集落刺激因子1在活化星形胶质细胞条件培养基诱导神经干细胞分化过程中的表达及功能

doi:10.12307/2022.335

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 2069-2074.doi: 10.12307/2022.335

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集落刺激因子1在活化星形胶质细胞条件培养基诱导神经干细胞分化过程中的表达及功能

单闻，施炜

南通大学附属医院神经外科，江苏省南通市 226000

收稿日期:2020-10-09 修回日期:2020-10-12 接受日期:2020-11-09 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-20
通讯作者: 施炜，博士，教授，南通大学附属医院神经外科，江苏省南通市 226000
作者简介:单闻，男，1993年生，江苏省淮安市人，汉族，2021年南通大学毕业，硕士，主要从事神经再生方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81771335)，项目负责人：施炜

Expression and function of colony-stimulating factor 1 in differentiation of neural stem cells induced by activated astrocyte conditioned medium

Shan Wen, Shi Wei

Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu Province, China

Received:2020-10-09 Revised:2020-10-12 Accepted:2020-11-09 Online:2022-05-08 Published:2021-12-20
Contact: Shi Wei, MD, Professor, Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu Province, China
About author:Shan Wen, Master, Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81771335 (to SW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞集落刺激因子1：促进髓系祖细胞分化为单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和骨吸收破骨细胞的异质群体，并有促进细胞迁移、增殖、分化和存活的能力，经研究发现细胞集落刺激因子1在胚胎发育早期对神经系统发生具有重大作用。
神经干细胞：主要存在于哺乳动物的海马齿状回及室管膜下区，具有向神经元分化的功能。

背景：颅脑外伤后形成的反应性星形胶质细胞可能对神经干细胞向神经元分化产生不利影响，因此研究颅脑外伤后反应性星形胶质细胞对神经干细胞分化的调节作用及其机制对促进神经功能恢复具有很大临床应用前景。
目的：探讨反应性星形胶质细胞对神经干细胞向神经元分化的影响。
方法：体外培养SD大鼠星形胶质细胞，分为对照组和脂多糖刺激组，干预3 d后，采用PCR、ELISA、Western blot检测星形胶质细胞中集落刺激因子1的表达；体外培养SD大鼠原代神经干细胞，在成神经元诱导培养基中加入星形胶质细胞条件培养基共培养3 d，通过免疫荧光和流式细胞术检测β微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白的表达；体外培养原代神经干细胞，在成神经元诱导培养基中加入集落刺激因子1重组蛋白干预3 d，应用流式细胞技术和免疫荧光检测集落刺激因子1对神经干细胞向神经元分化的作用。
结果与结论：①脂多糖刺激后的星形胶质细胞及条件培养基中集落刺激因子1表达极低；②脂多糖刺激的星形胶质细胞条件培养基与神经干细胞共培养后，抑制了神经干细胞向神经元分化；③神经干细胞加入集落刺激因子1重组蛋白干预后，促进了神经干细胞向神经元分化；④结果表明，脂多糖刺激后星形胶质细胞中集落刺激因子1分泌水平下调，抑制神经干细胞向神经元分化，而集落刺激因子1过表达可促进神经干细胞向神经元分化，对大鼠脑损伤具有修复作用。

https://orcid.org/0000-0003-4983-5255(施炜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 颅脑外伤, 脂多糖, 星形胶质细胞, 集落刺激因子1, 神经修复

