2.1   细胞的选择   在多细胞构建的血管化组织工程骨中，细胞类型、细胞比例和培养基比例极为重要。对于基于细胞的骨组织工程构建体而言，可以从多种解剖部位获取且具有强大的自我更新能力和分化为成骨细胞能力的细胞来源是首选的[19]。迄今为止，最常用的骨形成细胞和血管生成细胞的类型分别为间充质干细胞/脂肪干细胞/成骨细胞和内皮细胞/内皮祖细胞。目前间充质干细胞的来源主要包括：骨髓、脂肪组织、脐带和牙髓4种[20]。脂肪间质干细胞是在脂肪组织中发现的成体干细胞[21]。与骨髓间充质干细胞类似，脂肪间充质干细胞具有分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞和神经细胞的潜能[22-24]，脂肪间质干细胞是组织工程中理想的种子细胞之一，与骨髓间充质干细胞相比，脂肪间质干细胞来源丰富、获取简单和增殖率高[25]。对于血管生成细胞的选择，人脐静脉内皮细胞相比于内皮祖细胞具备成本低、特征明显、寿命长及更快的增殖速率等优点[26]，因此，人脐静脉内皮细胞仍是骨组织工程研究中使用最多的细胞类型。由于其成熟分化特性，人脐静脉内皮细胞不能进一步应用于临床[27]，但内皮祖细胞等替代细胞也已被探索。此外，间充质干细胞同时分化为成骨细胞和血管生成细胞类型可以使细胞获取过程更容易[28]。
最佳的细胞比例仍在研究中，对于一些多细胞共培养体系，如骨髓间质干细胞/人脐静脉内皮细胞和脂肪间质干细胞/人脐静脉内皮细胞。据报道，1∶1的比例对骨生成和血管生成都是最佳的[29]。虽然从生物学角度来看，骨组织中成骨细胞和内皮细胞的比例是5∶1[30]；但1∶1的比例可以在骨形成细胞使用较少的情况下获得最佳的成骨和血管生成能力[31-36]。见表1、表2。







2.2   基于支架的多细胞组织工程骨   目前，用于骨组织工程支架的材料主要有水凝胶、天然聚合物、合成聚合物、生物活性陶瓷材料及其复合材料等。单纯材料支架缺乏骨再生能力，为了设计具有更好的骨生物相容性的替代品，组织工程技术制备结合细胞或生长因子的三维支架，来诱导骨组织再生[37-38]。骨组织工程支架的目的是模拟天然骨细胞外基质的生物学功能和结构，为细胞的黏附、增殖和分化提供一个三维环境。通常，理想的3D支架是由生物相容性、生物可降解材料组成的，其力学性能与天然骨组织相似。从设计上看，支架并不是永久性植入体，它将促进细胞沉积细胞外基质，并随着时间的推移取代支架结构。支架的三维结构应该是高度多孔的，并具有相互连通的开放多空网络结构，以促进营养输送，细胞增殖、分化、迁移和组织血管化等骨组织再生的关键因素，为细胞的生长和功能提供了合适的微环境。目前制备多孔组织工程支架的方法有模板法、发泡法、冻干技术、静电纺丝技术、3D打印技术和4D打印技术等[39-40]。
支架作为载体与细胞或生长因子结合，诱导组织再生。支架材料的性质决定了细胞在支架上的结合方式。细胞与材料的结合方式有2种，一是将细胞接种在支架材料表面；二是直接将细胞包封在支架材料内，见图3。



2.2.1   支架上接种细胞   骨组织工程支架材料的基本要求是：材料既要能促进细胞外基质的沉积，还要能促进细胞黏附和迁移。但细胞的黏附常受材料的表面粗糙度、亲疏水性和缺乏可识别生化结合位点的限制，在选择支架材料时应选择非免疫原性的生物材料。此外，通过与其他材料(如明胶和壳聚糖)或蛋白质(如纤维粘连蛋白)复合[41-43]，或通过表面修饰(如表面形貌修饰、蛋白质吸附、矿物涂层、官能团嵌套和生物大分子固定[44])等来改善细胞在支架上的黏附和迁移情况。相比于在支架内包封细胞的方法，在支架表面接种细胞可根据需要，调整各种细胞的接种时间，但其细胞接种部位不可控，不能很好地模拟天然骨组织中的细胞分布。
有研究将人脐静脉内皮细胞和人成骨细胞按4∶1的比例同时接种在发泡法制备的硅酸钙骨水泥支架上，与仅接种人成骨细胞组做比，共培养组的血管内皮生长因子和Ⅰ型胶原以及成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Runx2的表达明显提高；共培养42 d后，CD31免疫荧光染色显示共培养组有丰富的微毛细血管样结构，表明在大孔硅酸钙骨水泥支架上同时接种人脐静脉内皮细胞和人成骨细胞具有良好的血管生成能力，并能促进骨生成[45]。有研究制备了肝素修饰的聚己内酯-明胶电纺纤维支架，并在支架上以1∶1接种脂肪来源间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞[46]，发现在共培养条件下，CD31表达增强，且人脐静脉内皮细胞呈健康的鹅卵石状，表明与间充质干细胞共培养有助于血管化。双向诱导人脐血间充质干细胞分别使其分化为成骨细胞和内皮细胞，发现在磷酸三钙支架上以3∶1接种成骨分化和成管分化的人脐血间充质干细胞与接种未分化人脐血间充质干细胞组相比，修复大鼠临界尺寸颅骨缺损的能力显著增强[47]。
2.2.2   支架内包封细胞   相比于在支架上接种细胞，将细胞包封在支架材料内的方法对支架材料要求更高。首先，考虑到高物质交换率是包封细胞的重要条件，因为气体(O2和CO2)、营养物质和代谢产物的不断交换对细胞的存活和增殖至关重要；其次，适当的机械性能、高保水率也是支架材料的必备条件。水凝胶材料因可模拟天然细胞外基质的物理和生化特性而得到了广泛研究[48]。水凝胶是一种由亲水聚合物链组成的三维分子网络，在富含水的环境中具有高达其干质量1 000倍的吸水能力。目前，常用的水凝胶有海藻酸盐基水凝胶、透明质酸基水凝胶、壳聚糖基水凝胶、明胶 [49]、甲基丙烯酸改性明胶(GelMA)基水凝胶和聚乙二醇基水凝胶。近年来，出现了多种水凝胶改性方法，如点击化学、凝胶机制和复合纳米生物材料等，实现了水凝胶物化性质的有效控制。因此，骨组织工程中常将水凝胶作为包封细胞的载体，并利用生物3D打印技术实现对多种细胞的精准定位，模拟天然骨中的细胞分布。
有研究采用生物3D打印技术制备得到具有可灌注血管腔的类骨组织构建体[48-50]，构建体的中心纤维由快速降解的GelMA(GelMA-low)包封人脐静脉内皮细胞构成，中心纤维的周围打印复合了硅酸盐纳米片的生物墨水来诱导骨髓间充质干细胞成骨；此外，为了促进血管延伸，在诱导成骨部分使用了血管内皮生长因子梯度功能化的GelMA，结果表明，这种策略适用于制造大尺寸带血管蒂的骨组织结构。最近一项研究利用同轴生物3D打印将小鼠成骨细胞系(MC3T3-E1)和人脐静脉内皮细胞的生物墨水分别从同轴针头的外部(与GelMA混合)和内部(与明胶混合)同时打印出来[51]，得到的大尺寸组织由芯鞘纤维组成，当芯纤维溶解形成通道时，人脐静脉内皮细胞自动沉积并黏附在通道上，通过这种方法构建了长期培养(≥20 d)的三维负载细胞的血管化骨组织构建体。
