2.1 实验动物的一般情况 在整个动物手术及其后续的检查过程中，所有动物无死亡发生，实验组第2号和4号动物在手术后发生单侧膝关节脱位，与初始手术过程中经验不足有关，但基本不影响动物术后的进食及日常活动。实验组1只动物发生手术切口周围的感染，经换药清创并局部使用抗生素后愈合。术后2周所有动物切口已经基本愈合，缝合线自动脱落。

2.2 兔股骨远端缺损后4，8，12周实验材料修复骨组织的大体观察结果

术后4周：实验侧材料与周边组织紧密结合，周边新生骨组织向材料的孔隙内长入，原有骨缺损部位界限仍清楚，植入材料无明显吸收变小，其中心部位也无软组织或骨组织长入。对照侧缺损周边部位见少量新生骨组织，中心部位被软组织替代。 术后8周：实验侧材料周边组织进一步向材料内部生长，材料面积与4周时相比明显减小，骨缺损部分边界不清，但中心部位大部分仍被植入材料占据，边缘新生骨组织部分替代植入材料；对照侧新生骨组织略有增多，但缺损部位仍清晰可辨，缺损中心仍被软组织占据。

术后12周：实验侧材料被周边新生骨组织严密包裹，材料与新生骨组织界限不清，但缺损部位仍残留少部分植入材料，新生骨组织长入材料中心部位；对照侧骨缺损部位仍清晰可辨，以纤维组织增生替代为主，新生骨组织未长入骨缺损中心部位，缺损部位无法自行被新生骨组织填充。 2.3 兔股骨远端缺损后4，8，12周实验材料修复骨组织的钼靶X射线照相结果

实验侧：4周时可见植入材料密度明显高于周围正常骨组织，材料的外形轮廓清晰完整，材料与周围正常骨组织的界限清晰，材料内的多孔结构清晰可辨；8周时，材料密度略有降低，材料与周围正常骨组织的界限仍清晰可辨，材料内部无明显的新生骨组织长入，材料可视面积无明显缩小；12周时材料的密度进一步降低，接近正常骨组织的密度，材料与周围正常骨组织的界限模糊，植入材料部分被新生骨组织替代，材料内部可见新生骨组织长入，见图2。

对照侧：在各个时间点的低密度缺损区仅略有缩小，缺损内无新生骨组织长入，见图3。

2.4 材料与骨组织融合的组织学观察 见图4和图5。

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2006年1月至2007年1月在解放军总医院骨科研究所完成。
材料：
实验材料：β-磷酸三钙煅烧骨试件(圆柱状，直径×高度=5 mm×10 mm)，由健康牛股骨经高温煅烧制备形成。
实验动物：健康新西兰大白兔24只，雌雄不限，体质量2.5-3.0 kg，由解放军总医院实验动物中心提供，许可号SYKK-11-00-0047。
β-磷酸三钙煅烧骨修复兔股骨远端骨缺损实验的试剂及仪器：
Main reagents and instruments used in the experiment of repairing distal femur defects in rabbits with β-calcium phosphate sintered bone:

实验方法：
分组：将24只动物按3个取材时间(术后4，8，12周)随机分成3组，每组8只，实验侧下肢骨缺损中植入β-磷酸三钙材料，对照侧仅制造骨缺损模型，不植入任何材料。
β-磷酸三钙煅烧骨的制备：取健康成年牛股骨，剔除表面软组织后使用内径为8 mm的环钻钻取股骨头和股骨远端松质骨，所得骨块呈圆柱形，大小约8 mm×12 mm，将钻取的骨块流水冲洗3 h，蒸馏水漂洗干净后，使用蒸馏水煮沸10 h，中间换液数次，再次流水冲洗3 h，去离子水漂洗2次，系列乙醇脱水，50 ℃烘干4 d。将所得的上述经过处理的圆柱状材料放在高温煅烧炉中煅烧，升温速率10 ℃/min，800 ℃，3 h。煅烧骨块取出后浸泡于浓度为1 mol/L的(NH4)2HPO4 溶液中24 h，去除多余液体，取出试验材料再次50 ℃烘干4 d。将烘干后的材料再次放于高温煅烧炉中煅烧，升温速率5 ℃/min，1 100 ℃，1 h。将上述材料自煅烧炉中取出后自然降温至室温。流水冲洗3 h，去离子水漂洗2次，50 ℃烘干4 d。将所制得材料以内径为5 mm的环钻进一步加工制备成大小为5 mm×10 mm圆柱状试件，单独封装，60Co辐照灭菌后备用。
股骨远端骨缺损模型制作：取分组后的大白兔以速眠新Ⅱ号1.5 mL+氯胺酮2 mL混合后按照0.2 mL/kg肌肉注射麻醉，麻醉生效后取仰卧位，四肢固定稳妥后，触摸外侧股骨髁部，划线做标记，碘伏消毒，铺无菌洞巾，在外侧股骨髁部中点处做垂直纵行切口，长约3 cm，依次切开皮肤、皮下、深筋膜及关节囊暴露股骨外侧及外侧半月板外缘。距股骨远端关节面4 mm处，用实心钻(外径5 mm)与关节面平行由外向内钻孔，深度为12 mm。反复使用生理盐水将骨屑冲洗干净，保持骨面干燥。制备成直径5 mm，深12 mm的股骨远端骨缺损模型，见图1。根据事先分组情况将实验材料植入实验侧骨缺损，对照侧仅制造骨缺损模型，不植入任何材料。

