2.1   人胚胎干细胞恒定表达分泌MIF   随着培养时间的增加，光镜下可见人胚胎干H1和H9系细胞数量随之增多，细胞间隙变小，形态较前无变形，镜下可见有少量漂浮死亡细胞，各孔细胞生长状态良好。H1和H9系细胞计数显示在24，48，72 h细胞数量呈指数增长(P < 0.001，P < 0.000 1)，同一时间不同系之间细胞数量相似，无明显差异(P > 0.05)。ELISA检测结果显示培养基中MIF水平相对恒定，并没有呈现细胞数量依赖性，H1和H9系之间也并无显著差异(P > 0.05)，见图1，表1。







2.2   胚胎干细胞相关因子的表达   免疫荧光染色结果如图2所示，DAPI染胞核呈蓝色荧光，绿色荧光的深浅表示胚胎干细胞中MIF的表达水平，绿色越深，分布越密集，表明MIF表达水平越高，红色荧光的深浅表示MIF相关受体CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7在胚胎干细胞中的表达水平，红色越深，分布越密集，表明相关受体表达水平越高。在胚胎干细胞上呈现绿色强荧光，细胞膜和细胞质都有分布，其中胞膜分布密集，胞质分散稀疏，表明MIF在细胞膜表达水平较高。CXCR2和CXCR7的红色荧光较强，表明胚胎干细胞上高表达这2种MIF受体，CD74、CD44、CXCR4的荧光强度明显较弱，表明这些受体表达水平较低。H9细胞相关蛋白Western blot检测结果显示，与内参相比，MIF、CXCR2、CXCR7表达量较高，而CD74、CD44、CXCR4的表达量明显偏低，见图3。







2.3   MIF与其受体的相互作用    为验证MIF与受体CXCR2、CXCR7相互作用情况，实验首先以MIF抗体为诱饵蛋白，使用免疫共沉淀方法检测其是否能沉淀CXCR2、CXCR7蛋白，Western blot实验结果显示MIF成功沉淀CXCR7蛋白，见图4A。没有发现MIF可以沉淀CXCR2的证据，见图4B。为反向验证MIF和CXCR7具有相互作用，以CXCR7抗体为诱饵蛋白，使用免疫共沉淀方法检测其是否能沉淀MIF，Western blot实验结果显示CXCR7成功沉淀MIF蛋白，见图4C。

将鼠源MIF抗体和兔源CXCR7抗体分别孵育鼠源和兔源的荧光二抗，通过荧光显微镜可见H9细胞上MIF和CXCR7分别激发绿色和红色荧光，细胞核通过DAPI染色后激发蓝光荧光，最后应用 Photoshop 软件对3张不同颜色的荧光图片进行叠加，组合后的图片可见MIF与CXCR7表达位置重复，说明两种蛋白存在共定位，见图5A，另外，将组合图片进行荧光定量分析(图中箭头所示)，发现MIF在H9细胞胞膜、胞质均表达，CXCR7主要在胞膜表达，这在空间上为2种蛋白的互作提供了可能，见图5B。



2.4   ISO-1对H9细胞活性的影响   与空白组相比，随着ISO-1浓度(12，24，48，96，192 μmol/L)的增加，光镜下H9细胞数目明显减少，间隙明显增大，利用CCK-8法检测细胞活性，其活性明显降低(P < 0.000 1)，并伴随一定的剂量依赖性，见表2。当ISO-1浓度为192 μmol/L时，与空白组相比其细胞活性为51.78%左右，故在随后的实验中使用其作为合适的抑制剂量。



2.5   ISO-1对H9细胞凋亡的影响   与空白组相比，随着ISO-1浓度(12，48，192 μmol/L)的增加，细胞凋亡率明显增加(P < 0.01)，并伴随一定的剂量依赖性，见图6，表3。







2.6   MIF对ISO-1诱导的H9细胞活性的影响   与ISO-1(192 μmol/L)组相比，在加入不同质量浓度的MIF(30，100，300 μg/L)共孵育24 h后，CCK-8法检测结果显示MIF干预组细胞活性显著提高(P < 0.05)，见表4。



2.7   MIF对ISO-1诱导的H9细胞凋亡的影响   与ISO-1(192 μmol/L)组相比，在加入不同质量浓度的MIF(30，100，300 μg/L)共孵育24 h后，TUNEL法检测结果显示细胞凋亡率显著减少(P < 0.01)，表现出一定的剂量依赖性，见图7，表5。