水凝胶缺乏骨组织工程所需的机械强度。将机械强度高的生物相容性材料(如聚己内酯、聚乳酸-羟基乙基共聚物等)与水凝胶生物墨水进行复合，可以提高整个构建体的机械强度。PIARD等[51-52]利用基于挤压的生物3D打印技术来模拟天然骨中的空间分布。通过沿着聚己内酯基体支架共打印纤维蛋白水凝胶独立包封人脐静脉内皮细胞和人间充质干细胞的生物墨水，构建了双相骨样支架，该结构的抗压力学性能处于皮质骨范围内。仿生支架的血管生成标志物的基因表达显著上调。将双相仿生支架植入大鼠皮下，组织学分析显示，3D打印骨样支架的血管数量显著增多。有文献报道：在多巴胺修饰的硅酸钙-聚己内酯支架的间隙分别打印海藻酸盐基水凝胶包封人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的生物墨水构建了复合骨组织工程支架，该复合支架与多细胞共培养相结合，不仅能够改善构建体的力学性能，还能够促进成骨和血管生成[45]。见表3。



2.3   基于细胞膜片的多细胞组织工程骨   传统的组织工程技术采用胰蛋白酶消化的方法收集种子细胞，其存在细胞利用率低、细胞完整性差及细胞活性低等缺点。细胞膜片技术不存在这些问题。细胞膜片是一种膜质细胞载体，从培养皿上物理剥离来获得扩增的细胞，该技术的优点是保留了丰富的细胞外基质和表面蛋白，避免了细胞的流失、提高了细胞利用率、保留了整个信号通信网络、促进细胞与原生组织的黏附，形成具有较强可塑性和良好机械强度的三维组织结构。
将多层细胞膜片叠加制备出的三维组织能够达到高细胞密度。但超过一定厚度的3D高细胞密度膜片工程组织在植入体内后，往往会导致内部细胞因缺氧而坏死[54]，构成组织的细胞的生存能力将直接影响组织的功能。在构建组织工程骨时，构建体的血管化也极为重要，因此，改善骨组织工程细胞膜片结构的血管化成为研究的重点。该方面的研究往往涉及到骨形成细胞与内皮细胞共培养的策略，其优势明显好于单一种类细胞培养获得的细胞膜片。细胞膜片共培养技术能够模拟生理条件，因此保留了多种细胞间的旁分泌效应，使得细胞膜片的功能得到改善或保持与体内组织相似[55]。利用多细胞共培养细胞膜片对移植体进行预血管化，可以为膜片中间部位提供营养供给，同时解决移植后的血供问题，从而提高移植细胞膜片的成活率[56]。此外，当目标细胞黏附较弱时，共培养有利于细胞膜片的剥离；与具有强大收缩力的细胞共培养，可以稳定有效地剥离细胞膜片[36]。
有研究强调了利用培养细胞膜片构建功能性组织结构的重要性，并报道了发现了一种温度敏感培养皿，能够快速分离培养的细胞膜片[57]。细胞膜片的剥离方法主要包括基于温度响应型培养皿、基于表面改性培养皿以及无需进行表面改性的方法，如采用超声剥离、磁性纳米颗粒剥离、纤维蛋白基质涂层剥离等。目前，基于温度响应培养皿剥离的方法应用最为广泛。细胞膜片共培养技术可分为以下2种：一是将2种不同的单培养细胞膜片堆叠在一起；二是利用多种细胞构建每一层细胞膜片。
2.3.1   两种单一细胞膜片叠加   两种单一细胞膜片相叠加可以通过简单地改变片层的垂直位置来实现细胞位置的调控。
PANDUWAWALA等[58]探讨了牙周韧带干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)和人脐静脉内皮细胞构建细胞膜片的体内牙周再生潜能。首先，将PDLSCs、人脐静脉内皮细胞及两者共培养的细胞接种于温度敏感培养皿上，并制备了3种完整的细胞膜片；然后，将细胞膜片进行组合，即PDLSCs-PDLSCs-PDLSCs、PDLSCs-人脐静脉内皮细胞-PDLSCs、Co-culture-Co-culture-Co-culture，再分别包裹在准备好的人牙根上，并植入免疫缺陷小鼠皮下。组织学观察显示，植入2，4，8周后，种植根周围可见牙周韧带样组织排列，含人脐静脉内皮细胞组可见血管腔；植入第4周和第8周的免疫染色显示多细胞组牙周韧带再生、骨水泥形成和骨形成更明显。无论是Co-culture-Co-culture-Co-culture组还是PDLSCs-人脐静脉内皮细胞-PDLSCs组，宿主微血管系统与植入体血管腔结构都能有效整合并促进体内牙周韧带样组织、牙骨质和骨质的形成。有研究也曾以几种不同的方式将人源内皮细胞引入分层组织，并比较了内皮细胞在3D组织不同位置的行为。人类脐静脉内皮细胞、人真皮成纤维细胞及其混合物制备完整的细胞膜片从低温反应培养皿中获得。利用细胞膜片收集装置将3种细胞膜片按不同顺序堆叠，形态学分析结果显示，所有堆叠结构均形成了人脐静脉内皮细胞构成的前血管网络；共聚焦显微镜观察表明，前血管网络形成了类似于天然微血管的管状结构。这些结果表明，内皮细胞在3D组织中的初级定位可能是血管形成的关键[59]。
2.3.2   共培养单层细胞膜片   将共培养的融合细胞从培养表面分离，就可以制得共培养单层细胞膜片。接种细胞的方法也有很多种，主要包括一次性接种多种细胞、不同时间点接种不同种细胞及利用图案化的培养表面来制备图案化的共培养单层细胞膜片等[60]，见图4。



邢飞等 [61]将外周血间充质干细胞和外周血内皮细胞以1∶1比例混合并进行成膜诱导，并与仅含单一细胞膜片进行对比，发现共培养细胞膜片较单一细胞膜片组更厚，细胞密度更大；培养第10天，共培养细胞膜片组的碱性磷酸酶、骨钙蛋白及血管内皮生长因子表达量均显著高于单一细胞膜片组。研究结果证实了共培养细胞膜片比传统的单一细胞膜片具有更多的细胞层数和细胞外基质，成骨分化能力也更强。
周震等[62]分别在低氧和常氧条件下接种骨髓间充质干细胞，培养4周后再接种人脐静脉内皮细胞制得共培养单层细胞膜片，两种条件下均有血管样结构形成，且低氧条件下细胞膜片得血管样结构更长更密、血管内皮生长因子表达水平也更高。这表明骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞共培养在细胞膜片血管化过程中起关键作用，且低氧条件下骨髓间充质干细胞产生得细胞外基质增多为人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和血管形成提供更优的微环境，从而提高牙槽骨缺损修复效果、促进牙周组织再生。XU等[63]利用细胞膜片技术制造带血管蒂的组织工程骨，他们将骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞接种到未分化的骨髓间充质干细胞细胞层，共培养3 d后，内皮细胞迁移并重新排列形成管腔，得到预血管化的细胞膜片；另外，通过诱导高密度骨髓间充质干细胞膜片成骨分化得到成骨细胞膜片；将预血管化的细胞膜片堆叠在成骨细胞膜片上，制备无支架的骨再生构建体；最后，将具备成血管和成骨潜能的无支架结构植入大鼠的临界尺寸颅骨缺损。大鼠临界尺寸颅骨缺损修复结果证实了预血管化组有更多的功能性灌注血管和新骨形成。
