2.1   Ti颗粒对RAW264.7细胞增殖的影响   共培养第24，48和72小时显微镜下观察细胞，在预设的Ti颗粒质量浓度   (0.1 g/L)中，Ti颗粒散在，未见明显覆盖及遮挡细胞，不影响后续实验细胞观察，见图1。



与对照组比较，酶标仪检测450 nm波长吸光度值未见明显升高或降低，见图2。结果说明，质量浓度为0.1 g/L的Ti颗粒对细胞增殖基本没影响，可应用于后续实验。



2.2   miR-25过表达后破骨细胞生成情况   RAW264.7细胞转染完成后，镜下观察见转染成功，见图3。



加入Ti颗粒共培养，5 d后显微镜下观察破骨细胞分化情况：无Ti颗粒诱导组基本未见破骨细胞生成，可见单纯miR-25 NC以及miR-25 mimics对RAW264.7细胞向破骨细胞分化无影响作用；经过Ti颗粒诱导后，miR-25 NC+Ti组及miR-25 mimics+Ti组均出现了TRAP染色阳性多核破骨细胞，miR-25 NC+Ti组破骨细胞体积相对较大，细胞数目较多，miR-25 mimics+Ti组破骨细胞体积相对较小，细胞数亦较少，见图4。镜下观察并计数，结果表明200倍镜下每孔破骨细胞数：miR-25 NC组为1.07±0.15，miR-25 mimics 组为0.47±0.25，miR-25 NC+Ti组为43.33±4.04，miR-25 mimics+Ti组为20.67±2.52，与miR-25 NC组比，miR-25 mimics+Ti组破骨细胞生成显著下降52.30%(P < 0.05)。



2.3   miR-25过表达后NFATc1的激活情况   各组细胞共培养1 h后，行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察发现：在Ti颗粒诱导的各组细胞中，相比于无Ti颗粒诱导，NFATc1激活增加，荧光强度较高；与miR-25 NC+Ti组比，miR-25过表达组(miR-25 mimics +Ti)的荧光强度低，NFATc1激活降低，见图5。



2.4   miR-25过表达后对破骨细胞分化通路中相关信号分子表达的影响   为明确miR-25过表达影响破骨细胞分化的相关机制，对于Ca2+/NFATc1信号通路中相关因子进行了检测。共培养5 d后收获各组细胞，行RT-PCR 检测，以β-actin为内参，测定各组细胞NFATc1、CaMKⅡ、CaMKⅣ mRNA的相对表达量，4组间各基因相对表达量差异有显著性意义；两两比较结果发现，相对于miR-25 NC+Ti组，在miR-25mimics+Ti 组，miR-25过表达后， NFATc1受到影响，激活减少，NFATc1 mRNA降低明显(P < 0.005)，CaMKⅡmRNA水平降低(P < 0.005)，CaMKⅣmRNA的表达量也明显降低(P < 0.000 1)，见表2。

