唑来膦酸干预去势大鼠牙槽骨骨代谢及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体表达的变化

doi:10.12307/2022.531

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2660-2666.doi: 10.12307/2022.531

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唑来膦酸干预去势大鼠牙槽骨骨代谢及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体表达的变化

霍花，刘官娟，宋娜，周倩，程余婷，罗珊珊，廖健

贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2021-03-26 修回日期:2021-04-01 接受日期:2021-05-07 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-24
通讯作者: 廖健，博士，教授，主任医师，贵州医科大学口腔医学院/附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:霍花，女，1992年生，贵州省遵义市人，苗族，贵州医科大学在读硕士，主要从事口腔修复与种植学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82060207)，项目负责人：廖健

Effects of zoledronic acid on alveolar bone metabolism and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome in the alveolar bone of ovariectomized osteoporosis rats

Huo Hua, Liu Guanjuan, Song Na, Zhou Qian, Cheng Yuting, Luo Shanshan, Liao Jian

Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2021-03-26 Revised:2021-04-01 Accepted:2021-05-07 Online:2022-06-18 Published:2021-12-24
Contact: Liao Jian, MD, Professor, Chief physician, Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Huo Hua, Master candidate, Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82060207 (to LJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein 3，NLRP3)炎症小体：由受体蛋白NLRP3、衍接蛋白(凋亡相关斑点样蛋白)和效应蛋白(半胱天冬氨酸蛋白酶1前体)三部分组成。受体蛋白是炎症小体的核心，NLRP3炎症小体信号通路的激活包括两个步骤：首先，病原体识别受体识别与病原体相关的分子模式，或者细胞因子受体识别与危险相关的分子模式，激活核因子κB，活化的核因子κB能诱导NLRP3和无活性半胱天冬氨酸蛋白酶1前体转为有活性的半胱天冬氨酸蛋白酶1而作用于白细胞介素1β前体和白细胞介素18前体，促进其成熟和活化，引发一系列炎症反应。

背景：唑来膦酸为经典的双膦酸盐类骨吸收抑制剂，但其对下颌牙槽骨骨代谢的影响及机制尚存在争议。
目的：观察唑来膦酸对去卵巢骨质疏松大鼠牙槽骨吸收及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体的影响。
方法：将36只雌性SD大鼠随机分3组，即假手术组、骨质疏松组(行双侧卵巢切除术)，唑来膦酸组(双侧卵巢切除，之后给予唑来膦酸)，每组12只。术后12周唑来膦酸组皮下注射20 μg/kg唑来膦酸，假手术组和骨质疏松组给予相同剂量的生理盐水。于给药后4周麻醉动物取出下颌牙槽骨进行检测，通过Micro-CT观察牙槽骨骨质骨量及骨吸收情况；苏木精-伊红染色观察牙槽骨病理变化；抗酒石酸酸性磷酸酶染色鉴定牙槽骨破骨细胞数量；免疫组织化学技术检测牙槽骨内核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3蛋白的表达；Western blot检测牙槽骨内核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β蛋白的表达水平。
结果与结论：①与假手术组相比，骨质疏松组骨小梁结构出现断裂，有大量骨吸收陷窝，牙槽骨表面不平整；同时牙槽骨骨体积分数、骨小梁厚度、骨密度降低，骨小梁分离度增加，牙槽骨破骨细胞数目明显增多(P < 0.05)；与骨质疏松组相比，唑来膦酸组牙槽骨骨微结构改善，上述病理症状明显减轻；②免疫组织化学染色显示，骨质疏松组牙槽骨组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3蛋白表达水平高于假手术组(P < 0.05)，而唑来膦酸组表达水平低于骨质疏松组(P < 0.05)；③Western blot结果显示，与假手术组相比，骨质疏松组核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β蛋白均高表达；与骨质疏松组相比，唑来膦酸组其蛋白表达水平降低(P < 0.05)；④以上结果说明，唑来膦酸能有效抑制骨质疏松大鼠体内牙槽骨组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β蛋白的表达，并减少下颌牙槽骨破骨细胞数量，抑制牙槽骨吸收。

https://orcid.org/0000-0003-1960-0148 (霍花)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 唑来膦酸, 去卵巢大鼠, 牙槽骨, 骨质疏松症, 骨代谢, 破骨细胞, 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体