近年来，已利用以下策略来构建血管化细胞膜片骨组织植入体：将骨形成细胞与血管生成细胞膜片共培养、将血管生成细胞膜片与其他类型细胞膜片堆叠以及在细胞膜片构建体中插入血管束等。但作为大体积骨缺损植入体其力学强度明显不足，因此，在利用细胞膜片共培养技术构建血管化骨构建体时还需结合增强力学强度的方法。

[1] BOEHRNSEN F, PETRA M, MAREIKE N, et al. Cotransplantation of mesenchymal stromal cells and endothelial cells on calcium carbonate and hydroxylapatite scaffolds in vivo. J Craniomaxillofac Surg. 2021; 49(3):238-245. [2] SHI R, HUANG YL, MA C, et al. Current advances for bone regeneration based on tissue engineering strategies. Front Med. 2019;13(2):160-188.  [3] OWAKI T, SHIMIZU T, YAMATO M, et al. Cell sheet engineering for regenerative medicine:current challenges and strategies. Biotechnol J. 2014;9(7):904-914. [4] SAFINSHA S, MUBARAK AM. Composite scaffolds in tissue engineering. Mater Today Proc. 2020;24:2318-2329.  [5] GREEN H, KEHINDE O, THOMAS J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(11):5665-5668.  [6] YORUKOGLU CA, KITER EA, AKKAYA S, et al. A Concise review on the use of mesenchymal stem cells in cell sheet-based tissue engineering with special emphasis on bone tissue regeneration. Stem Cells Int. 2017; 2017:2374161.  [7] GALLICO G, COMPTON C, KEHINDE O, et al. Cultured epithelial autografts for giant congenital nevi. Plast Reconstr Surg. 1990;84:1-9.  [8] IWASAKI K, WASHIO K, MEINZER W, et al. Application of cell-sheet engineering for new formation of cementum around dental implants. Heliyon. 2019;5:e01991.  [9] ORCIANILM M, MILENA F, ROBERTO DP, et al. Biofabrication and bone tissue regeneration: cell source, approaches, and challenges. Front Bioeng Biotechnol. 2017;5:17-32.  [10] YE LIN P, KIWON P, JAE MIN C. 3D-bioprinting strategies based on in situ bone-healing mechanism for vascularized bone tissue engineering. Micromachines. 2021;12(3):287-310.  [11] GUREL PG, TORUN KOSE G, HASIRCI V. Influence of co-culture on osteogenesis and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells and aortic endothelial cells. Microvasc Res. 2016;108:1-9.  [12] TAKAHISA A, CHI CHUN P, ALEXANDER S, et al. Vascularized bone-mimetic hydrogel constructs by 3d bioprinting to promote osteogenesis and angiogenesis. Int J Mol Sci. 2019;20(5):1096-1201.  [13] SILVA AS, SANTOS LF, MENDES MC, et al. Multi-layer pre-vascularized magnetic cell sheets for bone regeneration. Biomaterials. 2020;231: 119664.  [14] PIARDA C, JEYARAMA A, YI L, et al. 3D printed HUVECs/MSCs cocultures impact cellular interactions and angiogenesis depending on cell-cell distance. Biomaterials. 2019;222:119423.  [15] AKBARI A, JABBARI N, SHARIFI R, et al. Free and hydrogel encapsulated exosome-based therapies in regenerative medicine. Life Sci. 2020; 249:1-12.  [16] WENG YM, WANG ZF, SUN JW, et al. Engineering of axially vascularized bone tissue using natural coral scaffold and osteogenic bone marrow mesenchymal stem cell sheets. Arch Biochem Biophys. 2021;50:1-8.  [17] TORRESA AL, BIDARRA SJ, VASCONCELOS DP, et al. Microvascular engineering: dynamic changes in microgel-entrapped vascular cells correlates with higher vasculogenic/angiogenic potential. Biofabrication. 