2.1   基因治疗中的成血管种子细胞   基因治疗中促血管化的最基础的种子细胞主要包括：间充质干细胞、内皮细胞和内皮祖细胞。间充质干细胞主要以两种方式实现促组织再生和血管化：在各种因素如基质蛋白、可溶性因子、循环应变、支架等诱导下可塑性地分化为特定类型的功能细胞如成骨细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，直接参与组织修复[21-23]；通过旁分泌机制激活外周受体细胞，参与细胞通讯、细胞迁移、毛细血管发芽，间接参与组织血液循环重建过程[24-25]。因此将各类生长因子基因如骨形态发生蛋白2、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血管生成素1、肝细胞生长因子、缺氧诱导因子1α等导入间充质干细胞以构建体内工程化移植物，可以显著放大上述能力[26]，在增强间充质干细胞活性的同时提高了其治疗能力，加速了血管化进程[27-31]。
内皮细胞虽然直接参与构成血管，但单一的内皮细胞在基本培养条件下会较快退化，只有在各种血管生成促进剂如碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和大量胎牛血清等存在的条件下才能观察到血管生成，这恰好为基因治疗的引入提供了用武之地，加之内皮细胞的自分泌作用方式和直接释放基因产物于血管腔内的特点，内皮细胞成为血管化基因治疗中十分有吸引力的种子细胞[32]。研究人员发现当血管内皮生长因子165基因导入内皮细胞后，内皮细胞不仅保持了其固有特性，还表现出良好的增殖和迁移潜能，明显增加了鼠缺血皮瓣中的毛细血管密度[33]。
内皮祖细胞不仅具有分化成毛细血管壁的潜力，也能表达诱导血管生成和组织重塑的分泌因子来促进新血管生成和组织修复[34]，与基因修饰技术结合后更是展现出巨大的应用潜力。王娟[35]将转染了血管内皮生长因子164基因的内皮祖细胞移植入脑缺血的大鼠侧脑室中，发现基因修饰后的内皮祖细胞通过HIF-VEGF和SDF-1/CXCR4信号路径促进了鼠脑缺血区的血管新生。薛建新等[36]发现将过表达血管内皮生长因子165基因的内皮祖细胞移植入肾缺血再灌注损伤模型后，该内皮祖细胞不仅在归巢后旁分泌过量血管内皮生长因子，而且进一步促进了血管生成素1、血管生成素2等血管新生因子的表达，从而促进了肾血管新生。汪砚雨[37]也通过研究发现，经过人血管内皮生长因子165基因转染的大鼠内皮祖细胞对血管再生有明显促进作用，并减少了心肌细胞坏死率。
2.2   基因治疗中的促血管化目的基因   血管内皮生长因子、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2、缺氧诱导因子1α由于各自显著的作用效果，从众多促血管化因子中脱颖而出，在组织工程血管化中备受青睐。通过基因转染实现移植物中血管内皮生长因子的长期表达，可以充分发挥血管内皮生长因子在体内外特异性促进血管内皮细胞增殖与迁移、改善血管通透性及维持血管稳定性等促血管化功能[38]。然而，通过对比血管内皮生长因子基因转染与富血小板血浆治疗兔临界尺寸骨缺损的疗效发现，血管内皮生长因子转染的骨髓间充质干细胞与支架复合移植物能够改善血运重建，而富血小板血浆则可以同时显著增强骨愈合和血管化效果[39]，这意味着与血管内皮生长因子单基因治疗相比，血管内皮生长因子结合多种生长因子的基因疗法更有可能提高组织修复的综合效果。
作为血管壁的重要组成成分，周细胞可以通过分泌血管生成素1进一步激活下游信号，从而重塑和稳定血管、增强血管的抗渗透性、提高内皮细胞存活率。Ang-1-Tie-2信号通路主要在血管新生后期促进血管的成熟与稳定，而血管内皮生长因子则负责促进早期管粗、壁薄、缺乏周细胞的母代血管的形成[40]，因此血管内皮生长因子和血管生成素1双基因联合转染的移植物能充分发挥二者不同时段的不同成血管效应，比单基因转染组修复骨缺损具有更显著的毛细血管密度和更良好的骨修复效果，同时也防止了移植物微血管渗漏的发生[41]。
碱性成纤维细胞生长因子已被证明主要起两种作用：参与诱导血管生成的全程和促进间充质干细胞及成骨细胞的有丝分裂。碱性成纤维细胞生长因子在促进血管生成方面的效应具体体现在：引发血管生成；促进内皮细胞存活、增殖和迁移；促进血管内皮生长因子受体2稳定表达，从而增加血管稳定性；刺激分泌纤溶酶原激活和胶原酶来降解细胞外基质，使新生毛细血管得以向损伤区域生长[39]。ZHANG等[30]在体外将碱性成纤维细胞生长因子基因转入间充质干细胞，并与支架材料进行复合，然后将其移植入同种异体兔股骨头缺血性坏死区，术后6周发现基因修饰组骨修复面积超过80%，术后12周即完成了全部修复，且新生血管面积密度和新骨形成面积远高于未修饰组。
选择合适的生长因子以实现成骨与成血管的“双赢”，是骨组织工程中的不懈追求。骨形态发生蛋白2是迄今为止被认为最有效的骨诱导因子之一，但近年来研究发现，当骨形态发生蛋白2 在诱导成骨前体细胞向成熟成骨细胞分化时，随着骨形态发生蛋白2浓度的提高和时间的延长，成骨样细胞中血管内皮生长因子的表达也随之增加，进而促进了血管化反应；而血管内皮生长因子不仅能够通过促进血管网络的创建来增加间充质干细胞的募集和存活，而且还能增强间充质干细胞对骨形态发生蛋白2引发的成骨反应能力，二者形成了相互促进、级联放大的关系[42]。但仅依赖骨形态发生蛋白2作用于血管内皮生长因子的间接血管化效率相对较低，因而只靠骨形态发生蛋白2基因诱导血管化不能达到理想的效果，于是研究人员进行了骨形态发生蛋白2/血管内皮生长因子基因联合转染，发现二者的协作关系增强了YAP/TAZ信号传导机制，从而加速了血管化和成骨过程，与单独转染组相比，基因共转染的工程化移植物修复在鼠颅骨和长骨节段性缺损时获得了完全骨愈合[43]。