Abstract: BACKGROUND: Zoledronic acid is a classical bisphosphate bone resorption inhibitor; however, its effect and mechanism on the mandibular alveolar bone metabolism are not clarified.
OBJECTIVE: To study the effects of zoledronic acid on the expression of bone resorption and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome in the mandibular alveolar bone of ovariectomized osteoporosis rats.
METHODS: Thirty-six female Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups (n=12 per group): sham group, osteoporosis group (bilateral ovariectomy), and zoledronic acid group (bilateral ovariectomy, followed by administration of zoledronic acid). Twelve weeks after ovariectomy, the rats in the zoledronic acid group were given subcutaneous injection of 20 μg/kg zoledronic acid, and the corresponding doses of saline were injected subcutaneously in the sham and osteoporosis groups. The rat’s mandibular alveolar bone was separated and removed at 4 weeks after administration. Alveolar bone mass band alveolar bone absorption were observed by Micro-CT, the pathological changes of the alveolar bone were observed using hematoxylin-eosin staining, the number of osteoclasts in alveolar bone was observed by tartrate resistant acid phosphatase staining, the expression of NLRP3 was determined by immunohistochemical technique, and the protein levels of NLRP3, Caspase-1, and interleukin-1β in the alveolar bone were detected using western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham group, the bone trabecular structure was broken in the osteoporosis group, with the emergence of a large number of bone resorption lacunae and uneven surface of the alveolar bone; meanwhile, percent bone volume, trabecular thickness, bone mineral density in alveolar bone were lower, trabecular separation were increased, and the number of osteoclast was significantly increased in the osteoporosis group (P < 0.05). Compared with the osteoporosis group, alveolar bone microstructure in the zoledronic acid group was improved, and the above pathological symptoms were alleviated obviously. Immunohistochemistry staining results showed that the expression level of NLRP3 protein was significantly higher in the osteoporosis group than the sham group (P < 0.05), and the expression of NLRP3 was significantly lower in the zoledronic acid group than the osteoporosis group (P < 0.05). Western blot results indicated that the expression levels of NLRP3, Caspase-1 and interleukin-1β proteins was higher in the osteoporosis group than the sham group, while the protein levels in the zoledronic acid were lower than those in the osteoporosis group (P < 0.05). To conclude, zoledronic acid can effectively inhibit the expression of NLRP3, Caspase-1 and inteleukin-1β in the alveolar bone of osteoporotic rats, and inhibit mandibular alveolar bone resorption by reducing the number of osteoclasts.

Key words: zoledronic acid, ovariectomized rat, alveolar bone, osteoporosis, bone metabolism, osteoclast, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome

中图分类号:

霍花, 刘官娟, 宋娜, 周倩, 程余婷, 罗珊珊, 廖健. 唑来膦酸干预去势大鼠牙槽骨骨代谢及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2660-2666.

