苏木精-伊红染色显示对照组再生肌纤维数量明显少于实验组，见图4。伤后12 h及1，3 d，两组再生肌纤维百分比差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组在伤后5，7，14 d再生肌纤维百分比均明显大于对照组(P < 0.05)，见图5。







2.3   ELISA检测炎症因子表达    第5，7和14 天时，实验组比对照组分泌更多的白细胞介素4、白细胞介素13和干扰素α且差异有显著性意义(P < 0.05)，同时实验组比对照组分泌更少的干扰素γ且差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。



2.4   实时荧光定量PCR检测   伤后12 h及1 d时，两组Ⅰ、Ⅲ型胶原以及MyoD相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05)；与对照组比较，实验组伤后3，5，7，14 dⅠ、Ⅲ型胶原相对表达量均下降(P < 0.05)，伤后3，5，7 d MyoD相对表达量增加(P < 0.05)，14 d虽增加，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。



2.5   流式细胞术检测巨噬细胞极化程度   伤后两组M1型巨噬细胞数量呈逐渐增加趋势，3 d时达峰值，之后逐渐下降，14 d时增加。其中伤后3，5，7，14 d实验组M1型巨噬细胞数量均少于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。两组M2型巨噬细胞数量亦呈逐渐增加趋势，7 d时达峰值，之后下降。其中伤后3，5，7，14 d实验组M2型巨噬细胞数量均多于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。见图8。



2.6   免疫荧光染色观察   通过免疫荧光对Pax7和MyoD进行了染色发现，实验组的肌卫星细胞增殖情况显著高于对照组且差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2和图9。

急性骨骼肌损伤临床较常见，损伤后修复过程一般包括退行性样变、炎症反应、再生和纤维化4个阶段[1-2]。然而，由于过量胶原蛋白积累导致纤维化的形成，这种过度修复最终会损害肌肉的正常愈合和功能[3-6]。因此，在治疗过程中控制骨骼肌纤维化程度是损伤修复的重要环节之一。研究证明肌肉损伤会引起损伤部位大量巨噬细胞浸润并参与到骨骼肌损伤修复的纤维化进程调控中发挥作用[7-9]。目前关于巨噬细胞极化对炎症因子表达的影响也受到广泛关注。研究显示巨噬细胞有不同的极化方式，如机体遇到病原微生物感染或损失时，巨噬细胞会表现出经典型极化(M1)并表达相应的促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素12及诱导型一氧化氮合酶来清除病原微生物和参与损伤的炎症反应[10-12]；而巨噬细胞发生替代激活(M2)通过表达抗炎因子Arg1，Ym1及Fizz等参与寄生虫的清除、促进组织修复及肉芽肿和过敏性哮喘等生物学作用[13-14]。因此，巨噬细胞的极化精确调控在组织的损伤修复进程中十分重要。

肌卫星细胞指骨骼肌中除骨骼肌纤维(肌细胞)外的一种扁平、有突起的细胞[15-16]。它们常附着于肌纤维(肌细胞)表面；当肌纤维(肌细胞)受损后，肌卫星细胞可增殖分化，参与肌纤维(肌细胞)的修复，因此具有干细胞性质。目前研究显示肌卫星细胞增殖及分化在骨骼肌损伤修复中扮演重要角色[17]，因此深入探讨肌卫星细胞的增殖机制在骨骼肌损伤治疗药物开发中是必不可少的一个环节。

柚皮素是从葡萄柚中提取的一种成分，具有抗炎、抗纤维化、保护血管内皮细胞等作用[18-19]，最新研究显示其能改善骨骼肌损伤修复中过度纤维化[20]。柚皮素能否治疗骨骼肌损伤及其对巨噬细胞极化的调控作用尚无研究报道。因此，此研究通过构建骨骼肌损伤模型，探讨柚皮素对巨噬细胞极化方向及肌卫星细胞增殖的作用，为骨骼肌损伤的治疗提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验。结果的统计分析过程中采用盲法评估，组间比较采用独立样本t检验。
1.2   时间及地点   实验于2018年6月至2019年12月在海南省中医院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   10周龄SPF级SD大鼠80只，雌雄各40只，体质量400-500 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证：SCXK(沪)2017-0006。所有动物饲养在26 ℃恒温恒湿的SPF级别动物房中，人为制造明暗循环(12 h/12 h)的光照条件。保证所有动物具有充足的饮用水及饲料。