2020;228:119554.  [18] MA JL, SANNE K, YANG F, et al. Concise review:cell-based strategies in bone tissue engineering and regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 2014;3(1):98-107.  [19] DIOMEDE F, MARCONI GD, FONTICOLI L, et al. Functional relationship between osteogenesis and angiogenesis in tissue regeneration. Int J Mol Sci. 2020;21(9):32-42. [20] AMLER AK, THOMAS A, TUZUNER S, et al. 3D bioprinting of tissue-specific osteoblasts and endothelial cells to model the human jawbone. Sci Rep. 2021;11(1):4876.  [21] ZHANG HL, ZHOU YL, ZHANG W, et al. Construction of vascularized tissue-engineered bone with a double-cell sheet complex. Acta Biomater. 2018;77:212-227.  [22] PRZEKORAL A, VANDROVCOVA M, TRAVNICKOVA M, et al. Evaluation of the potential of chitosan/ beta-1,3-glucan/hydroxyapatite material as a scaffold for living bone graft production in vitro by comparison of ADSC and BMDSC behaviour on its surface. Biomed Mater. 2017; 12(1):015030.  [23] WANG Z, HAN L, SUN T, et al. Construction of tissue-engineered bone with differentiated osteoblasts from adipose-derived stem cell and coral scaffolds at an ectopic site. Br J Oral Maxillofac Surg. 2020;59:46-51.  [24] STORTI G, SCIOLI MG, KIM BS, et al. Adipose-derived stem cells in bone tissue engineering: useful tools with new applications. Stem Cells Int. 2019; 2019:3673857. [25] ZHANG JH, WEHRLE E, ADAMEK PA, et al. Optimization of mechanical stiffness and cell density of 3D bioprinted cell-laden scaffolds improves extracellular matrix mineralization and cellular organization for bone tissue engineering. Acta Biomater. 2020;11:307-322.  [26] TROUNSON A, DEWITT ND. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016;17(3):194-200.  [27] RONG Q, Li SY, ZHOU Y, et al. A novel method to improve the osteogenesis capacity of hUCMSCs with dual-directional pre-induction under screened co-culture conditions. Cell Prolif. 2020;53(2):e12740.  [28] MUTSCHALL H, WINKLER S, WEISBACH V, et al. Bone tissue engineering using adipose-derived stem cells and endothelial cells: effects of the cell ratio. J Cell Mol Med. 2020;24:7034-7043. [29] SHEN QH, FAN XT, JIANG ML, et al. Inhibiting expression of Cxcl9 promotes angiogenesis in MSCs-HUVECs coculture. Arch Biochem Biophys. 2019;675:108-119.  [30] COLLINS MN, REN G, YOUNG K, et al. Scaffold Fabrication Technologies and Structure/Function Properties in Bone Tissue Engineering. Adv Funct Mater. 2021;12:47309-47319. [31] MA J, BOTH SK, YANG F, et al. Concise review: cell-based strategies in bone tissue engineering and regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 2014;3:98-107.  [32] URBICH C, DIMMELER S. Endothelial progenitor cells functional characterization. Trends Cardiovasc Med. 2004;14:318-322. [33] GRELLIER M, TOJAIS NF, BOURGET C, et al. Role of vascular endothelial growth factor in the communication between human osteoprogenitors and endothelial cells. J Cell Biochem. 