Abstract: BACKGROUND: The excessive proliferation of reactive astrocytes after traumatic brain injury may have an impact on the differentiation of neural stem cells into neurons. Therefore, studying the regulation of reactive astrocytes on neural stem cell differentiation after traumatic brain injury and its regulation mechanism may have great clinical application prospect for promoting the recovery of neural function.
OBJECTIVE: To investigate the effect of reactive astrocytes on the differentiation of neural stem cells into neurons.
METHODS: Astrocytes of SD rats were cultured in vitro and divided into control group and lipopolysaccharide stimulation group. After 3 days of intervention, the expression of colony-stimulating factor 1 in astrocytes was detected by PCR, ELISA and western blot assay. Primary neural stem cells of SD rats were cultured in vitro, and astrocyte conditioned medium was added to the neuron induction medium for 3 days. Immunofluorescence and flow cytometry were used to detect the expression of β-tubulin III and glial fibrillary acidic protein. Primary neural stem cells were cultured in vitro, and the recombinant protein of colony-stimulating factor-1 was added to the neuron induction medium for 3 days. The effect of colony-stimulating factor-1 on the differentiation of neural stem cells into neurons was detected by flow cytometry and immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of colony-stimulating factor-1 in astrocytes stimulated by lipopolysaccharide and in conditioned medium was very low. (2) The coculture of neural stem cells and astrocyte conditioned medium stimulated by lipopolysaccharide inhibited the differentiation of neural stem cells into neurons. (3) Neural stem cells promoted the differentiation of neural stem cells into neurons by adding colony stimulating factor 1 recombinant protein. (4) The results showed that colony-stimulating factor 1 secretion of astrocytes was down-regulated after stimulation with lipopolysaccharide, and inhibited the differentiation of neural stem cells into neurons. The overexpression of colony-stimulating factor 1 can promote the differentiation of neural stem cells into neurons, which can repair brain injury in rats.

Key words: stem cells, neural stem cell, traumatic brain injury, lipopolysaccharide, astrocytes, colony-stimulating factor 1, nerve repair

中图分类号:

单闻, 施炜. 集落刺激因子1在活化星形胶质细胞条件培养基诱导神经干细胞分化过程中的表达及功能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2069-2074.

Shan Wen, Shi Wei. Expression and function of colony-stimulating factor 1 in differentiation of neural stem cells induced by activated astrocyte conditioned medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 2069-2074.

图/表（结果） 5

2.1 神经干细胞与星形胶质细胞体外培养的纯度及形态神经干细胞提取培养3 d后，细胞聚集生长，形成球状，见图1A；提取星形胶质细胞，经多次提纯，再次种板，细胞呈贴壁生长，细胞形态为星形，见图1B。

2.2 不同条件培养基刺激对神经干细胞分化的影响免疫荧光和流式细胞术检测神经干细胞分化情况。结果显示，与阴性对照组相比，炎症活化的星形胶质细胞条件培养基组β微管蛋白Ⅲ阳性细胞比例明显减少，而胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例明显增加，见图2。实验结果提示炎症刺激后可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化，并抑制其向神经元分化。

2.3 验证脂多糖刺激前后星形胶质细胞中集落刺激因子1的表达细胞免疫荧光、Real-time PCR和Western blot结果显示集落刺激因子1可在正常星形胶质细胞中高表达，而在脂多糖刺激后的星形胶质细胞中表达极低，见图3；ELISA结果显示脂多糖刺激后星形胶质细胞分泌的集落刺激因子1减少。

2.4 集落刺激因子1对神经干细胞分化的影响为了研究集落刺激因子1对神经干细胞分化的影响，在体外分离培养神经干细胞，加入集落刺激因子1重组蛋白干预，利用免疫荧光和流式细胞术检测神经干细胞分化情况。免疫荧光结果表明，与对照组相比，集落刺激因子1组β微管蛋白Ⅲ阳性细胞数量明显增加，而胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量明显减少；此外，流式结果也显示集落刺激因子1组β微管蛋白Ⅲ阳性细胞比例上调，而胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例下调，见图4。实验结果提示集落刺激因子1可促进神经干细胞向神经元分化并抑制其向星形胶质细胞分化。