实验方案经海南省中医院医学科研伦理审查委员会批准，伦理编号：201805261。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   主要试剂和仪器   柚皮素(上海古朵生物科技有限公司)；二甲基亚砜(Sigma公司，德国)；戊巴比妥钠(上海思域化工科技有限公司)；白细胞介素4、白细胞介素13、干扰素α、干扰素γ检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；Trizol(生工生物工程股份有限公司)；PrimeScript™RT试剂盒、SYBR® PrimeScript™ RT-PCR试剂盒(Takara公司，日本)；anti-F4/80、anti-CD68、anti-CD206抗体(Abcam公司，美国)；鼠标anti-Pax7、鼠标anti-MyoD1(DAKO公司，丹麦)。7500 Fast PCR仪(Abcam公司，美国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   分组及建模   采用随机数字表法对大鼠进行分组，将80只SD大鼠雌雄各半分别进行编号，在随机数字表中随机确定抽样的起点和抽样的顺序，依次抽出号码，分为实验组(骨骼肌损伤+柚皮素处理)和对照组(骨骼肌损伤+二甲基亚砜处理)，每组40只，雌雄各半。

两组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，将右后肢放置于木板上，伸直膝关节和向后弯曲脚踝至90°的俯卧姿势。将1 kg砝码于24 cm处垂直落于腓肠肌中部区域，撞击点距右后肢跟骨20 mm，能量为2.35 J，打击面积为1 cm2。确保皮肤完整，无骨折，目视可见肿胀充血现象，说明骨骼肌损伤模型制备成功[10]，见图1。 

1.4.2   各组处理及取材   造模后实验组腹腔注射柚皮素溶液，将柚皮素溶解于1% 二甲基亚砜溶液中，溶解后柚皮素含量为20 mg/kg，注射量为2 μg/g，每天注射1次，共注射14 d；对照组腹腔注射等剂量1%二甲基亚砜。分别于伤后12 h及1，3，5，7，14 d，两组各取6只大鼠，采用麻醉剂过量的方式处死大鼠并取腓肠肌后进行观测。每组各剩余4只大鼠为实验过程中的备用鼠，当14 d结束后前期无动物异常死亡的现象该4只样本纳入14 d的生物学指标检测。
1.4.3   组织学观察   取不同时间点大鼠腓肠肌组织进行固定和石蜡包埋，石蜡块切片，每片厚4 μm，进行后续染色。

(1)Masson 染色：取各组部分切片进行60 ℃烤片2 h，二甲苯Ⅰ10-15 min，二甲苯Ⅱ10-15 min，无水乙醇Ⅰ10 min，无水乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇5 min，85%乙醇2 min，75%乙醇 2 min，60%乙醇 2 min，蒸馏水5 min清洗。染色采用Bouin液固定10-15 min，Harris苏木素染色4.0-5.0 min，流水冲洗2 min，0.5%盐酸乙醇分化10-30 s，流水冲洗5 min，Masson复合染色液4.0-5.0 min，0.2%醋酸水溶液稍冲洗，5%磷钼酸分化5-10 min，0.2%醋酸水溶液稍冲洗，2%苯胺蓝溶液10-30 s，自然晾干，中性树胶封固。使用Image J软件划定纤维化区域，计算纤维化面积与总横截面积比值，评估纤维化程度。

(2)苏木精-伊红染色：取各组部分切片采用相同方式处理后进行苏木素染色3 min，自来水5-10 min冲洗；蒸馏水冲洗1遍；0.5%盐酸乙醇约20 s，自来水冲洗30 s ；蒸馏水过洗1 min；1%伊红染色2 min，蒸馏水过洗1 min后在光镜下观察各组肌肉组织形态，确定肌纤维再生的数目，中心有核肌管细胞(骨骼肌再生标志)被认为是肌纤维再生的标志[11]。每张切片随机取10个视野，使用Image J软件计数再生肌纤维。
1.4.4  ELISA检测炎症因子表达  取不同时间点两组腓肠肌部位标本，按照ELISA试剂盒说明书检测炎症因子白细胞介素4、白细胞介素13、干扰素α、干扰素γ表达。所有实验均独立进行3次重复，所有实验均以12 h处理后的对照组和实验组作为参考采用相对定量的方式进行展示。
1.4.5   实时荧光定量PCR检测腓肠肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及MyoD的mRNA表达   取不同时间点两组腓肠肌部位标本，采用Trizol从标本中提取总RNA，使用PrimeScript™RT试剂盒将RNA反转录成cDNA后行实时荧光定量PCR，引物序列见表1。采用SYBR® PrimeScript™ RT-PCR试剂盒进行PCR扩增程序：95 ℃2 min，95 ℃15 s 40个周期，退火/延伸(60 ℃ 20 s)40个周期。所有实验均以12 h处理后的对照组和实验组作为对照采用相对定量的方式进行展示，内参基因为GAPDH。