在促血管化因子被广泛应用的基础上，人们试图利用一种血管发生和进展过程中的上游基因来达到更高效的成血管效果。缺氧诱导因子1α是血管调控网络中的核心转录因子，具有调节血管生成的多个下游因子的能力，由缺氧诱导因子1α基因转染诱导产生的微血管系统具有稳定、无渗漏、无水肿等优点，从而避免了因单独利用下游基因如血管内皮生长因子而产生血管瘤、血管畸形等现象[44]。YING等[45]将转染了突变体缺氧诱导因子1α的大鼠骨髓间充质干细胞接种于β-磷酸三钙支架并植入鼠颅骨临界骨缺损区域，发现基因转染组不仅有效刺激了骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，而且新血管形成标记物CD31被显著上调，与未转染组相比，缺氧诱导因子1α基因转染的工程化移植物拥有更多、更快的新骨和新生血管形成。除了利用上游基因之外，双/多基因联合转染也可以通过细胞因子之间的协调作用来优化工程化移植物的血管化效果，例如骨形态发生蛋白2基因与碱性成纤维细胞生长因子基因联合转染比单基因修饰组拥有更丰富的毛细血管网[46]；血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子或成纤维细胞生长因子的双重基因递送可迅速形成成熟的血管网络[47-48]，这些实验均表明双/多基因联合递送可能在组织工程血管化中拥有更广阔的前景。
2.3   基因治疗中的载体   选用合适的载体将目的基因高效导入种子细胞是实现工程化组织基因增强的必要前提。目前基因传递系统分为病毒载体和非病毒载体两大类。
强基因转移能力是病毒的固有特性，因而当毒性基因序列被替换为目的基因后即成为高效的基因转移载体，其在基因治疗中占据了约70%的应用空间。不同载体的适用范围因目标细胞类型和期望表达的时间而不同[17]。慢病毒具有可以感染原代细胞、转染效率高、容纳基因量大等优点，但来源和基因组的复杂性限制了其临床应用，因此主要用于需要长期表达目的蛋白以促进临界缺损愈合的肿瘤切除或创伤性疾病。反转录病毒可以随机重组到分裂期细胞的宿主染色体内，持久稳定地表达所需蛋白质，但是这可能会破坏细胞周期进程，通过插入突变导致肿瘤发生，所以不宜用于治疗周期较短的非致死性疾病。腺病毒的宿主细胞范围广，其独特之处是能使目的基因瞬时高效表达并迅速消退，从而减少了外源基因对宿主后期的不良反应，尤其是不整合入宿主基因组，避免了癌变可能，针对其高免疫原性，第3代腺病毒极大降低了免疫原性，因此适用于各种损伤等需要短期内高效表达外源基因的治疗。腺相关病毒具有非常高的安全性，它不引起任何已知的疾病，其不足之处是：由于容量小，且依赖于腺病毒或疱疹病毒存在才能生产出成熟的病毒颗粒，其生产成本和技术复杂性显著增加。尽管病毒载体拥有较高的转染效率，但这是以潜在的致癌风险和针对病毒成分的免疫反应作为代价的，同时其基因装载容量和大规模生产也受到限制[49]。针对以上不足，目前对病毒载体的主要改进目标是提高其转染能力和长期应用的生物安全性[50]，例如通过修饰病毒衣壳蛋白以形成靶向性转染及构建无病毒基因的无肠型腺病毒载体等，甚至可以通过组合两种及以上的不同病毒，来扬长避短、构建集多种特性于一体的嵌合病毒载体。
尽管目前大多数实验主要以病毒为媒介进行组织工程血管化基因治疗，但非病毒转移基因法因其具有更高的安全性、易于组装和大规模生产、导入方式多样等优点，正在逐渐成为未来研究的重点[51]。非病毒载体通常被制备成纳米粒子来负载目的基因，主要包括阳离子脂质体、阳离子聚合物如聚乙烯亚胺、生物可降解聚磷脂和壳聚糖等[52]。阳离子脂质体因其独特的脂双层结构而具有生物相容性强、包装容量大的特点，可以成功感染多种细胞；阳离子聚合物与DNA结合后形成多链式的复合体，比脂质复合体更加稳定，其上的多种官能团也易于被化学修饰而获得所需的理化性质[53]。EFS-WITTE等[44]发现，用聚(β-氨基酯)递送缺氧诱导因子1α至人脂肪干细胞可以诱导3D血管形成。壳聚糖是一种生物相容性无可比拟的基因传输系统，RAFTERY等[54]用胶原羟基磷灰石支架负载了携带骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子基因的壳聚糖纳米颗粒，同时将间充质干细胞播种在该支架上，发现间充质干细胞的目的蛋白表达可持续长达28 d，将该支架移植到动物颅骨临界骨缺损区后有效促进了骨与血管新生。非病毒载体最大的缺陷是基因转染效率较低，因此研究者已从多重角度出发来改进其转染效果，如缩小载体尺寸或对纳米颗粒表面进行聚乙二醇化修饰以提高DNA复合物稳定性、将组织特异性配体加载在载体表面以提高转染的细胞靶向性(包括调节血管生成的内皮细胞)、加载特定化学键及使用可降解的生物材料以提高DNA与载体的解离速率等，从而促进非病毒载体有效递送基因[52]。除此之外，一些分子质量较大的阳离子聚合物虽然转染率高，但随之产生了过度的细胞毒性和血清成分干扰。
为了打破这种转染效率与安全性之间的相悖关系，近来的研究正不断通过降低分子质量并组合多种非病毒载体等方式增加载体的结构多样性，以构建综合性能优异的新型非病毒载体[53]。
病毒载体和非病毒载体性能特点，见表1。