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胚胎干细胞来源于哺乳动物胚泡的内部细胞团[1]，研究人员在1998年对人类胚胎干细胞进行了首次报道[2]。胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化潜能，可以分化成除胎盘以外的所有体细胞类型[3]，在体外适当的培养条件下，未分化的胚胎干细胞可以分化为所有3个胚层，包括内胚层、中胚层和外胚层[1]，这使胚胎干细胞在再生医学、组织工程和细胞治疗方面展现了巨大的应用潜力[4]。胚胎干细胞的有效应用需要大量存活的胚胎干细胞，因此探索研究影响胚胎干细胞增殖存活的潜在分子和信号通路是十分必要的。

巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)最初是从培养的T淋巴细胞上清液中分离出来的细胞因子，能够抑制巨噬细胞的随机迁移[5]。MIF是一种古老的细胞因子，结构保守，分子质量为12.5 kD[6]，在大鼠、小鼠、鸡、牛和人类之间有约80%的同源性[7]。MIF由多种类型细胞产生，如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞、内皮细胞、上皮细胞和神经元细胞[7]。另外，研究还发现在许多癌症组织中MIF的表达升高，包括鳞癌、胶质母细胞瘤、宫颈腺癌、恶性黑色素瘤、鼻咽癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌[8-11]。MIF通过受体CD74、CD44、CXCR2、CXCR4和CXCR7以自分泌和旁分泌方式发挥其生物学功能[12-16]，这可能触发多种途径的激活，包括MAPK-ERK和PI3K-Akt途径，并最终通过关键信号通路NF-κB促进促炎细胞因子和细胞周期调节因子表达所需的转录因子的激活，促进细胞迁移、增殖和存活[17-21]。MIF还可以与细胞内的一些蛋白进行结合，激活相关下游因子和信号通路发挥作用，其中最主要的结合蛋白有c-Jun激活域结合蛋白JAB1/CSN5、核苷二磷酸激酶A(NME1)相关产物NM23-H1和硫氧蛋白相互作用蛋白(TXNIP)[22]。另外，MIF可以下调自噬[23-24]，提高衰老细胞的存活率。研究还发现，MIF能够调节多种干细胞的增殖和分化，包括神经干细胞、心脏干细胞、软骨终板干细胞和脂肪源性干细胞[25-27]。