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全髋关节置换是髋关节退行性疾病以及关节炎的有效治疗方式，但随着人工髋关节置换数量的增加以及患者寿命的延长，假体失效问题日益加重[1]。而患者高龄、骨质疏松、骨质缺损、假体价格昂贵以及医师经验等各种因素给关节翻修手术造成了较大的障碍[2]。无菌性松动是假体失效需要翻修手术的主要原因之一[3]，如果能针对假体无菌性松动的发病机制做出有效预防或治疗，对于提高髋关节假体寿命以及减少关节翻修手术具有重要意义。无菌性松动的理论机制繁多，但一般认为假体组件间的相对运动及材料的降解和退变产生磨损颗粒(钛、聚乙烯、骨水泥等)，引起假体周围促炎性细胞因子表达增加，诱导破骨细胞分化，致使假体周围骨溶解，最终导致人工关节松动、假体失效[4-5]。因此，抑制破骨细胞过度分化已成为假体周围骨溶解预防和治疗的主要方向。
Ca2+/活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)信号传导是磨损颗粒导致假体周围骨溶解的重要通路，破骨细胞分化过程中受到外来刺激后，胞浆膜上的钙通道打开，钙内流导致胞质Ca2+浓度升高，受到Ca2+振荡刺激后，NFATc1发生去磷酸化，向细胞核转位，促进破骨细胞特异性基因的表达，同时钙调蛋白依赖性蛋白激酶(calmodulin dependent protein kinases，CaMKs)活化，参与CREB通路促使破骨细胞分化，并与NFATc1协同作用增强破骨细胞活性[6]，可见NFATc1在破骨细胞分化中发挥极其重要的作用。在抑制NFATc1信号的相关研究中，转录后调节是常见的调节方式，其中极为重要的一种就是微小RNA(microRNA，miRNA)。
miRNA是一类独特的内源性非编码RNA，在物种间高度保守，成熟的miRNA可以通过与目标mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)的不完全序列特异性结合，抑制目标mRNA的翻译或者使其稳定性降低甚至降解[7]，单一miRNA可以同时靶向多个mRNA，而单一mRNA的表达可以由多种miRNA进行调节，因此对特定 miRNA 表达的研究可增强对疾病发病机制的认识，为疾病的预防和治疗提供新的方向[8]。在NFATc1信号通路的调控方面，已有研究表明miR-25的下调与NFATc1过度激活相关，对miR-25的体内抑制能通过靶向转录因子Hand2使鼠心肌更易出现心力衰竭[9]。miR-25是miR-106b/25基因簇(miR-106b、miR-93和 miR-25)的成员，在细胞增殖、分化、迁移以及细胞死亡等过程中起重要的调节作用[10]：miR-25的过表达能保护细胞免受通过Fas/FasL途径引起的细胞凋亡[11]；肿瘤研究中，miR-25可调节癌症干细胞的特性，并可能增强对抗癌疗法的抵抗力[12]；最近的研究发现miR-25在成熟的破骨细胞中表达降低，可以作为抑制破骨细胞分化的靶标，具体机制有待进一步探索[13]。
从上述材料中作者推测miR-25的过表达能调节破骨细胞分化，可能与Ca2+/NFATc1信号通路相关。此次实验在体外建立Ti颗粒诱导骨溶解模型，转染miR-25模拟物(mimics)至RAW264.7细胞，探讨miR-25过表达在Ti颗粒诱导的破骨细胞分化中的作用及机制，以期为磨损颗粒导致的假体周围骨溶解的治疗提供新的思路。