2.5 生物相容性神经干细胞无细胞毒性，具有良好的生物相容性。

参考文献

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引言

颅脑外伤是造成死亡和残疾的主要原因之一[1]，颅脑外伤后大脑内发生的应激炎症反应会引起中枢神经系统微环境的改变，导致神经元死亡、小胶质细胞活化、炎症和反应性星形胶质变，这些改变将导致组织丧失、神经胶质瘢痕的形成，最终影响神经功能的恢复[2-3]。目前的治疗主要是以外源性的神经干细胞移植为主，但是内源性神经干细胞作为机体自身的细胞，具有外源性神经干细胞无法替代的优势，因此促进内源性神经干细胞分化是治疗中枢神经系统损伤和退行性病变的主要策略之一，但如何促进神经干细胞更多地向神经元分化是当今神经科学领域研究的热点和难点[4]。星形胶质细胞活化已被证明与神经损伤和神经变性有关，影响神经可塑性、学习和记忆，并伴随神经精神障碍、药物成瘾和依赖等症状，研究观察到由于星形胶质细胞功能障碍而导致氧化应激和慢性神经炎症的累积显著促进神经元变性、认知丧失和运动障碍。因此，人们提出反应性星形胶质细胞可作为钝化神经元损伤和减缓脑疾病进程的工具这一假说。研究表明，集落刺激因子1参与了单核/巨噬细胞谱系的分化、增殖、趋化和存活[5]。在中枢神经系统中，集落刺激因子1主要由星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞分泌。在胚胎发育早期，脑内集落刺激因子1的表达降低将会导致神经发育不全[6-7]，且集落刺激因子1能够抑制神经前体细胞的自我更新，促进其向神经元分化而不影响其向星形胶质细胞或少突胶质细胞的分化[8]。
该研究聚焦于颅脑外伤后中枢神经系统内环境的变化，寻找促进神经干细胞分化为神经元的方法，进而促进脑损伤后神经功能的恢复。课题组通过体外构建脂多糖诱导的星形胶质细胞模型，探讨炎症刺激下星形胶质细胞分泌的活性物质对神经干细胞分化的影响并阐述其具体作用机制，为攻破颅脑外伤后中枢神经系统损伤修复局限性找到新方向，并为今后利用神经干细胞进行颅脑外伤临床治疗找到新的靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2019年1月至2020年7月在南通大学附属医院临床实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂、仪器 DMEM/F12基础培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；PBS(Sangon Biotech公司)；脂多糖 (Sigma公司)；20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子(Gibco公司)；20 μg/L 表皮生长因子(Gibco公司)；B27无血清培养基添加剂(Gibco公司)；抗β微管蛋白Ⅲ单克隆抗体、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(Abcam公司)；抗兔、鼠二抗(Abcam公司)；荧光倒置显微镜(ZEISS 公司)；流式细胞仪(Becton Dickinson公司)；DAB显色试剂盒(Bio-Rod公司)；集落刺激因子1酶联免疫吸附试剂盒(联科公司)；Image Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics公司)。
1.3.2 实验动物 SPF级孕15 d SD大鼠，新生1 d SD大鼠，由南通大学实验动物中心提供，实验动物机构许可证号为SYXK(苏)2017-0046，实验过程中室温保持在(23±2) ℃，相对湿度40%-60%，对大鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中的动物伦理学要求。
1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞培养并诱导分化将孕15 d的SD大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，剪开腹部皮肤将胚胎取出，置于DMEM/F12基础培养基中，在冰上剪开胎膜取出胚胎，分离出胚胎的海马部分，并去除脑膜等其他组织结构，用1 mL DMEM/F12基础培养基重悬，1 200 r/min离心3 min，弃上清，重复3次，将其以1×106的密度接种于T25培养瓶中，悬浮培养。