尽管MIF在多种细胞中表达并且参与多种重要的细胞功能，但是其对胚胎干细胞的影响却鲜有报道。该研究探索人胚胎干细胞是否表达MIF及其相关受体，确定哪种受体与MIF相互作用，初步探索MIF对人胚胎干细胞增殖存活的影响，为人胚胎干细胞的有效应用提供基础实验支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   细胞分子生物学体外实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
1.2   时间及地点   实验于2019年9月至2021年8月在海南省热带脑科学研究与转化重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞、试剂   人胚胎干细胞H1系(中国科学院干细胞库，中国，SCSP-306)，H9系(中国科学院干细胞库，中国，SCSP-307)；mTeSR™1培养基(STEM CELL，加拿大)；重组人MIF(Merck，德国)；重组人ISO-1(Merck，德国)；CCK-8试剂盒(白鲨，中国)；人MIF酶联免疫吸附测定试剂盒(江莱生物，中国)；兔抗人CD74单克隆抗体、兔抗人CD44单克隆抗体、兔抗人CXCR2多克隆抗体、兔抗人CXCR4单克隆抗体、山羊抗鼠488、山羊抗兔594(Abcam，英国)；鼠抗人MIF单克隆抗体、鼠IgG、protein A/G PLUS-Agarose(Santa cruze，美国)；山羊抗兔、山羊抗鼠(武汉三鹰，中国)；兔IgG(碧云天，中国)；BCA蛋白定量检测试剂盒(塞维尔，中国)；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(碧云天，中国)；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)(碧云天，中国)。
1.3.2   实验仪器   CO2培养箱(ESCO，新加坡)；BDS400倒置生物显微镜(重庆奥特光学，中国)；SC-3612低速离心机(安徽中科中佳，中国)；5811GK781515低温高速离心机(Eppendorf，德国)；酶标仪(Bio Tek，美国)；天能化学发光凝胶成像系统Tanon-5500Multi(上海天能，中国)；NIKON Eclipse Ti倒置显微镜(NIKON，日本)。
1.4   实验方法   
1.4.1   ELISA检测人胚胎干细胞培养上清液中MIF水平   倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的胚胎干H1(27代)和H9(22代)细胞，以5×104个/孔分别接种于12孔板，并各设2个复孔，每孔1 mL培养体系，每天同一时间更换新鲜培养基，并分别于24，48，72 h取出不同细胞系各1孔进行细胞计数，同时吸取培养上清，使用ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中MIF水平。
1.4.2   免疫荧光实验检测人胚胎干细胞H1和H9系中MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7蛋白表达   取出24孔细胞培养板，分为H1和H9两组，每组6孔，并各设1个复孔，放置细胞爬片，每孔加入Matrigel工作液300 μL包被，放置于37 ℃培养箱至少1 h。倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的胚胎干H1(27代)和H9(22代)细胞，以4×104个/孔接种于对应包被好的24孔板中，6 h后弃上清，PBS漂洗2次，用40 g/L多聚甲醛冰上孵育15 min，预冷的PBST漂洗3次，加300 μL封闭液孵育30 min，使用一抗(MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7)4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，二抗室温孵育2 h，PBS漂洗3次；加入DAPI染色液，覆盖住细胞孵育5 min，封固、晾干后，荧光显微镜观察。
1.4.3   Western blot实验检测人胚胎干H9系细胞中MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7蛋白表达   倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的胚胎干H9(24代)细胞，以4×105个/孔接种于6孔板中，每孔2 mL，正常培养3 d后收集细胞，细胞计数至少106个，RIPA高效裂解液提取细胞中的总蛋白，依据BCA蛋白定量试剂盒操作说明测量蛋白浓度。用移液枪准确加入相同质量的蛋白于压缩胶中，根据不同蛋白分子质量大小确定电压和电流条件，120 V电压分离一段时间，转移至PVDF膜上，以250 mA恒定电流转膜90 min，用封闭液封闭，加入一抗(MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7)4 ℃摇床上孵育过夜，第2天回收一抗，加入二抗，最后显影曝光测定抗体表达，应用Image J软件分析各组蛋白相对含量。
1.4.4   免疫共沉淀(Co-IP)分析MIF与其受体的结合情况   实验分为3组：阳性对照组(input组)、阴性对照组(IgG组)、目的蛋白检测组(IP组)，倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的胚胎干H9(26代)细胞，以4×105个/孔接种于6孔板中，每孔2 mL，正常培养3 d后收集细胞，细胞计数至少107个，加入适量含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞免疫沉淀裂解缓冲液，提取细胞中的总蛋白；依据BCA蛋白定量试剂盒操作说明测量蛋白浓度；取少量上清液变性后用于阳性对照(input)实验，即Western blot检测靶蛋白表达；向阴性对照(IgG)组蛋白上清液中加入1.0 μg IgG(与目的蛋白检测沉淀抗体种属来源相同的普通IgG)和20 μL protein A/G珠子(使用前充分混匀)，目的蛋白检测组直接加入20 μL protein A/G珠子，4 ℃摇转孵育1 h，离心，取上清；加入2 μg抗体，然后4 ℃孵育过夜；加入80 μL protein A/G珠子(使用前充分混匀)，4 ℃孵育2 h；4 ℃，2 000×g离心5 min，小心吸去上清，收集免疫沉淀复合物；将免疫沉淀复合物用1 mL预冷的免疫沉淀裂解液洗涤4次，4 ℃，2 000×g离心5 min，每次洗涤小心弃去上清；最后一次洗涤之后，尽可能的吸去上清液，然后加入80 μL 2×还原型上样缓冲液，沸水煮10 min， 4 ℃，1 000×g离心5 min，取上清，用Western blot实验检测目的蛋白的表达。
1.4.5   免疫荧光共聚焦显微镜分析MIF与胚胎干细胞表面受体的结合   取出24孔细胞培养板，设置实验孔和对应复孔，放置细胞爬片，每孔加入Matrigel工作液300 μL包被，放置于37 ℃培养箱至少1 h。倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的胚胎干H9(23代)细胞，以4×104个/孔接种于包被好的24孔板中，6 h后弃上清，PBS漂洗2次，用40 g/L多聚甲醛冰上孵育15 min，预冷的PBST漂洗3次，加300 μL封闭液孵育30 min，对应实验孔中加入MIF和CXCR2的混合一抗及MIF和CXCR7的混合一抗，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，加入混合二抗室温孵育2 h，PBS漂洗3次；加入DAPI染色液，覆盖住细胞孵育5 min，封固、晾干后，荧光共聚焦显微镜观察。
1.4.6   CCK-8法检测细胞活性   倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的H9细胞，以 6×103个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，待24 h后细胞达到70%左右融合，弃旧培养基，每孔加入mTeSR™1培养基配制的不同浓度的MIF抑制剂ISO-1(0，12，24，48，96，192 μmol/L)干预处理24 h后置于倒置光学显微镜下观察细胞生长状态。CCK-8法检测细胞活性：每孔加入10 μL CCK-8检测液，于
37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱孵育2.5 h后，用酶标仪检测吸光度值(450 nm)。