Huo Hua, Liu Guanjuan, Song Na, Zhou Qian, Cheng Yuting, Luo Shanshan, Liao Jian. Effects of zoledronic acid on alveolar bone metabolism and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome in the alveolar bone of ovariectomized osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2660-2666.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量级分析实验选用36只大鼠，分为3组，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 动物大体情况最初各组大鼠体质量、体型相似，体质量在(255.67±7.73) g范围内，毛发自然光亮。卵巢摘除术后3个月，相较于假手术组的(320.33±11.08) g，去卵巢组体质量明显增加，为(391.00±18.09) g，差异有显著性意义(P < 0.05)；去卵巢组大鼠体型臃肿，毛发稀疏暗淡。
2.3 唑来膦酸对大鼠下颌牙槽骨骨吸收的影响右侧下颌第一磨牙根尖隔牙槽骨区域，假手术组下颌牙槽骨骨小梁致密，排列整齐；骨质疏松组卵巢摘除后骨量丢失，骨小梁变细窄，小梁骨间离散程度增加；唑来膦酸组给予20 μg/kg唑来膦酸治疗4周后，恢复了骨量，可见骨小梁数目增加，排列稍致密，离散程度减小。通过Micro-CT扫描分析感兴趣区域得出牙槽骨骨微结构参数，与假手术组比较，骨质疏松组大鼠牙槽骨骨体积分数、骨小梁厚度、骨密度降低，骨小梁分离度增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)，同时也说明骨质疏松模型造模成功；与骨质疏松组相比，20 μg/kg唑来膦酸组骨体积分数、骨小梁厚度、骨密度升高，骨小梁分离度降低(P < 0.05)，4周的短期治疗骨小梁数目与其他两组比较差异无显著性意义，见图1。

2.4 唑来膦酸对大鼠下颌牙槽骨组织病理变化的影响苏木精-伊红染色结果显示，假手术组牙槽骨组织结构完整，无明显病理变化；骨质疏松组牙槽骨小梁排列紊乱，出现骨小梁断裂，牙槽骨表面结构不完整，骨破坏明显，有大量的骨吸收陷窝；与骨质疏松组相比，唑来膦酸组骨小梁结构排列趋于整齐，成骨细胞增加，以上病理症状明显减轻，见图2。进一步验证了Micro-CT的结果，说明唑来膦酸治疗部分恢复了去卵巢大鼠牙槽骨丢失的骨量。

2.5 唑来膦酸对大鼠下颌牙槽骨破骨细胞的影响抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示，假手术组骨小梁表面未见到或少见破骨细胞形成；骨质疏松组牙槽骨组织中可见明显的多核、胞浆红染的破骨细胞，铺展于骨小梁表面；唑来膦酸组给予20 μg/kg唑来膦酸治疗后，仅有少数破骨细胞附着，该结果与课题组前期体外实验数据相一致，进一步说明唑来膦酸可以抑制牙槽骨内破骨细胞的数量来缓解炎症性骨吸收，见图3。

2.6 唑来膦酸对大鼠下颌牙槽骨NLRP3蛋白表达的影响免疫组织化学染色结果显示，NLRP3蛋白主要位于细胞浆上，假手术组低表达NLRP3蛋白(±)；骨质疏松组高表达NLRP3蛋白(++)；唑来膦酸组NLRP3蛋白表达下降(+)。统计学分析显示，骨质疏松组NLRP3蛋白表达水平明显高于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)；给予唑来膦酸治疗后，其蛋白表达量降低(P < 0.05)；而假手术组与唑来膦酸组相比无明显差异，表达量相对较少，见图4。

2.7 唑来膦酸对大鼠下颌牙槽骨NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，与假手术组比较，骨质疏松组NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β蛋白表达水平明显上调(P < 0.05)；与骨质疏松组比较，唑来膦酸组NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β蛋白表达水平下降(P < 0.05)；而假手术组与唑来膦酸组相比差异无显著性意义，见图5。