1.1   设计   体外细胞学实验。
1.2   时间及地点   实验于2019年7月到2020年6月在徐州医科大学主校区公共实验平台完成。
1.3   材料   钛颗粒(93%的颗粒直径< 20 μm，货号#00681，Alfa Aesar，Thermo Fisher Scientific公司)；RAW264.7细胞(中科院上海细胞库，货号TCM13)；胎牛血清、DMEM/H培养基(Hyclone公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁)； Lipofectamine™ RNAiMAX Transfection Reagent转染试剂(Invitrogen公司)；miR-25模拟物及阴性对照(miR-25 mimics，miR-25 NC，上海吉玛)；TRAP染色试剂盒(Sigma 公司)；NFATC1抗体(Abcam 公司)；Hoechst33258染色剂(碧云天公司)；Cy3标记山羊抗兔IgG (Servicebio公司)；Trizol 试剂(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Vazyme公司)；qPCR反应试剂盒(Vazyme公司)。
1.4   实验方法   根据文献所述构建假体周围骨溶解的体外细胞学模型[14-15]，观察miR-25过表达在Ti颗粒诱导的破骨细胞分化过程中的影响以及其中的信号通路。
1.4.1   细胞培养   RAW264.7细胞添加含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，置于37 ℃体积分数5%CO2培养箱中，定期换液并观察细胞生长情况，细胞增殖至培养皿底部面积70%左右时，胰酶消化并传代，取状态良好的细胞进行后续实验。
1.4.2   细胞增殖检测   取对数生长期细胞，调整细胞浓度为3×107 L-1接种至48孔细胞培养板，每孔100 μL。将Ti用培养基配置为0.1 g/L质量浓度作用于细胞[16]，于共培养第24，48和72小时在显微镜下观察细胞生长，然后每孔加入15 μL的CCK-8溶液，37 ℃，体积分数5%CO2培养箱内培养避光孵育4 h，室温摇床震荡10 min，酶标检测仪于450 nm波长处测量同一时间点各孔吸光度值，实验选用Ti颗粒零添加组(培养基+RAW264.7细胞)作为对照，进行细胞增殖分析，判断细胞生长覆盖情况和细胞增殖情况。
1.4.3   细胞转染   脂质体瞬转法，以miR-25 mimics(过表达组)、miR-25 NC(对照组)转染RAW264.7细胞。取对数生长期细胞用于实验，调整细胞浓度为3×107 L-1，分别接种至48孔细胞培养板，每孔300 μL，根据Lipofectamine™ RNAiMAX说明书要求，细胞转染时浓度为40%-50%，使SiRNA浓度为30 nmol/L配制复合物，吸取培养板中各孔上清，PBS清洗细胞，每孔加入40 μL的复合物和160 μL的培养基，轻轻前后摇匀；37 ℃，体积分数5%CO2培养箱内培养6 h，吸取上清液后PBS清洗，加入200 μL的DMEM/H完全培养基。再次培养48 h后，于荧光显微镜下观察转染情况，转染成功后加入Ti颗粒共培养以诱导破骨细胞分化。
1.4.4   实验分组   实验分为以下4组：miR-25 NC组； miR-25 mimics组；miR-25 NC+Ti组； miR-25 mimics +Ti组。培养条件：RAW264.7细胞加含体积分数10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基，在37 ℃体积分数5%CO2培养箱中培养；钛颗粒质量浓度为0.1 g/L。
1.4.5   TRAP染色及破骨细胞鉴定   按上述实验分组培养，细胞生长至对数生长期时，调整细胞浓度为3×107 L-1，分别接种至96孔细胞培养板，每孔100 μL；5 d后收获各组细胞，固定液固定后去离子水冲洗待用，按TRAP试剂盒说明书配制染色液，细胞加入染色液后，37 ℃避光孵育1 h，加入Hematoxylin复染2 min，碱性自来水冲洗，晾干后于显微镜下拍照观察，将TRAP染色阳性且细胞核≥3个的多核巨细胞认定为破骨细胞。每孔随机取10个视野，计数破骨细胞个数，重复计数3次，取均值。
1.4.6   免疫荧光检测NFATcl的激活   各组调整细胞浓度为3×107 L-1，接种至48孔细胞培养板，每孔300 μL，转染后加入0.1 g/L的Ti颗粒作用细胞1 h后即取出48孔板，弃去培养基，PBS漂洗后每孔加入200 μL的40 g/L多聚甲醛固定液，室温固定30 min；每孔加入 0.1% Triton x-100，室温静置10 min；加入5%牛血清封闭液500 μL于37 ℃孵育2 h；每孔加入200 μL采用2%牛血清1︰20稀释的NFATC1抗体，4 ℃过夜；再次使用牛血清封闭液后孵育15 min，然后各孔分别加入200 μL采用2%牛血清稀释1︰200稀释的二抗，37 ℃避光孵育1 h；PBS漂洗后吸走液体，加入Hoechst染色液，质量浓度为2 mg/L，室温避光染色15 min，最后甘油封固，荧光显微镜下拍照观察。 
1.4.7   Real-time PCR检测Ca2+/NFATc1信号通路中信号分子的表达变化  
(1)样本准备：将Raw264.7细胞扩增培养，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，分别接种至6孔细胞培养板，每孔3 mL，转染步骤如1.4.3，转染后加入0.1 g/L的Ti颗粒作用细胞5 d后进行PCR检测。
(2)细胞RNA的提取：取上述各组细胞，每EP管内加 入1 mL Trizol，室温静止裂解5 min，加入预冷的氯仿200 μL，
剧烈振荡15 s，室温放置10 min至其分层，离心(4 ℃，   12 000 r/min) 15 min；吸出上层水相转移至无RNA酶的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃冰箱放置     30 min；再次离心(4 ℃，10 000 r/min)15 min得到RNA沉淀物；体积分数75%乙醇(DEPC处理水配制)洗涤沉淀，离心       (4 ℃，8 000 r/min)5 min，弃上清后吸净残存乙醇，室温干燥 5-10 min；加入适量的Rnase-free H2O溶解RNA，-20 ℃保存待用。
(3)反转录cDNA：采用第一链cDNA合成试剂盒合成，反应体系为Total RNA 5 μL，Random Primer p(dN) 61 μL，Rnase-free ddH2O 5 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTP Mix           2 μL，Rnase inhibitor 1 μL，AMV Reverse Transcriptase 2 μL，混匀后37 ℃ 5 min，42 ℃温浴60 min，70 ℃温浴10 min，终止反应。
(4)实时荧光定量PCR(RT-PCR)：各反转录引物由上海生工设计并合成，以β-actin为内参，引物序列见表1；根据RT-PCR反应体系配制反应液。在PCR反应管中分别加入ddH2O 7 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA模板1 μL，充分混匀。扩增条件为：94 ℃ 10 min，(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，
72 ℃ 20 s) 40个循环。以β-actin为内参测定各组细胞NFATc1、CaMKⅡ、CaMKⅣ mRNA的相对表达量，PCR扩增完成后，实时荧光定量PCR仪分析结果，根据阴性对照调整阈值和基线确定各个标本的Ct值，导出结果后采用2-∆∆Ct法半定量分析目的基因在对照组和干预组之间的表达差异。