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科学技术是把双刃剑，在给人民生活带来进步的同时也带来了灾难，例如先天性疾病和后天意外伤害的发病率显著上升[1-2]，社会老龄化趋势也使一些慢性疾病的患者不断增加[3]，这些疾病造成的组织缺损常给患者带来严重的功能障碍、心理阴影和经济负担[4]。以颅颌面为例，全球约有85%的人有重建颅颌面软、硬组织的需求[5]，因此高效精致的组织和器官修复技术是当今临床医学中重要的研究课题之一。

目前在临床上常用组织移植的手段来修复畸形或组织缺损，主要包括自体组织移植和异体组织移植两大类修复方法，但是这两种方法存在增加额外创伤、易引起手术并发症及导致严重免疫反应等缺陷。由于解剖上的特殊性，如不规则的骨外形、密集分布的神经血管网络及对美观性的要求(如对称的骨轮廓和适宜的软组织厚度)等，为组织和器官的修复重建带来重重挑战[6]。为了克服传统修复技术的不足和实现精致的修复效果，人们提出了一种基于组织工程的修复方法，其基本原理是首先对细胞、支架和生长因子进行不同的组合，然后再将组合植入到患者缺损部位，而后逐渐形成内源性的软、硬组织以实现器官的愈合。同时，借助于现代计算机辅助设计软件和3D打印技术可以实现组织器官精确修复定制服务。大量的动物模型实验和临床前期研究表明，相比于传统的组织修复方法，利用组织工程技术修复后的综合性能明显得到提升[7]。