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引言

口腔种植义齿被许多缺牙患者所青睐，在诊疗中大多数中老年人，尤其是中老年妇女，常因骨量不足和骨质欠佳而降低种植义齿的成功率。一项研究显示国内中老年人群中男性与女性的骨质疏松患病率分别为6.46%和29.13%，且随年龄的增长而上升[1]，该病的主要特征为骨微结构破坏、骨骼性质发生改变，更易发生脆性骨折的全身性骨病[2]。而绝经后的骨质疏松症属于原发性骨质疏松症，在临床上最为常见，是近年医学研究的热点。临床及动物实验研究显示，绝经后的骨质疏松时也伴有牙槽骨骨质疏松，并且可能会影响牙种植的骨结合效果[3-5]，甚至导致种植失败，对患者的咀嚼、发音及面部协调美观等造成严重影响，降低生活质量。
唑来膦酸是治疗和预防骨质疏松最有效的双膦酸盐[6]。临床研究表明，唑来膦酸可改善骨质骨量，降低骨质疏松性骨折的风险并缓解绝经后骨质疏松症的疼痛[7-8]。此外，唑来膦酸治疗骨质疏松症患者的主要作用机制为抑制骨吸收、增加骨矿物质密度和降低抗酒石酸酸性磷酸酶5b、C-末端肽交联、骨钙素水平等[9-10]。而有研究表明长期大剂量的服用唑来膦酸会引起双膦酸盐相关性颌骨骨坏死[11-12]，但具体的病理生理机制尚存在争议，因此，临床应用中尚未确定唑来膦酸的具体用量及给药方式。为避免可能出现的并发症，课题组前期研究中发现单次应用低剂量唑来膦酸可以缓解去卵巢骨质疏松大鼠体内下颌骨骨量丢失，并纠正骨耦合失衡[13]；体外实验证实唑来膦酸在上调骨保护素同时下调核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)的表达，并抑制破骨细胞中核因子κB的活化，从而干扰破骨细胞的分化及功能，并且能调控成骨细胞的增殖[14-15]。然而，唑来膦酸对下颌牙槽骨吸收的影响及相关机制的研究仍在探索阶段。
研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)在骨代谢异常相关疾病中发挥着重要作用。敲除掉NLRP3后，与小鼠衰老相关的骨质减少程度有明显减轻[16]。NLRP3来自NOD样受体家族，与凋亡相关斑点样蛋白和半胱天冬氨酸蛋白酶1组成NLRP3炎症小体，在炎性骨病中发挥着重要作用[17]。体内炎症因子的增加是骨质疏松症发生的主要机制，绝经后雌激素水平下降，其主要炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等成为骨丢失主要的炎症递质[18-19]。而炎症小体的活化组装能够调控促炎症因子白细胞介素1β的产生，增加破骨细胞前体细胞中RANK表达，从而刺激核转录因子RANKL的分泌，使得白细胞介素1β与RANKL协同作用以促进破骨细胞的分化和骨吸收[20]。核因子κB是一种重要的核转录因子，可调节细胞凋亡、炎症反应和成骨细胞分化等，而NLRP3炎症小体的调节在转录水平主要受核因子κB的影响[21]，参与调控多种细胞及相关基因的表达，从而增强其骨吸收功能，并加重骨骼流失[22-24]。然而，关于唑来膦酸在下颌牙槽骨骨代谢中作用的研究报道较少，此次实验基于前期研究构建骨质疏松动物模型，在短期内观察低剂量唑来膦酸在牙槽骨骨质疏松中的作用，并初步探讨其在牙槽骨骨质疏松状态下对NLRP3炎症小体的影响，为唑来膦酸在口腔临床的应用提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析或非参数检验，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年7-11月在贵州医科大学动物中心进行饲养及标本取材，其余检测于2020年12月至2021年3月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组 36只SPF级雌性SD大鼠，12周龄，体质量250-300 g，由贵州医科大学动物中心提供，动物使用许可证号：SCXK(辽) 2020-0001。按随机数字表法分3组，分别为假手术组、骨质疏松组、唑来膦酸组，每组12只。实验经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号：2000887。
1.3.2 动物饲养条件动物在贵州医科大学实验动物中心清洁级动物房饲养，所有大鼠饲养条件及环境一致，每笼四五只，温度(20±2) ℃，湿度55%-60%，12 h光照，自由饮水和进食。常规饲养1周进行实验。
1.3.3 主要试剂及仪器唑来膦酸(瑞士，Novartis Pharma Stein AG)，苏木精-伊红染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、10%SDS-PAGE、抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(北京Solarbio公司)，兔源多克隆NLRP3抗体(批号：NBP2-12446)，兔单克隆半胱天冬氨酸蛋白酶1抗体(批号：ab179515)，兔源多克隆白细胞介素1β抗体(批号：ab9787)，羊抗兔二抗及免疫组化技术相关试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 动物模型的构建大鼠术前禁食6-8 h，全程无菌条件下，参考课题组前期实验及文献制备大鼠骨质疏松模型[13，25]，骨质疏松组和唑来膦酸组摘除双侧卵巢，假手术组去除卵巢周围等质量的脂肪组织。采用3%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射进行麻醉，于俯卧位固定，背部中段1/3(距离背部肋骨下 1 cm，脊柱2 cm)处备毛，范围约4 cm×3 cm，常规消毒，分别在背部左右两侧作1.5 cm切口，逐层剥离并剪开腰部后外方肌肉，找到白色脂肪团包裹呈淡红色的卵巢及与其相连的子宫角，4号丝线将卵巢与子宫连接处结扎，逐层严密缝合肌肉皮肤，内层撒青霉素粉，外层碘伏消毒创口预防感染，术后6 h给予饮食。术后3个月，唑来膦酸组皮下一次性注射唑来膦酸20 μg/kg，假手术组和骨质疏松组皮下注射相同剂量的生理盐水。