1.5   主要观察指标   ①CCK-8法检测Ti颗粒对RAW264.7细胞增殖能力的影响，确定后续实验所需的Ti颗粒质量浓度；②TRAP染色对破骨细胞进行鉴定及计数；③脂质体转染法，以miR-25 mimics转染RAW264.7细胞，免疫荧光检测NFATc1的激活；④RT-PCR测定miR-25过表达后信号通路因子NFATc1、CaMKⅡ、CaMKⅣ mRNA的表达情况。
1.6   统计学分析   各组结果以x±s表示，采用单因素方差分析进行数据处理，以P < 0.05为差异有显著性意义。

破骨细胞分化导致的假体周围骨溶解是人工全髋关节置换手术远期效果欠佳的主要原因[17]。破骨细胞作为体内唯一的骨吸收细胞，它的分化及调控对于假体周围骨溶解具有重要的治疗和预防意义。在这个方向目前已有的临床试验主要为Fc-OPG或抗RANKL治疗，主要针对RANKL信号通路，但该通路下游信号分子众多，所涉及的功能调控复杂，虽然临床试验中未报告总体恶性风险增加或转移性骨肿瘤恶化，但动物实验显示抗RANKL治疗可导致小鼠淋巴结形成受限甚至缺失，更容易受到实验性和自发性肿瘤转移的影响，并且对化学致癌物更为敏感[18-19]。此外，二膦酸盐也被报道能抑制破骨细胞吸收功能，并应用于骨质疏松症和Paget病，但是没有直接证据能证明参与假体周围骨溶解的治疗[20-21]。鉴于上述疗法的局限性，Ca2+/NFATc1信号通路成为了抑制破骨细胞分化的新目标。Homer2和Homer3通过与钙调神经磷酸酶相互作用来调节NFATc1的功能，通过删除该基因调节RANKL诱导的破骨细胞生成和骨代谢[22]。在破骨细胞形成过程中，G蛋白α亚基的G12家族通过NFATc1分化以及通过RhoA在细胞迁移和吸收活性中发挥作用[23]。前述通过抑制Ca2+/NFATc1来预防破骨细胞分化的方法均使用了基因敲除，在操作和成本上均有较大限制。
与传统的基因敲除相比，miRNAs是非常合适的治疗靶标，投入相对较小，操作简便，即使在靶标选择性的情况下，它们也可以很容易地被药理学模仿或拮抗(miR mimics或antagomiRs)[24]。miR-21的下调被证明与破骨细胞凋亡相关，可应用于骨质疏松症的治疗[25]，miR-150通过调节Osteoactivin/GPNMB的表达，充当成骨细胞的负调节剂和破骨细胞的正调节剂[26]。结合最近的研究中miR-25被证明在破骨细胞分化中表达降低[13]，此次实验选择了miR-25作为调控手段。
在体外破骨细胞分化的研究中，作者根据前人经验以钛颗粒诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化作为假体周围骨溶解体外模型：首先，RAW264.7细胞株作为破骨细胞前体细胞被广泛应用，因为该细胞能在诱导下分化为成熟的破骨细胞，并具有从原代细胞分化而来的破骨细胞的生物学功能，相关基因也能正确表达[27]，并且细胞株培养过程标准，可重复强；其次，在目前假体周围骨溶解普遍认同的磨损颗粒假说理论中，Ti颗粒是主要磨损颗粒之一，被证实在体外实验中可刺激细胞产生促炎性因子并诱导破骨细胞分化[28]，作为破骨细胞分化研究的刺激因子已被普遍应用。此次研究中，该模型也得到了侧面的印证，钛颗粒与RAW264.7细胞共培养5 d后，miR-25过表达组及阴性对照组均出现了TRAP染色阳性多核破骨细胞，无Ti颗粒诱导组基本未见破骨细胞生成。
NFATc1是破骨细胞分化过程中的主要转录因子[29]，异位表达NFATc1基因后，骨髓源巨噬细胞即便缺乏RANKL诱导也可经历破骨细胞分化[30]。体外实验中NFATc1失活能抑制Ti颗粒诱导的破骨细胞分化[31]。此次实验中，RAW264.7细胞受到Ti颗粒刺激后，胞浆膜上的钙通道打开，细胞外钙流入胞内，导致胞液Ca2+浓度升高，Ca2+结合蛋白构象转变，NFATc1去磷酸化而经历有效的核转位后被激活[29]，在细胞转染后共培养1 h行免疫荧光检测，发现miR-25过表达组NFATc1激活显著减少，这一结果与其他miR调控NFATc1信号通路产生的结果类似，原因可能与miR-25过表达遏制了NFATc1核定位信号的暴露有关[32]，后续RT-PCR实验中   miR-25过表达组NFATc1 mRNA 表达减少，破骨细胞生成较对照组减少，显示了NFATc1在破骨细胞生成过程中的关键性以及miR-25的调控作用。