1.4.6   流式细胞术检测巨噬细胞极化程度   取不同时间点两组腓肠肌部位标本，用胶原酶、酶解酶、胰蛋白酶消化组织基质，分离细胞。碎片通过70 μm过滤器后，置于4 ℃孵化30 min后用anti-F4/80标记巨噬细胞，anti-CD68标记M1巨噬细胞，anti-CD206标记M2巨噬细胞。采用流式细胞仪检测每5 000个中性粒细胞中M1和M2巨噬细胞表型计数。
1.4.7   免疫荧光染色观察   取两组大鼠挫伤后3 d腓肠肌部位标本，采用微波加热Tris-EDTA缓冲液(pH 9.0)中的肌肉切片进行抗原修复。将肌肉切片用PBS洗涤，用0.5% Triton X-100渗透15 min。将切片加入封闭缓冲液在室温下1 h，然后在4 ℃下与一抗(鼠源)孵育过夜。切片清洗后与二抗(鼠源)在室温下孵育1 h。以下主要使用抗体：鼠标anti-Pax7(1∶100，红色)，鼠标anti-MyoD1 (1∶100，绿色)，DAPI用于细胞核染色(蓝色)。镜下取6个视野，采用imag J软件，计数Pax7-/MyoD+、Pax7+/MyoD+、Pax7+/MyoD-阳性细胞数(其中PAX7是静止卫星细胞的标记物，而MyoD是活化增殖的卫星细胞标志物)。
1.5   主要观察指标   ①大鼠腓肠肌组织学观察；②腓肠肌炎症因子表达；③腓肠肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及MyoD的mRNA表达；④巨噬细胞极化程度；⑤肌卫星细胞增殖情况。
1.6   统计学分析   采用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据进行正态性检验，符合正态分布的数据采用x±s表示；组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。研究统计方案已经通过海南省中医院生物统计学专家审核，符合统计学要求。

肌肉挫伤是运动医学常见的肌肉损伤之一。初始阶段表现为损伤部位局部肿胀、血肿坏死、变性和炎症反应[1-2]；下一个阶段是损伤后5-10 d损伤组织的吞噬作用和损伤肌肉的再生[3]；最后阶段的纤维化是肌肉修复的最终结果，这也阻碍了肌肉的完全再生。常见损伤的治疗多为热敷或局部针灸治疗，虽能促进损伤的恢复但治疗手段单一且受到不同针灸手法对疗效影响的限制。因此，寻求有效的药物治疗骨骼肌损伤受到人们关注。

研究证实柚皮素能够治疗小鼠骨骼肌的急性顿挫伤，并通过对SMAD3抑制的途径削弱纤维化调控通路，从而减轻纤维化[19]。此次研究结果显示，实验组大鼠在纤维化面积和再生肌细胞数量上均得到明显改善。MyoD是影响肌肉再生的主要调节因子[21]，其是在活化和增殖的卫星细胞中表达的，而pax7是静止的卫星细胞标志物[22-23]。它们对于卫星细胞的增殖和分化以及骨骼肌的再生都是必要的，通过对这两种指标的检测能够反映出机体内肌卫星细胞增殖分化的情况。此次研究发现实验组大鼠卫星细胞的增殖和活化均高于对照组，这与之前的研究一致[22-24]，肌肉纤维化和肌肉再生纤维的检测结果与预期的疗效一致，这表明柚皮素能够对骨骼肌的损伤修复产生促进作用。Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的基因为促纤维化基因，它们通过调控纤维化的进程影响损伤组织的纤维化[25]。此次研究对各组不同时点的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白进行检测发现，实验组Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的基因表达量显著低于对照组，提示柚皮素可以提高骨骼肌损伤后肌纤维再生能力，并且在一定程度上控制过度纤维化。