1.4.2 标本采集给药后4周采用3%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉动物直接取出下颌骨组织，仔细分离出软组织，40 g/L多聚甲醛固定行Micro-CT检测后，EDTA脱钙液脱钙，时间一两个月，直到针尖能插入组织内为止，常规石蜡切片，剩余组织置于-80 ℃冰箱保存备用，用于Western blot检测。
1.4.3 Micro-CT检测取出固定于40 g/L多聚甲醛溶液中的标本，应用微型CT对标本进行三维扫描，调整参数为：电压90 kV，电流60 μA，分辨率17 μm，扫描层厚25 um，相机像素大小为75 μm，单个样本扫描时间为24 000 s，得到二维图片420张，以右侧下颌第一磨牙根尖隔区域设置为感兴趣区，应用Micro-CT相应软件对各个样本的感兴趣区进行骨微结构三维分析，包括骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁分离度、骨小梁厚度及骨密度。
1.4.4 苏木精-伊红染色石蜡切片常规脱蜡水化，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯各2 min，苏木精染核10 min，10 mL/L盐酸乙醇返蓝3 min，水洗，10 mL/L伊红水溶液复染1 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察下颌牙槽骨结构改变。
1.4.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色及破骨细胞计数石蜡切片常规脱蜡水化，无水乙醇 5 min，体积分数90%乙醇、70%乙醇各2 min，水洗2 min，晾干后抗酒石酸酸性磷酸酶固定液固定45 s，然后置于37 ℃温箱，抗酒石酸酸性磷酸酶孵育液浸染 45 min，水洗，苏木精复染8 min，乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察并破骨细胞计数，鉴定标准：细胞核蓝色，细胞质红色，显微镜下随机选取5个视野确定牙槽骨组织中阳性破骨细胞数目(n≥3)，重复3次。
1.4.6 免疫组织化学染色及结果判断石蜡切片常规脱蜡水化，梯度乙醇脱水，抗原修复(应用0.25%胰酶暴露抗原)，体积分数3%的H2O2封闭切片中内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，滴加一抗(NLRP3抗体1∶50稀释)，4 ℃孵育过夜，37 ℃复温30 min，DAB显色，苏木精染色、水洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察NLRP3蛋白表达情况。结果评估：根据阳性细胞的着色深浅强度积分及百分比积分相加的方法进行评估[26-27]。着色深浅强度：无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞百分比分为5等级：≤5%为0分，≤25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，≥75%为4分；两种相加：0分为阴性(-)，2-3分为阴性(±)，4-5分为阳性(+)，6-7分为阳性(++)。应用Image proplus 6.0图像分析软件测定NLRP3蛋白的平均吸光度值，取其平均值，分析蛋白表达强度。
1.4.7 Western blot检测称取下颌牙槽骨组织50-100 mg，液氮环境中研磨后放入1.5 mL EP管中，每管加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液200 μL，冰上裂解 45 min，4 ℃ 12 000 r/min离心25 min，收集上清，提取骨组织总蛋白。用BCA法测定总蛋白浓度。100 ℃，5-10 min高温煮沸变性，10%的SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗(NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β、β-actin) 4 ℃孵育过夜，羊抗兔二抗室温孵育2 h，ECL显影，Image J分析软件对条带灰度值分析。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠大体情况；②Micro-CT对牙槽骨骨质骨量差异的评估；③苏木精-伊红染色观察牙槽骨病理结构改变；④抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察牙槽骨破骨细胞数量；⑤免疫组织化学检测牙槽骨组织中NLRP3的蛋白表达情况；⑥Western blot检测牙槽骨组织中NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β蛋白的表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0软件对各项数据进行统计分析，应用GraphPad Prism 7.0绘制统计图，计量数据以x±s表示。各组数据间采用t检验分析，多组间的比较采用方差分析(one-Way ANOVA)或Kruskal-Wallis检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