虽然组织工程技术具有良好的应用前景，但是众多研究发现，当工程化人工移植物的体积超过2.0-3.0 mm3时，其中心部位常缺乏血供，以致其内部细胞仅依靠周围血管的渗出，无法进行充分的气体和物质交换而坏死[8]。因此，迅速形成高度组织化、可灌注、致密、成熟的血管系统不仅决定了工程化组织体内移植后能否存活，而且是移植物长期发挥功能的必要前提。为此，学者们进行了一系列的尝试，主要集中在以下三方面：预先在体外组织工程移植物内部形成微脉管系统以缩短移植后的血管化进程，如构建预血管化三维细胞膜片或微球[9]；促进植入后的移植物内部主动生成血管，如将细胞播种在支架上，或同时复合生长因子，通过支架内的细胞在体内自发形成微血管网络从而与宿主血管相接[10]；促进宿主血管长入移植物，如在支架上加载血管生成相关因子[11]，或利用缓释系统控制在一定时间内持续释放这些因子，来募集宿主血管化细胞[12]，以及对支架材料的理化性质进行改造，如增强支架的降解性、增加孔隙率、进行化学修饰等[9,13]，来诱导宿主血管向移植物内生长。但这些方法都存在一些共性缺陷，限制了其临床应用，比如种子细胞体外增殖能力较弱、嫁接率低、体内存活和血管分化效果差；支架上的细胞因子在体内会迅速降解和扩散，因此其有效生物活性在损伤部位难以长期保持[14]，且现有缓释系统技术常常使得细胞因子生物活性和利用率显著降低，为此不得不在支架上整合足量的生长因子，这又导致了高额的治疗费用和致瘤的风险 [15-16]；此外，仅凭支架诱导并不能充分诱导血管腔形成。因此，为了促进组织工程移植物的血管化，必须寻求一种更加安全、高效、低成本的新型方法。

近年来随着基因工程技术的不断成熟，基因治疗的理念逐渐深入组织工程领域，其基本原理是通过人工方法向宿主细胞内导入所需的靶基因，该特定靶基因在病理环境中能够特异地持续表达并释放其编码的治疗性蛋白质，然后通过自分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，从而完成血管重建和组织再生[17]。