在Ca2+/NFATc1信号途径中，CaMKs也是传递钙信号的重要分子。研究证明CaMK家族的成员CaMKⅡ/Ⅳ明显参与破骨细胞的分化和功能，药物抑制CaMK以及CaMK Ⅳ的敲除可使CREB的磷酸化降低，抑制破骨细胞生成，CaMK-CREB途径还与NFATc1合作调节破骨细胞特异性基因的表达，另一方面CaMKs与c-Fos协同作用于NFATc1基因启动子，触发NFATc1自扩增机制[33-34]。此次实验中miR-25过表达后CaMKⅡ/Ⅳ水平下降，导致NFATc1基因表达自发扩增机制不能触发，破骨细胞活性降低。作者在miRDB、Targetscan以及TangetMiner在线检索miR-25靶标，结果提示miR25在3’-UTR与CaMKⅡ存在存在结合位点(GUGCAAUA)，实验中共培养5 d后RT-PCR检测发现在miR-25 过表达组CaMKⅡmRNA表达降低，破骨细胞生成减少，这可能是由于miR-25与CaMKII的mRNA 结合所引起的。而CaMKⅣ并非miR-25的直接靶标，mRNA水平出现降低，则有可能与 miR-25调控某些钙离子通道，导致Ca2+信号变化影响细胞进程相关[35]。 
假体周围骨溶解是在生物体内发生的极为复杂的病理过程，miR-25过表达虽然能抑制Ca2+/NFATc1信号通路，导致Ti颗粒诱导的破骨细胞分化减少，但可能会对生物体内Ca2+信号参与的其他细胞进程产生影响，此次研究未能进行动物学实验来检验这种治疗方式的不利因素，下一步研究将进行动物学的体内实验，并检测miR-25在体内的表达水平变化及其与破骨细胞分化、假体周围骨溶解的相关度，以验证这种干预方式的有效性及准确性。
结论：总之，在Ti颗粒诱导的体外破骨细胞分化研究过程中，miR-25过表达能有效作用于Ca2+/NFATc1信号途径，导致NFATc1激活减少，CaMKs表达降低，破骨细胞生成减少，破骨细胞分化受到miR-25负调节。此次研究为从Ca2+/NFATc1信号途径抑制破骨细胞分化提供了实验证据，但其中的具体机制，尤其是Ca2+信号相关的细胞进程，需要进一步研究，希望能为磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解的治疗奠定部分基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
microRNA：长度为21-25 nt的一类内源性非编码小RNA，其主要功能是介导转录及转录后水平基因调控。此次研究中miR-25过表达通过miRNA mimics技术，化学方法合成模拟生物体内源的miRNAs，增强内源性miRNAs的功能。
活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)：又称NFAT2，是转录因子NFAT家族的重要成员，除响应于渗透压激活的NFAT5外，其他家族成员NFAT1-4主要受丝氨酸/苏氨酸磷酸酶神经钙蛋白调节，被细胞内Ca2+激活，参与各种细胞的功能和发育。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Ca2+ /NFATc1信号传导是磨损颗粒导致的假体周围骨溶解的重要通路，破骨细胞分化过程中，受到外来刺激后，胞浆膜上的钙通道打开，钙内流导致胞质Ca2+浓度升高，受到Ca2+振荡刺激后，NFATc1发生去磷酸化，向细胞核转位，促进破骨细胞特异性基因的表达，同时CaMKs活化，参与CREB通路促使破骨细胞分化，并与NFATc1协同作用增强破骨细胞活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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