收集处于对数生长期的H9细胞，以6×103个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，待24 h后细胞达到70%左右融合，弃旧培养基，予以不同质量浓度MIF(30，100，300 μg/L)与ISO-1(192 μmol/L)共孵育24 h，置于倒置光学显微镜下观察细胞生长状态。CCK-8法检测细胞活性：每孔加入10 μL CCK-8检测液，于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱孵育2.5 h后，用酶标仪检测吸光度值(450 nm)。细胞活性(%)=(实验组吸光度值-实验调零组吸光度值)/(空白组吸光度值-空白调零组吸光度值)×100%。 
1.4.7   TUNEL法检测细胞凋亡   取24孔细胞培养板，设置6孔试验孔，并各设1个复孔，放置细胞爬片，每孔加入Matrigel工作液300 μL包被，放置于37 ℃培养箱至少1 h。倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的胚胎干H9(23代)细胞，以5×104个/孔接种于对应包被好的24孔板中，每孔500 μL，待细胞长至70%左右融合，弃旧细胞培养基，每孔加入mTeSR™1培养基配制的不同浓度的ISO-1(0，12，24，48，96，192 μmol/L)干预处理24 h，弃旧细胞培养基，加入40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗3次，加入含0.3% Triton X-100的PBS室温处理15 min，PBS清洗3次，加入TUNEL检测液50 μL避光孵育1 h，PBS清洗3次，加入DAPI染色液200 μL避光孵育10 min，弃上清，PBS清洗3次，加入10 μL抗荧光淬灭剂，倒置荧光显微镜观察、拍摄照片。

取24孔细胞培养板，设置4孔试验孔，并各设1个复孔，放置细胞爬片，每孔加入Matrigel工作液300 μL包被，放置于37 ℃培养箱至少1 h。倒置相差光学显微镜下观察细胞生长状态，收集处于对数生长期的胚胎干H9(23代)细胞，以5×104个/孔接种于对应包被好的24孔板中，每孔500 μL，待细胞长至70%左右融合，弃旧细胞培养基，予以不同质量浓度MIF(30，100，300 μg/L)与ISO-1(192 μmol/L)共孵育24 h，弃旧细胞培养基，加入40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗3次，加入含0.3% Triton X-100的PBS室温处理15 min，PBS清洗3次，加入TUNEL检测液50 μL避光孵育1 h，PBS清洗3次，加入DAPI染色液200 μL避光孵育10 min，弃上清，PBS 清洗3次，加入10 μL抗荧光淬灭剂，倒置荧光显微镜观察、拍摄照片。使用Image J软件计算细胞凋亡率。
1.5   主要观察指标   ①人胚胎干细胞培养上清液中MIF水平；②人胚胎干细胞中MIF、CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7蛋白表达水平；③MIF与其受体的相互作用；④MIF抑制剂 ISO-1对人胚胎干细胞H9系细胞活性和细胞凋亡的影响。
1.6   统计学分析   采用GraphPad Prism 8.0.2分析软件统计，所有实验数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)。文章统计学方法已经通过海南医学院第一附属医院统计学专家审核。