目前研究表明，巨噬细胞在损伤的骨骼肌中发挥重要作用，可能参与骨骼肌再生的不同阶段[7-8]。M1型巨噬细胞通过产生促炎性细胞因子促进肌肉损伤，而M2型巨噬细胞能够释放抑炎性细胞因子参与损伤修复并促进肌卫星细胞增殖分化[26-28]。因此，巨噬细胞极化在骨骼肌再生中起着重要作用。白细胞介素4和白细胞介素13已被发现可诱导M2型巨噬细胞的极化[29]。此次研究显示，损伤发生后M1型巨噬细胞数量持续增加，直至损伤后第3天下降，而实验组M1型巨噬细胞的生长速度和数量均低于对照组，这些数据表明在损伤初期两组均出现明显的炎症反应，但柚皮素能够一定程度抑制这种免疫反应。目前研究表明干扰素γ能促进M1型巨噬细胞的分化导致早期的炎症反应[30-34]。M2巨噬细胞能够分泌包括白细胞介素4和白细胞介素13细胞因子刺激组织恢复和伤口愈合[8，35-38]。此次研究结果显示，柚皮素处理组的白细胞介素4和白细胞介素13分泌明显高于对照组，从而增加M2型巨噬细胞的数量进而促进损伤修复。进一步通过免疫荧光对Pax7和MyoD进行染色发现，实验组大鼠的肌卫星细胞增殖显著高于对照组且差异有显著性意义，这一结果验证了作者的猜想。尽管研究的数据已经发现柚皮素对骨骼肌损伤的治疗作用，但这一疗效仅在动物实验中得到证实，并不清楚这一机制在临床样本中是否同样发挥作用。因此还需要进一步临床人群数据的佐证，这也将成为深入研究的方向之一。此外，关于柚皮素调控巨噬细胞极化的深入机制仍需进一步探讨，这将对未来的靶向治疗提供很好的方向。

综上所述，此次研究通过对巨噬细胞极化的机制探讨，发现柚皮素治疗骨骼肌损伤可能通过巨噬细胞极化调控炎症因子的表达进而减少骨骼肌纤维化的生成，达到治疗骨骼肌损伤的目的。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
柚皮素(naringenin)：是从葡萄柚中提取的一种成分，具有抗炎、抗纤维化、保护血管内皮细胞等作用，最新研究显示其能改善骨骼肌损伤修复中过度纤维化。
骨骼肌损伤：属于软组织损伤，在临床比较常见，多数为剧烈运动后导致，通过临床查体和核磁共振即可明确诊断。骨骼肌损伤的症状为肿胀、疼痛、肌肉紧张、痉挛、僵硬、硬结，甚至会出现皮下淤青、按压时疼痛明显加重、受伤肌肉活动受限、拉伸时疼痛加剧等现象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

急性骨骼肌损伤常因过度修复影响肌肉的正常愈合和功能恢复，因此寻找骨骼肌损伤的治疗药物和治疗机制是骨骼肌损伤治疗的当务之急。 

研究证明肌肉损伤会引起损伤部位大量巨噬细胞浸润并参与到骨骼肌损伤修复的纤维化进程调控中发挥作用，目前关于巨噬细胞极化对炎症因子表达的影响受到广泛关注。研究显示肌卫星细胞增殖及分化在骨骼肌损伤修复中扮演重要角色，因此深入探讨肌卫星细胞的增殖机制在骨骼肌损伤治疗药物开发中是必不可少的一个环节。 柚皮素是从葡萄柚中提取的一种成分，具有抗炎、抗纤维化、保护血管内皮细胞等作用，最新研究显示其能改善骨骼肌损伤修复中过度纤维化。柚皮素能否治疗骨骼肌损伤及其对巨噬细胞极化的调控作用尚无研究报道。因此，该研究通过构建骨骼肌损伤模型，探讨柚皮素对巨噬细胞极化方向及肌卫星细胞增殖的作用，为骨骼肌损伤的治疗提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程