2009;106:390-398.  [34] WUCHTER PMD, SAFFRICH R, LUDWIG A, et al. Cellular interaction between human mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in 2D-and 3D-culture-systems. Blood. 2009;114(22):1442.  [35] KIM K, PARK S, IM G. Osteogenic differentiation and angiogenesis with cocultured adipose-derived stromal cells and bone marrow stromal cells. Biomaterials. 2014;35:4792-4804.   [36] LIU H, ZHOU W, REN N, et al. Cell sheets of co-cultured endothelial progenitor cells and mesenchymal stromal cells promote osseointegration in irradiated rat bone. Sci Rep. 2017;7(1):3038-3050.  [37] ROMANAZZO S,MOLLEY TG, NEMEC S, et al. Synthetic bone‐like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Adv Funct Mater. 2021;31(13):1-13.  [38] MOBARAKI M, GHAFFARI M, YAZDANPANAH A, et al. Bioinks and Bioprinting: a Focused Review. Bioprinting. 2020;18:e00080.  [39] GEORGOPOULOU A, PAPADOGIANNIS F, BATSALI A, et al. Chitosan/gelatin scaffolds support bone regeneration. J Mater Sci Mater Med. 2018;29(5):59-72.  [40] SINGHL R, EITLERL D, MORELLE R, et al. Optimization of cell seeding on electrospun PCL-silk fibroin scaffolds. Eur Polym J. 2020;134:109838-109849.  [41] LIVERANI L, RAFFEL N, FATTAHI A, et al. Electrospun patterned porous scaffolds for the support of ovarian follicles growth:a feasibility study. Sci Rep. 2019;9(1):1150-1164.  [42] LIVERANI L, LACINA J, JUDITH AR, et al. Incorporation of bioactive glass nanoparticles in electrospun PCL/chitosan fibers by using benign solvents. Bioact Mater. 2018;3(1):55-63.  [43] THEIN HW, HOCKIN HK. Prevascularization of a gas-foaming macroporouscalcium phosphate cement scaffold via coculture of human umbilical vein endothelial cells and osteoblasts. Tissue Eng Part A. 2013;19(15-16):1675-1685.  [44] SUN P, ZHANG QQ, NIE W, et al. Biodegradable mesoporous silica nanocarrier bearing angiogenic QK peptide and dexamethasone for accelerating angiogenesis in bone regeneration. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(12):6766-6778.  [45] LIVERANI L, KILLIAN MS, BOCCACCINI AR. Fibronectin functionalized electrospun fibers by using benign solvents: best way to achieve effective functionalization. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7(68):1-9.   [46] JOSHI A, ZHE X, IKEGAMI Y, et al. Co-culture of mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells on heparinized polycaprolactone/gelatin co-spun nanofibers for improved endothelium remodeling. Int J Biol Macromol. 2020;151:186-192.  [47] JANITHA M, UNAGOLLA AC, UNAGOLLA J. Hydrogel-based 3D bioprinting: a comprehensive review on cell-laden hydrogels, bioink formulations, and future perspectives. Appl Mater Today. 2020;18:1-22.  [48] BYAMBAA B, ANNABI N, YUE K, et al. Bioprinted osteogenic and vasculogenic patterns for engineering 3D bone tissue. Adv Healthc Mater. 