术后处理：动物麻醉苏醒后允许自由活动，自由饮食，分笼饲养，随意活动。术后给予肌注青霉素40×104 U，2次/d，连给2 d。每天观察动物膝关节的肿胀情况、动物的活动、精神、饮食。有无皮肤红肿、感染、渗液以及脓肿。
大体观察：于预定的时间点将动物分批采用空气栓塞法处死后取双侧股骨，取材过程中观察材料植入部位周围组织的变化，在股骨远端上方3 cm处截断，将截取的标本置于体积分数为40%的乙醇中固定7 d，取出，以低速锯沿股骨纵轴方向切开，观察植入材料与骨组织界面之间的变化。
制备不脱钙骨切片：将所获得的标本经脱水、脱脂处理后包埋形成透明包埋块，采用Leica 1600硬组织切片机进行切片，分别切取厚度为50 μm和200 μm的切片。
钼靶软X射线照相：将制备形成的厚度为200 μm的不脱钙骨切片，使用GE公司乳腺钼靶软X射线机曝光，观察骨缺损修复情况，拍摄条件：25 kV，86 mAs，115 ms。
组织学观察：将制备形成的厚度为50 μm的不脱钙骨切片，经Giemsa染色后，使用Olympus公司NP70生物显微镜观察骨缺损修复情况。
主要观察指标：关节面有无骨折及塌陷，新骨长入情况及植入材料降解情况。

3.1 动物模型的选择 评价骨替代材料的成骨活性，股骨钻孔骨缺损模型是人们较常采用模型之一^[4-5]。松质骨是测定生物材料成骨性能的常用部位，通常要求骨缺损直径最少要达到5 mm，否则不填充任何材料的情况下都可以自行愈合。在实验中过程中要注意将骨屑和积血冲洗干净，否则骨缺损也容易自行愈合。在本实验中选用了最常用的5 mm兔股骨远端骨缺损模型，优点在于暴露容易，便于操作，同时缺损直径达5 mm并经冲洗及去除骨屑后经空白对照组实验证实不填充植骨材料其不会自行愈合。

3.2 β-磷酸三钙成骨过程 β-磷酸三钙具有良好的生物相容性和骨传导作用，其生物降解性优于羟基磷灰石，是一种非常理想的、临床应用前景十分诱人的硬组织缺损修复材料^[6-7]。β-磷酸三钙植入后使新骨界面的Ca²⁺含量增高，高于正常骨组织中的Ca²⁺含量；Ca/P摩尔比显著增大，降解吸收所释放的Ca²⁺可能首先扩散于界面周围，形成局部高浓度游离Ca²⁺分布，进而被局部的成骨细胞吸收并使之沉积在骨基质中，逐渐由非结晶的钙盐转变成完全结晶的编织骨，并逐渐进行结构重建。在骨生成过程中，骨要经过不断改建，最初形成的原始骨小梁，纤维排列较乱，含骨细胞较多，支持性能较差，经过多次改建后才具有整齐的骨板，骨单位也增多，骨小梁依照张力和应力排列，以适应机体的运动和负重，这样，β-磷酸三钙在体内便完成了降解-吸收-沉积-再结晶的过程。 