1.4.2 星形胶质细胞条件培养基的制备取新生1 d的SD大鼠，剪开颅骨，取出完整的脑组织，置于DMEM/F12基础培养基中，用眼科镊分离出双侧的大脑皮质，机械解离成单细胞悬液，1 200 r/min离心3 min，重复3次，弃上清，用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基重悬，以5×105个/T25培养瓶种植，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中进行培养。经多次提纯后，以5×105个细胞密度接种于T25培养瓶中，分为对照组与实验组，实验组加入脂多糖刺激星形胶质细胞，终质量浓度为5 mg/L，对照组不做处理，培养3 d后用PBS清洗3遍，加入DMEM/F12基础培养基培养12 h，吸出培养基，1 200 r/min离心3 min，取上清，即为脂多糖刺激的星形胶质细胞条件培养基和正常的星形胶质细胞条件培养基。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定条件培养基中集落刺激因子1水平。
1.4.3 免疫印迹检测星形胶质细胞中集落刺激因子1的表达分离提取正常星形胶质细胞和脂多糖刺激后的星形胶质细胞，PBS清洗3遍，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后进行凝胶电泳，Bio-Rad半干转印系统转膜，此后置于5%脱脂牛奶中封闭2 h，加入一抗(集落刺激因子1，β-actin，1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，加入二抗 (1∶5 000)室温孵育2 h，TBST漂洗3次，通过增强化学发光试剂盒进行显像，Image J 软件分析并量化每个条带的灰度值，以β-actin为内参，实验重复3次。
1.4.4 PCR检测脂多糖刺激后星形胶质细胞中集落刺激因子1的表达变化分离提取正常星形胶质细胞和脂多糖刺激后的星形胶质细胞，PBS清洗3遍，加入Trizol，吹打离心，提取总RNA后用Nanodrop 2000检测样品的浓度和纯度。按照RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒将1 μg总RNA反转录获得cDNA，按照Fast Start Universl SYBR说明书，在StepOnePlusTMPCR仪进行扩增，以GAPDH为内参。反转录反应条件为65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min， 72 ℃ 5 min；扩增反应条件： 1个循环(95 ℃ 10 min)；40个循环(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 40 s)。每组设置3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，引物序列见表1。

1.4.5 神经干细胞诱导分化取生长状况良好的神经干细胞，接种于已经用多聚赖氨酸包被好的6孔板和24孔培养板中(以1×106的密度种于6孔板，以5×105的密度种于24孔板)，并加入成神经元诱导培养基培养3 d。细胞分组如下：①DMEM/F12阴性对照组：加入500 μL DMEM/F12基础培养基与500 μL含体积分数4%胎牛血清的DMEM/F12培养基混合培养；②正常的星形胶质细胞条件培养基组：加入500 μL正常的星形胶质细胞条件培养基与500 μL含体积分数4%胎牛血清的DMEM/F12培养基混合培养；③炎症活化的星形胶质细胞条件培养基组：加入500 μL脂多糖刺激的星形胶质细胞条件培养基与500 μL含体积分数4%胎牛血清的DMEM/F12培养基混合培养；④空白对照组：加入含体积分数2%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养；⑤集落刺激因子1组：加入20 μg/L重组蛋白集落刺激因子1与含体积分数2%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。
1.4.6 流式细胞学实验神经干细胞诱导分化后第3天，去除培养基，PBS清洗3遍，加入胰酶消化后，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中消化3 min，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中止消化，将细胞悬液吸出置于15 mL离心管中，以1 200 r/min离心3 min，弃上清，用1 mL PBS重悬清洗后再次以1 200 r/min离心3 min，弃上清，重复3次，利用流式细胞术对细胞表面标记物β微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白进行检测。
1.4.7 免疫荧光染色观察神经干细胞分化后β微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白的表达以及星形胶质细胞中集落刺激因子1的表达取各组诱导分化后的神经元细胞以及脂多糖刺激后的星形胶质细胞，PBS清洗1遍，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS清洗3遍，每遍10 min，置于含0.1%Triton-100和3% BSA的PBS中室温封闭2 h，加入一抗(集落刺激因子1、β微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，PBS清洗3遍，加入二抗室温孵育2 h，用Hoechst33342室温下避光染色10 min，PBS清洗后甘油封固，最后于荧光显微镜下观察并计数β微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白与集落刺激因子1阳性细胞数量。
1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪检测各组神经干细胞诱导分化后神经元表面标记物β微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白的表达；②荧光倒置显微镜观察各组神经干细胞诱导分化后神经元细胞中β微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白的表达以及星形胶质细胞中集落刺激因子1的表达；③免疫印迹、PCR检测各组星形胶质细胞中集落刺激因子1的表达变化。
1.6 统计学分析数据以平均值±标准误表示，用GraphPad Prism 5.0统计软件分析数据，两组间比较采用双尾Student’s t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

