关节炎发病中起重要作用。
焦亡执行蛋白GSDMD是caspase-1/4/5/11的底物，在各种炎症小体的作用下caspase-1被激活，活化的caspase-1不仅能引起白细胞介素18前体、白细胞介素1β前体转变为有生物活性的白细胞介素18、白细胞介素1β，还通过剪切GSDMD使其具有成孔活性的氨基端转移到细胞膜上形成膜孔，使得水分子等物质进入胞内引起细胞肿胀及裂解死亡[33-35]。
研究者用艾灸可显著降低类风湿关节炎滑膜组织中NLRP3炎症小体、caspase-1以及GSDMD的表达水平，从而抑制滑膜细胞焦亡，减轻滑膜炎症反应[36]。课题组前期研究发现，tolDC输注胶原诱导性关节炎大鼠后在脾脏中迁移和累积[12]。脾作为重要的外周免疫器官，在类风湿关节炎时会发生明显的病理变化，包括包膜和小梁增厚、红髓血窦明显充血、白髓扩大和单核细胞浸润等，是类风湿关节炎患者受影响最严重的器官之一[37]。此外，脾脏中含有大量的淋巴细胞，是对血源性抗原物质产生免疫应答的部位，脾脏中的各类淋巴细胞的数量直接影响其对抗原的免疫反应。有研究表明，调节性T细胞与辅助性T细胞17比例失衡是诱导类风湿关节炎发生的一个重要原因[38]，课题组前期研究发现，tolDC通过降低脾脏辅助性T细胞1和辅助性T细胞17比例减轻胶原诱导性关节炎大鼠的关节炎症和病变[13]。因此，脾脏是类风湿关节炎疾病中值得研究的重要器官，课题深入研究脾脏细胞焦亡对于了解tolDC在胶原诱导性关节炎治疗中的作用机制至关重要。Western blot检测结果显示，与模型组相比，治疗组大鼠脾脏中焦亡相关蛋白如pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD-NT、白细胞介素1β及其前体的表达明显减低，这些结果表明tolDC可减低胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞焦亡。研究发现白细胞介素1β是参与类风湿关节炎炎症的关键细胞因子，深度参与类风湿关节炎的发生发展过程[39]，也是细胞焦亡的效应产物之一，可引起强烈的炎症[40]。此次实验也观察到治疗组大鼠血清白细胞介素1β水平较模型组明显下降，与Western blot结果一致。类风湿关节炎是一种全身性、炎症性反应，促炎因子与抗炎因子之间的平衡被打破且偏向促炎，最终导致关节炎症的发生[41]。在免疫系统中，白细胞介素1β是一种强有力的促炎细胞因子，可以诱导T细胞分化和极化，特别是向辅助性T细胞17，从而促进全身炎症[42]。尽管tolDC是否直接通过降低脾脏细胞焦亡减轻胶原诱导性关节炎大鼠炎症反应过程尚未清楚，但血浆中炎性细胞因子如白细胞介素1β随着血液循环可以到达全身，包括关节部位，治疗后脾脏细胞焦亡减轻，减少了血循环中的炎性细胞因子，对关节部分可能产生间接影响。但由于缺乏信号通路研究和胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织细胞焦亡关键信号分子相关实验研究，因此，未来将会往这个方向进一步探究。
此次实验结果说明，tolDC对胶原诱导性关节炎大鼠具有良好干预作用，其机制可能与降低脾脏细胞焦亡、抑制下游效应分子白细胞介素1β释放有关，为tolDC干预胶原诱导性关节炎的潜在机制提供了新的线索，为该疾病的靶向治疗提供了新的途径。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

耐受性树突状细胞可抑制胶原诱导性关节炎大鼠脾脏细胞的焦亡

Tolerogenic dendritic cells can inhibit pyroptosis of spleen cells in collagen-induced arthritis rats

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