而国内外大量的研究均已经证实β-磷酸三钙具备良好的成骨性能，是一种优良的骨移植替代物，陈勤 等^[8]对β-磷酸三钙植入兔股骨后材料、界面和兔股骨的显微红外光谱进行研究，证明β-磷酸三钙体内植入后不仅陶瓷本身已部分溶解和降解，而且在植入陶瓷的表面和孔隙中以及界面处均已生成新生骨组织。Arai等^[9]采用β-磷酸三钙修复因肿瘤需要取大块自体骨植骨而截取的腓骨造成腓骨缺损的患者，在平均缺损达 15 cm(8-21 cm)腓骨缺损修复术中，14例患者中有12例在术后1.4个月可见骨桥形成将植入β-磷酸三钙连接，术后3.2个月所有儿童患者中磷酸钙均被新骨替代，所有患者中术后平均9.3个月均见β-磷酸三钙大部分被吸收并且新骨形成。Delecrin 等^[10]在一项随机双盲对比试验中将30例使用自体骨和28例使用羟基磷灰石和磷酸三钙双相陶瓷材料进行脊柱侧弯矫形术患者的临床效果进行了随访，平均随访48个月后，二者在矫形效果及融合率上相近，但使用双相陶瓷材料组患者的局部并发症及出血量明显少于使用自体骨组。Gunzburg等^[11]证实单独使用自体骨和使用自体骨与β-磷酸三钙1∶1混合物在单或者双节段后外侧脊柱融合中效果相似。Fujibayashi等^[12]证实在随访26个月后单独使用羟基磷灰石、羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷、自体骨片3组在脊柱融合率上相近，证实羟基磷灰石和磷酸三钙作为自体骨的增容剂在脊柱融合手术中是行之有效的。Ignatius等^[13]报道使用消旋聚乳酸/磷酸三钙复合材料制备形成新材料后经试验证实具有与松质骨接近的生物力学性能，用来修复骨缺损取得了令人满意的效果。有人比较了使用羟基磷灰石/磷酸三钙(20∶80)与自体颗粒骨按照50∶50的比例混合后和单纯自体颗粒骨组在髋关节翻修打压植骨手术中的效果，证实两组之间无差异，术后15周时骨整合良好，自体骨吸收并被新生骨组织替代后羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒被新生骨组织包 围^[14-16]。并且手术过程中髋臼的稳定性较单纯自体骨颗粒组要好。

3.3 研究的创新之处及优势 β-磷酸三钙煅烧骨在制备的过程中成功的保留了天然松质骨的多孔状结构，这种多孔状结构与人类松质骨的空间结构极为相近，而这种多孔结构是血管化过程必须具备的结构基础，虽然各种人工合成的β-磷酸三钙材料均采用各种方法制备形成了一定的孔隙结构，但人工制备的孔隙结构与天然形成的孔隙结构总是难以避免的存在一定的差距。血管化是新骨形成过程的关键步骤，因为血管能提供新骨形成所需的氧、养料、信号分子和一些必要的细胞^[17]。

实验将健康牛松质骨经高温煅烧制备成以β-磷酸三钙为主要成分的煅烧骨，并将其植入实验动物骨缺损部位，证实该种材料可良好的修复骨缺损，是一种满意的骨缺损修复材料。

骨移植是目前仅次于输血的最为常见的组织移植手术，无论是使用自体骨还是使用异体骨修复骨缺损的方法均存在着一定的缺陷。随着材料科学的进步，各类新型组织工程材料的应用及研究为解决这一难题提供了一个新的思路。虽然目前研究的材料较多，但是以羟基磷灰石为主的陶瓷类材料一直是该类研究中的热门材料之一，β磷酸三钙具有与羟基磷灰石相近的组成成分，同时又克服了羟基磷灰石降解缓慢的缺点，是这一类材料中研究较多的品种。本实验采用健康牛松质骨经高温煅烧后制备以β磷酸三钙为主要成分的煅烧骨材料，该材料成功的保留了天然松质骨与人类相近的多孔状结构，这种天然的多孔状结构是新骨形成的基础，具有人工合成的多孔结构难以比拟的优势，为临床上治疗骨缺损的难题提供了一个可行的选择。