2017;6(16):1-15. [49] SHAO L, GAO Q, XIE CQ, et al. Directly coaxial 3D bioprinting of large-scale vascularized tissue constructs. Biofabrication. 2020;12(3):035014.  [50] MOBARAKI M, GHAFFARI M, YAZDANPANAH A, et al. Bioinks and bioprinting: a focused review. Bioprinting. 2020;18:e00080.  [51] PIARD CM, YU C, FIAHER JOHN PY. Cell-laden 3D printed scaffolds for bone tissue engineering. Clin Rev Bone Miner Metab. 2015;13(4):245-255.  [52] PIARD C, BAKER H, Kamalitdinov T, et al. Bioprinted osteon-like scaffolds enhance in vivo neovascularization. Biofabrication. 2019; 11(2):025013.  [53] CHEN YW, SHEN YF, HO CC, et al. Osteogenic and angiogenic potentials of the cell-laden hydrogel/mussel-inspired calcium silicate complex hierarchical porous scaffold fabricated by 3D bioprinting. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2018;91:679-687.  [54] SAKAGUCHI K, SHIMIZU T, OKANO T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. J Control Release. 2015;205:83-88.  [55] KWON OH, KIKUCHI A, YAMATO M, et al. Rapid cell sheet detachment from poly[N-isopropylacrylamide]-grafted porous cell culture membranes. J Biomed Mater Res. 2015;50:82-89.  [56] SAKAI Y, KOIKE M, HASEGAWA H, et al. Rapid fabricating technique for multi-layered human hepatic cell sheets by forceful contraction of the fibroblast monolayer. PLoS One. 2019;8(7):e70970.   [57] PANDUWAWALA CP, ZHAN X, DISSANAYAKA WL, et al. In vivo periodontal tissue regeneration by periodontal ligament stem cells and endothelial cells in three-dimensional cell sheet constructs. J Periodontal Res. 2017;52(3):408-418.  [58] IMASHIRO C, SHIMIZU T. Fundamental Technologies and Recent Advances of Cell-Sheet-Based Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 2021; 22(1):425-443.  [59] LU YZ, ZHANG WJ, WANG J, et al. Recent advances in cell sheet technology for bone and cartilage regeneration:from preparation to application. Int J Oral Sci. 2019;11(2):17-30.  [60] HIRONOBU T, TERUO O. Cell sheet-based tissue engineering for organizing anisotropic tissue constructs produced using microfabricated thermoresponsive substrates. Adv Healthc Mater. 2016;4(16):2388-2407.  [61] 邢飞,段鑫,刘明,等.外周血来源间充质干细胞/内皮祖细胞复合细胞膜片的构建及其生物学特性初步研究[J].中国修复重建外科杂志, 2020,34(1):109-115.  [62] 周震,王亚敏,任飞,等.骨髓间充质干细胞膜片和脐静脉内皮细胞共培养模型的构建及鉴定[J].中国组织工程研究,2019,23(25): 3951-3955.  [63] XU M, LI JD, LIU XN, et al. Fabrication of vascularized and scaffold-free bone tissue using endothelial and osteogenic cells differentiated from bone marrow derived mesenchymal stem cells. Tissue Cell. 2019;61: 21-29.

[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	朱 婵, 韩栩珂, 姚承佼, 周 倩, 张 强, 陈 秋. 人体唾液成分与骨质疏松/骨量低下[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1439-1444.
[3]	金 涛, 刘 林, 朱晓燕, 史宇悰, 牛建雄, 张同同, 吴树金, 杨青山. 骨关节炎与线粒体异常[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1452-1458.
[4]	张立创, 徐 浩, 马迎辉, 熊梦婷, 韩海慧, 鲍嘉敏, 翟伟韬, 梁倩倩. 免疫调控淋巴回流功能治疗类风湿关节炎的机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1459-1466.