先前的研究表明，MIF是一种具有多效性作用的细胞因子，由多种器官和细胞类型产生，其中包括神经干细胞、心脏干细胞、软骨终板干细胞和脂肪源性干细胞。MIF以自分泌和旁分泌方式发挥其生物学功能。MIF主要通过结合受体CD74、CD44、CXCR2、CXCR4、CXCR7以及通过直接结合胞内相关蛋白参与生物过程的调节功能，如增殖、迁移、凋亡和细胞周期进程。然而，尚未发现有关胚胎干细胞表达分泌这一重要细胞因子的报道，缺乏MIF对胚胎干细胞相关生物学功能的研究。因此，这是首次研究MIF及其受体在人胚胎干细胞中的表达分泌及相互作用情况，并初步探索了MIF对人胚胎干细胞增殖存活能力的影响。

如前所述，MIF是一种古老的细胞因子，正常生理条件下，MIF在哺乳动物中广泛表达，存在于多种细胞类型中，包括免疫、神经、循环、泌尿和消化系统的细胞，而且在一些肿瘤细胞和干细胞中也存在这种细胞因子，影响多种生物进程。有研究表明，胚胎期MIF缺乏将会严重影响呼吸系统的正常发育，出现呼吸功能障碍，降低胎儿存活率[28-29]。另外，MIF可以调节多种干细胞的增殖和分化。该研究结果显示人胚胎干细胞恒定表达分泌这一重要的细胞因子，不会随着细胞量的增多而分泌量增加，它对细胞的作用维持在一个合适的浓度，这说明MIF的表达分泌存在生理性调节机制。先前研究显示，MIF的表达和分泌完全取决于细胞类型和刺激[30]，另外，MIF水平与孕酮受体呈显著的相关性[31]，这可能是调节MIF在胚胎干细胞中恒定表达的关键因素。健康个体MIF的血清水平在0.2-8.3 μg/L范围内[30]，而胚胎干细胞培养上清液中的质量浓度维持在22.21 μg/L左右。胚胎干细胞所处的局部环境是胚胎干细胞培养上清液中MIF高水平表达的主要原因之一。胚胎干细胞作为生命个体发育的原始细胞显著表达分泌这种细胞因子，这充分说明MIF参与了重要的细胞生物活动，是生命进程中的重要细胞因子。MIF的恒定表达维持正常的细胞生理活动，MIF水平的明显波动可能成为一些复杂妊娠疾病的关键生物标志物和严重程度的预测因子。

研究发现MIF在细胞质中定位，而不是细胞的颗粒中，这意味着MIF因子存在非常规的分泌机制。在细胞质中，MIF储存在囊泡状结构中[32]，并在多种刺激下分泌，包括脂多糖[33]、缺氧等[34]，大多数分泌蛋白编码一个16-30个氨基酸残基序列，该序列引导蛋白质从内质网移位到高尔基体和分泌囊泡[35]，但在内质网或高尔基体中未发现MIF定位[36]，这说明MIF参与了非常规的分泌途径。目前，关于MIF分泌的确切机制还不清楚，但可以肯定的是MIF存在于细胞质中，该研究结果也同样发现胚胎干细胞的细胞质中存在MIF的表达，这说明MIF在胚胎干细胞和其他类型细胞中存在同样的分泌方式，囊泡转运因子p115和ATP结合盒转运体可能与MIF的分泌有关[37]。

MIF与5种受体结合，包括CD74、CD44、CXCR2、CXCR4和CXCR7。CD74似乎在所有MIF受体复合物中起着关键作用，因为CD74敲除或应用抗CD74抗体可消除表达CD44、CXCR2、CXCR4或CXCR7细胞中的MIF效应。然而，作者发现在胚胎干细胞中没有明显表达这一重要受体以及CD44和CXCR4受体，而是主要表达了受体CXCR2和CXCR7，CXCR2的表达主要局限于中性粒细胞和内皮细胞[38]，这是首次发现CXCR2在人胚胎干细胞中高表达，而先前研究表明，CXCR2需要与CD74结合才能正常发挥作用[19]，作者的研究结果与此一致，即在胚胎干细胞中MIF并不与CXCR2发生作用，这可能和胚胎干细胞的CD74受体缺乏有关，但是胚胎干细胞中高表达的CXCR2受体是否与其另一个亲和配体CXCL8相互作用，这还需要进一步的探索。CXCR7广泛表达于造血细胞系、内皮细胞和神经细胞[39]。该研究也首次发现CXCR7受体高表达于胚胎干细胞。一份报告表明，MIF仅通过CXCR7激活PI3K-AKT途径发挥作用[40]，该研究结果也再次证实了这一点，即在胚胎干细胞中MIF可以单独和受体CXCR7相互作用，而不需要经典的共受体CD74，这进一步说明CXCR7受体的独立性以及对MIF作用发挥的至关重要性，这仍值得进行广泛深入的研究。