组织工程与基因治疗结合的核心在于从分子水平上改造了细胞结构和功能，进而改善了治疗效果，其优越性体现在以下三方面 [15,18-19]：①安全性较高：基因工程技术直接在内源性蛋白位点上诱导相应血管化因子持续、精确、少量表达和分泌，避免了过量使用外源性蛋白引起的免疫反应和致瘤风险，以及直接在体内注射病毒载体造成的插入突变危险等。②治疗费用相对较低：由患者机体自身分泌细胞因子，因此减免了购买细胞因子的消费支出。③治疗效果好：与外源性重组蛋白相比，细胞内源性合成蛋白具有更高的生物学活性，并且转基因细胞可以在较长时间内持续稳定地表达促血管生成蛋白，因而规避了直接递送蛋白质的局限性。

基因传递在组织工程中的应用方式可分为两种，一是体内法，即将编码促血管化蛋白的相关基因添加到适当的载体中，载体被整合入支架内并植入到修复区域，宿主自体细胞逐渐浸润支架，同时目的核酸转染至宿主细胞来促进血管生成。ZHA等[20]将封装了血管内皮生长因子基因的外泌体负载在3D打印多孔骨支架上，发现该支架可以在体内诱导大量血管化的骨再生，但这种方法会造成部分基因治疗药物无序扩散，影响转基因表达的持续时间。二是体外法，即在移植前用目的基因修饰由宿主自身提取的种子细胞，再将该细胞与支架材料复合后植入体内，这些种子细胞通常具备优异的血管生成潜能，在外源血管生成基因的调控下这些潜能被进一步放大，为体内多种血管化细胞的归巢与募集提供了持久的促血管化微环境，因此较第一种体内法，这种基于种子细胞的基因治疗效果更加精准、稳定和广泛。鉴于以上分析，该文将聚焦于由种子细胞、目的基因和基因载体联合构建的基因强化型血管化工程移植物，并对其种子细胞、目的基因和基因载体的研究现状及存在的主要问题进行综述，籍此抛砖引玉，以进一步探讨基因治疗在组织工程血管化中的未来发展和应用前景。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   资料来源   由第一作者分别在PubMed、Web of Science、CNKI上进行了文献检索，并以“Tissue engineering；Vascularization；Gene therapy；Seed cells；Target genes；Vectors”作为英文检索词，以“组织工程；血管化；基因治疗；种子细胞；目的基因；载体”作为中文检索词，对2015年5月至2021年1月所发表的文献进行了检索，对符合纳入标准的文献进行了分析与总结。
1.2   筛选标准
纳入标准：主要涉及促进组织工程移植物血管化的种子细胞、目的基因、基因载体及其作用机制的综述文献；涉及基因治疗应用于组织工程中修复组织缺损、促进组织再生的研究原著和综述；涉及病毒和非病毒载体强化基因表达的临床研究和综述；体现最新研究成果的文献。
排除标准：内容相关性弱的文献；实验方案不具体、逻辑表达不清晰的研究文献；内容重复和理论陈旧的文献。

1.3   文献的提取   根据关键词，经过初次筛选共检索到相关文献324篇，然后依据标题和摘要进行了二次初筛，首先排除了与该文主题无关的文献，然后通过浏览全文，再次对文献进行了筛选，最终筛选出与该文相关性较强的文献共计61篇。文献筛选过程如图1所示。