[5]	王 景, 熊 山, 曹 金, 冯林伟, 王 信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[6]	朱 婵, 韩栩珂, 姚承佼, 张 强, 刘 静, 邵 明. 针刺治疗帕金森病：动物实验显示的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1272-1277.
[7]	郭 嘉, 丁琼桦, 刘 泽, 吕思懿, 周泉程, 高玉花, 白春雨. 间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1093-1101.
[8]	吴玮玥, 郭晓东, 包崇云. 工程化外泌体在骨修复再生中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1102-1106.
[9]	周洪琴, 吴丹丹, 杨 琨, 刘 琪. 传递特定miRNA的外泌体可调控成骨并促进成血管[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1107-1112.
[10]	张璟琳, 冷 敏, 朱博恒, 汪 虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[11]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于 兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.
[12]	惠小珊, 白 京, 周思远, 王 阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[13]	安维政, 何 萧, 任 帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[14]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李 帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[15]	许 磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.

20世纪80年代末至90年代初，组织工程被定义为一个跨学科的领域，以发展生物替代品来修复、维持或改善组织功能[1]。组织工程的必要条件包括具备适当的信号调节水平和顺序、适当数量的响应祖细胞、适当的细胞外基质或载体、以及充足的血液供应[2]。组织工程涉及组织的体外构建，将构建体植入人体来修复、维持或改善特定组织或器官的形状和功能。在组织工程领域的发展过程中，细胞悬液直接移植曾作为一种细胞治疗技术，但这种技术很难控制移植细胞的位置，致使许多细胞在移植后很快流失[3]，不足以修复缺损组织。支架可作为细胞在体内植入过程中的载体。因此，细胞与生物可降解聚合物支架等多种生物材料的相互作用一直是组织工程领域的研究热点之一。
基于支架的组织工程需要克服的主要问题有：免疫原性和炎症反应升高、支架降解速率与组织再生速率不匹配性、细胞与生物材料相互作用不可控、细胞黏附效率低和细胞分布不均等[4]。另一种是基于无支架细胞膜片的组织工程技术。所谓的细胞膜片技术是基于培养高度融合的细胞，直到它们形成密切的细胞与细胞之间的相互作用，并产生足够的自身细胞外基质，从而形成细胞膜片的形式。利用培养的细胞制备适用于移植的组织的想法可以追溯到20世纪70年代末[5-6]。20世纪80年代，培养的自体人表皮细胞被移植到上皮性皮肤移植中，用于修复严重烧伤、巨大先天性痣、皮肤溃疡等表皮缺损[7]。制备的单层细胞膜片可用于皮肤、角膜和牙周韧带的重建。数个同型细胞膜片相叠加，可以重建均匀的三维组织，如心肌组织。几种异型细胞膜片相叠加可以构建层状结构，如肝脏或肾脏[8]。
骨是移植最频繁的组织之一，每年全球有超过220万例骨移植手术[9]。在骨这一高度血管化的组织中，血管通过满足氧气和营养需求、引导炎症信号和细胞到伤口部位，在骨缺损愈合中发挥着重要作用[10]。事实上，实现充分血管化是骨组织工程构建体最佳的细胞存活和良好的体内组织整合的先决条件[11]。在骨组织工程中仅仅依赖于通过邻近成血管细胞的长入实现血管化是十分缓慢的，且只能达到距植入体表面几百微米的深度[12]。研究表明，距离血管200 μm范围内对细胞的存活至关重要，为了获得具备完整功能的血管化骨结构，骨组织工程领域主要包括两种策略：一是构建体的预血管化，与依赖支架设计和血管生成因子控制释放的方法相比，预血管化可以显著缩短植入体血管化所需的时间[13]；二是在骨形成细胞培养中引入血管生成细胞，以改善血管形成，从而促进以细胞为基础构建体的骨形成[14-15]。
与单培养模式相比，多细胞共培养模式的优势在于更接近体内代谢微环境，不同类型细胞之间的接触、外泌体和旁分泌活动，通过细胞间的信号传递，可能赋予细胞额外的功能[16-17]。骨组织包含多种细胞类型，因此多细胞共培养是一种合理的体外模拟生理环境的方法。此外，与单一培养相比，共培养已被证明能增强血管形成和骨形成[18]，体外共培养方法构建多细胞组织工程骨可以视为一种有效的工具。先前关于构建血管化组织工程骨的综述，大多聚焦于支架材料、细胞和培养基的选择，构建体的体外培养条件(如2D静态培养和3D动态培养)以及支架材料的制备及表面改性方法等。文章旨在概述基于骨形成细胞和血管生成细胞共培养的3D血管化组织工程骨构建体的构建方法在骨修复中的应用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