急性脑损伤按机制主要可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤，其中在原发性损伤期间发生的生理和病理变化可能会延迟、延长，发展为持续数小时乃至数年的继发性损伤，主要改变包括兴奋性毒性、线粒体功能障碍、氧化应激、脂质过氧化、神经炎症、轴突变性和细胞凋亡等[9-11]。总的来说是中枢神经系统内环境的剧烈变化，引起神经元细胞的死亡，胶质细胞的激活与增殖，最终导致神经功能的丧失[12]。
研究表明，侧脑室室下带区和海马齿状回颗粒下区的神经干细胞在整个生命过程中都能够自我更新[13]，成熟、整合并改造现有的神经回路，以实现适应性反应并维持神经可塑性。但是如何在脑损伤后所形成的高度炎症、缺乏血液(氧气和葡萄糖)供应、炎性细胞因子积累、免疫细胞激活浸润的环境中促进神经干细胞向神经元分化是一直以来难以解决的问题[10，14-15]。因此，如果对病变部位损伤环境进行更好地控制，从而促进中枢神经系统微环境由促炎环境转变为抗炎和神经保护(神经营养性)环境非常关键，这种最佳的微环境不仅有助于保留现有的神经元，还可以使内源性神经干细胞增殖并分化成新的神经元，从而建立新的神经网络。最近研究表明星形胶质细胞作为中枢神经系统的重要组成部分之一，在正常生理情况下，具有调节大脑能量代谢，构成血脑屏障，促进离子、水和能量底物交换等功能[16-17]，而在损伤之后星形胶质细胞会被激活，从而导致星形胶质细胞的生理功能发生改变，使其不仅具有介导炎症反应的功能，而且具有分泌细胞因子和趋化因子等影响神经干细胞增殖、迁移和分化的功能[18-20]。因此，为了研究炎症刺激下星形胶质细胞分泌的活性物质对神经干细胞分化的影响并阐述其具体作用机制，课题组通过脂多糖构建了体外星形胶质细胞的经典炎症活化模型，然后提取其条件培养基与神经干细胞进行共培养，结果表明，相对于正常星形胶质细胞，活化星形胶质细胞的条件培养基可以显著抑制神经干细胞向神经元分化，并促进其向星形胶质细胞分化，这提示通过探索活化前后星形胶质细胞外分泌蛋白差异，以及这些外分泌蛋白对神经干细胞分化的影响，可以为颅脑外伤后的神经干细胞分化及损伤修复提供良好的研究方向。通过对星形胶质细胞条件培养基进行蛋白质谱检测，发现正常星形胶质细胞条件培养基和活化星形胶质细胞条件培养基之间存在大量的差异蛋白。通过GO功能富集分析，发现一种外分泌糖蛋白——集落刺激因子1。集落刺激因子1是调节巨噬细胞稳态的主要因子[21]，在外周系统中，集落刺激因子1主要调节巨噬细胞的迁移、增殖和存活，以及先天和适应性免疫系统功能[22]，而在中枢神经系统中，集落刺激因子1及其受体在多种中枢神经细胞中存在，并且在调控细胞发育、定向迁移、营养支持、增殖、神经分化和存活中发挥重要作用[8]。通过实验验证，在活化性星形胶质细胞中的集落刺激因子1表达水平和分泌水平较正常星形胶质细胞显著下调。此外，在体外培养中的神经干细胞中加入集落刺激因子1重组蛋白后，流式细胞技术与免疫荧光等实验发现神经干细胞向神经元分化的比例显著增多，而向星形胶质细胞分化的比例减少，这表明集落刺激因子1有促进神经干细胞向神经元分化的作用。
综上所述，在反应性星形胶质细胞中的集落刺激因子1表达和分泌水平较正常星形胶质细胞明显下调，其次在神经干细胞中过表达集落刺激因子1后，神经干细胞向神经元的分化比例明显上调，而星形胶质细胞比例下调，提示集落刺激因子1有促进神经干细胞向神经元分化并抑制其向星形胶质细胞分化的功能，但对其产生作用的具体信号通路尚不明确，今后课题组将深入研究集落刺激因子1产生作用的信号通路的上下游分子，为集落刺激因子1促进神经干细胞向神经元分化提供更明确依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

集落刺激因子1在活化星形胶质细胞条件培养基诱导神经干细胞分化过程中的表达及功能

Expression and function of colony-stimulating factor 1 in differentiation of neural stem cells induced by activated astrocyte conditioned medium

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