组织工程移植物是提高组织缺损重建精确性与安全性的有效手段，而快速在其内部形成高度组织化的血管网络则是成功修复的先决条件。已有不少实验证明，通过支架复合细胞和(或)血管化因子来修复骨、皮肤、脂肪、神经等组织和器官，可以增强血管形成效果[7,55]。而近年来的研究表明，基于多种血管化细胞和生长因子整合的基因疗法显著增强了细胞的存活、增殖和促血管化能力[4,52,56]，但目前对目的基因在宿主细胞的转录调控机制还未完全研究清楚；此外，相关的临床试验较少，治疗效果还有待进一步验证。下一步应在深入研究血管化机制的基础上，进一步优化血管化种子细胞与目的基因联合营造的血管化微环境，而其关键就在于提高目的生长因子释放的靶向性，即“因地制宜”地根据病变的范围、严重程度，来动员细胞贯序、定量地分泌生长因子，使其在严格的时间和空间格局中表达，这不仅可以增强细胞的血管化反应，同时降低目前基因治疗潜在的生物学风险，包括高于生理剂量的持续性基因过表达造成的细胞畸变、细胞异常增殖和异位成骨等风险[8]。

为了达到这一目标，应构建具备以下三方面性能的基因控释系统：①空间调控性：研究发现，刚植入体内的移植物从其表面到深部呈不同程度的缺氧状态，这种缺氧环境可以驱动细胞强化缺氧诱导因子1α表达来激活低氧诱导反应原件，进而引起一系列下游血管生成基因转录，参与血管生成的全程，而当血供水平上升时以上基因表达停止，因此，通过增加低氧诱导反应原件的重复序列可以加大细胞对低氧空间调控的依赖性，从而极大改善组织移植物的血管化效果[57]；②目的基因表达有序性：在体内，只有众多生长因子有组织性地发挥作用才能形成成熟的血管网络，例如，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素2在血管化早期促进内皮细胞增殖和募集，接下来基质金属蛋白酶促进细胞外基质降解和内皮细胞迁移，血管生成素1和血小板衍生生长因子则在后期激活周细胞、促进管腔重塑、吻合与稳定[58]，这一生理过程为血管化基因治疗带来启发，即可以通过联合基因治疗与缓释技术促使上述多种血管化目的基因在时间上顺序性表达，以构建高度组织化的功能性血管网络[59]；③目的基因表达时间、剂量可控性：CRISPR/Cas-9系统是近年来一项令人瞩目的基因编辑技术，它可以将外源基因特异性地插入宿主的基因组中。最重要的是，多种调控方式如药物调控、光调控及小分子调控等，可以通过调节Cas-9酶的活性来进一步精确控制目的蛋白的释放时间和剂
量[60]，如果能将其应用在组织工程移植物血管化中，就可以极大减少基因爆发式表达造成的毒副作用，促进血管生成反应可持续性进行。

然而，目前已开发的几种基因控释系统大多有着不可忽视的问题，如低氧调控主要依赖于体内微环境自我调节，无法有效进行人为干预；药物调控系统存在药物不良反应、调控原件繁多、过程复杂、稳定性差等缺点；光调控受距离限制，不宜用于深部组织的修复调控[61]。正因为此，这些基因调控系统距离临床应用还有很长的路要走。因此，开发新的调控元件和更加安全的基因载体，以实现基因的可控化表达迫在眉睫，这项工作将为大幅提高基因治疗疗效和深入临床应用奠定坚实基础。

相信，未来组织工程血管化基因治疗必将为高效构建大块工程化移植物内部稳定、成熟的微血管网络系统，做出令人瞩目的贡献！
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
组织工程血管化：利用多种策略促进体外工程化移植物内部迅速形成高度组织化、可灌注的功能性血管网络，以保证工程化移植物早期在体内的存活和功能发挥。
基因治疗：根据需要将外源基因导入靶细胞，可以灵活地在组织局部表达相应蛋白质，从而实现治疗目的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.文章首次系统性综述了基因治疗在促进组织工程血管化中的研究现状，提出基因治疗相对于传统血管化方法的三大优势，旨在探讨该项技术的临床应用前景。

2.具体分析总结了现有研究中最具应用潜力的血管化种子细胞、目的基因和基因载体及其作用机制，针对目前技术的不足之处提出“因地制宜”化的基因控释治疗策略，以进一步强化细胞和生长因子促血管效应的精准性和高效性，同时提高载体应用的安全性，这将是今后组织工程血管化基因治疗的潜在应用方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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