MIF最重要的作用之一是具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的能力[41-42]。ISO-1经常作为MIF的标准抑制剂，可抑制MIF的互变异构酶活性，也可阻止MIF与其表面受体的结合，从而阻断MIF诱导的信号级联[43]。该研究使用不同浓度的ISO-1孵育细胞，发现ISO-1可以减少人胚胎干细胞增殖，促进细胞凋亡，这表明抑制MIF将会显著抑制细胞的增殖活性。进一步用ISO-1和不同质量浓度的MIF共同孵育细胞，可以看到细胞活力明显增强，凋亡细胞减少，存在MIF的浓度依赖性，因此，MIF支持胚胎干细胞的增殖存活，这充分说明内源性MIF的表达是胚胎干细胞生长存活所必须的。

MAPK-ERK和PI3K-Akt信号通路对胚胎干细胞的增殖和自我更新十分重要，MAPK-ERK可以通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Mek和Erk来调节细胞周期进展、增殖、分化和癌变，从而介导生长因子的作用[44-45]。AKT信号通路除了在控制细胞代谢和肿瘤发生中的关键作用外，该因子还在许多生理功能中发挥作用，主要是细胞周期、死亡、黏附和迁移[46]。已经确定PI3K因子是胚胎干细胞增殖和生长动态的调节因子[47]，PI3K-Akt轴在胚胎干细胞自我更新中具有重要作用[48]。用PI3K抑制剂LY294002可以抑制细胞增殖并促使细胞周期停滞在G1期[49]。AKT通过触发细胞周期蛋白复合物的形成，调节控制细胞周期的PI3K/AKT轴，从而刺激胚胎干细胞从G1期进入S期[50]。MIF可与多种细胞表面分子相互作用，研究最为广泛的是CD74，它与CD44形成复合物，进而激活MAPK-ERK和PI3K-Akt信号通路[51-52]。此外，MIF与CXCR7相互作用，在人类B细胞系中与CXCR4和CD74形成受体复合物，用CXCR7中和抗体可通过Erk和zeta链相关蛋白激酶(ZAP)70抑制MIF介导的信号传导[20]。研究也发现，MIF仅通过CXCR7激活PI3K-AKT途径[40]，在胚胎干细胞中CD74和辅助受体弱表达，而且已经证实MIF和CXCR7存在相互作用，因此，作者认为在胚胎干细胞中MIF和重要的膜受体CXCR7相互作用，激活PI3K/Akt信号通路从而对细胞增殖产生影响，具体机制仍需进一步探索。

总之，胚胎干细胞以自分泌和旁分泌的形式产生MIF，在胚胎干细胞中CXCR7受体是MIF发挥作用的关键受体，MIF对胚胎干细胞的增殖存活发挥关键作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
胚胎干细胞：来源于囊胚期胚胎的内部细胞团，可以进行自我更新而其核型和功能保持不变，能够在体内和体外分化为任何体细胞系，由于这些特点，胚胎干细胞成为干细胞研究的重要模型，是建立哺乳动物早期发育、细胞替代治疗和组织再生体外模型的独特系统，并应用于药物开发。
巨噬细胞迁移抑制因子：是一种多功能细胞因子，由多种细胞类型产生，影响多种生物学过程，如增殖、迁移、凋亡和细胞周期进程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

胚胎干细胞具有无限增殖和多潜能性，在帮助理解细胞发育、药物研发、疾病治疗方面具有巨大潜力，探索发现影响人胚胎干细胞增殖存活的潜在分子，将极大推动人胚胎干细胞的有效应用。研究发现，巨噬细胞迁移抑制因子在多种干细胞中都有表达，能够显著影响细胞的增殖和分化，人胚胎干细胞同样表达这一重要的细胞因子，在维持细胞增殖存活方面发挥重要作用，这将为人胚胎干细胞的有效应用提供帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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