1.1   资料来源   
1.1.1   检索人及检索时间   第一作者在2021年3月进行检索。
1.1.2   检索文献时限   2000-2021年。
1.1.3   检索数据库   应用计算机对中国知网、PubMed和Web of Science数据库2000-2021年发表的文献进行了检索。
1.1.4   检索词   中文检索词为“骨组织工程、成骨成血管、多细胞”，英文检索词为“Bone Tissue Engineering，Osteogenesis and angiogenesis，Multicellular”。
1.1.5   检索文献类型   研究原著、综述和病例报告。
1.1.6   手工检索情况   无。
1.1.7   检索策略   以 Web of Science数据库为例，见图1。

1.1.8   检索文献量   初步共检索359篇文献，其中英文297篇，中文62篇。
1.2   入组标准
1.2.1   纳入标准   ①有关多细胞共培养促成骨成血管的文献；②有关基于支架和无支架组织工程应用于骨修复的文献；③同一领域中观点、论据可靠的文献。
1.2.2   排除标准   ①重复性研究且与研究目的无关性的文献；②无法获取完整资料的文献。
1.3   文献质量评估和数据的提取   根据纳入和排除标准，提取多细胞构建血管化组织工程骨在骨修复中的应用的文章数据，见图2。

文献筛选和质量评估由第一作者独立进行分析。通过筛选与整理，选择符合标准的文献，最终选取63篇文献进行综述，其中中文文献2篇，英文文献61篇。

血管化是骨生长发育的关键过程。近年来的相关研究表明，利用骨形成细胞与血管生成细胞共培养可改善组织工程构建体的血管化和骨形成。其中，大多数研究聚焦于观察在骨形成细胞培养体系中加入血管生成细胞共培养后血管化水平的升高，如内皮标志物的免疫组化染色等，然而，这些研究几乎没有植入体中血管的完整性和功能性的证据，使得研究者对体外多细胞构建血管化组织工程骨的功能有效性提出了质疑，如何有效改善血管化的质量和功能及加速与宿主血管的整合仍是构建血管化组织工程骨的关键问题。
细胞群间的交流在血管生成过程中起着重要作用，两种类型的细胞都分泌特定的生长因子，研究表明细胞间的交流和旁分泌可能受多种因素的影响，然而，目前对于细胞分布和细胞群之间的距离对细胞间交流的影响知之甚少。细胞间可以通过3个主要通信机制进行交流：①两个相邻细胞的膜分子之间的直接相互作用；②在细胞外环境中自由扩散并通过特定受体与靶细胞相互作用的可扩散因子的分泌；③通过细胞外囊泡的释放。虽然采用生物3D打印技术、细胞膜片技术可以实现细胞和生物材料的精准定位，实现机械性能可调、精准控制构建体的内外结构。对于细胞间及细胞群间的交流没有得到重点关注，在制备骨组织工程构建体时不能达到“神似”。制备能够模拟原生细胞间相互作用的体外模型是一项艰难的任务，必须考虑到各种参数。在这方面，基于转基因细胞的使用和基因组编辑以寻找成骨分化的阳性调节因子的策略已得到更多的关注。基因工程细胞具有通过在体外表达成骨诱导基因来诱导间充质干细胞成骨分化的优势，从而促进体内骨形成。此外，通过基因转染持续表达骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子可以促进体内和体外共培养的骨愈合。
总体而言，将重点放在天然组织环境的重现是非常重要的。文章主要对参与血管化骨组织构建的细胞和多细胞组织工程骨构建方法进行了概述，其中，采用基于支架或细胞膜片的组织工程方法可实现对多种细胞类型精准定位的优势，可以为构建仿生天然骨结构提供工程技术参考。创建具有临床所需大小的功能性3D血管化骨结构，还需关注包括细胞培养和生物学作用机制。
实际上，诱导血管生成以及涉及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的生物学过程的分子机制对于提供用于体外骨组织工程和成功的体内应用的可行环境是必不可少的。未来研究结合组织工程、细胞工程和基因工程构建组织工程骨，或许可以实现刺激早期血管生成、保持血液循环，防止构建体内部的细胞死亡，并起到加速构建体修复临床大体积骨缺损的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

文题释义：
血管化：是骨组织工程的关键技术，可为组织工程构建体内的细胞供血和供氧，保证组织工程骨的存活。
血管内皮生长因子：血管生成细胞分泌的血管内皮生长因子是血管生成的主要参与者，它能够通过调节成骨生长因子的释放和旁分泌信号来诱导内皮细胞的迁移和增殖，并间接刺激成骨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

血管化是骨组织再生的关键，良好的血管化为骨组织的修复、组织工程骨的构建提供足够的营养物质、生长因子和氧气等。最佳的组织工程构建体应确保血管网络良好发育，能够为组织再生提供有利的微环境。该综述聚焦于参与骨组织再生的两个主要方面：细胞和组织工程骨构建方法，以确保骨组织工程构建体的良好血管化功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料;口腔生物材料;纳米材料;缓释材料;材料相容性；组织工程

	阅读次数
	全文
	摘要