与年龄相关的骨质疏松症因骨量减少、骨微结构改变而伴发的骨折、骨缺损是近年来关注的焦点[28]。由于骨质疏松患者牙槽骨骨质欠佳、骨量不足导致的种植失败率约为10.9%，故被认为是牙种植的相对禁忌证[29-30]。已有动物实验表明，颌骨骨量丢失、出现骨质疏松样的改变是全身骨质变化的局部表现[31]。而绝经后的骨质疏松是原发性骨质疏松最常见的形式，体内雌激素缺乏引起骨代谢紊乱最终导致骨吸收大于骨形成。因而，此次实验通过切除成年雌鼠双侧卵巢的方式建立骨质疏松模型，作为牙槽骨骨质疏松模型进行研究，这种低骨量的状态与人类雌激素缺乏导致的骨质疏松变化极其相似，是目前广泛采用的一种方式[32]。结合课题组前期研究，此次实验中，去卵巢后大鼠体质量变化超过正常10%，以及Micro-CT检测牙槽骨骨密度的改变(骨质疏松组较假手术组骨密度显著下降)与既往研究一致，证明骨质疏松模型构建成功。
目前唑来膦酸治疗骨质疏松症的疗效肯定[33]，该药物的作用机制在体内通过特殊的分子结构2个氮原子与骨骼中的羟基磷灰石螯合来抑制破骨细胞的骨吸收功能。有研究表明，唑来膦酸可能通过调控成骨细胞来发挥抗吸收功能[34]。低剂量的唑来膦酸能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，增加成骨相关因子Ⅰ型胶原酶、Runt相关转录因子2、骨钙蛋白及碱性磷酸酶的表达[35]，尤其在低浓度条件下具有促进成骨细胞发育和生成的作用[36]。动物实验也表明，唑来膦酸能够促进大鼠成骨细胞增殖以及分泌促生长因子类胰岛素增长因子，从而促进骨合成代谢[37]。尽管唑来膦酸被学者们广泛关注[38]，但长期大剂量的静脉注射和口服会引起双膦酸盐相关性颌骨坏死，尤其出现在下颌骨[39]。因此有学者证实，采用单次注射唑来膦酸抗骨质疏松症的效果相当于其他双膦酸盐类药物持续应用1年的疗效[40]。短期或小剂量注射唑来膦酸对去卵巢骨质疏松大鼠钛种植体骨结合具有促进作用，明显增加种植体周围骨密度、骨接触面积[41]。而最近研究表明，采用皮下注射唑来膦酸可以促进骨质疏松大鼠胫骨骨折的愈合，增加新骨形成[42]。同样唑来膦酸可以作用于不同的骨骼部位如脊柱、髋部、椎体、非椎体骨折部位等，增加其骨密度并维持骨量[43]。由于下颌骨复杂的解剖结构，唑来膦酸对下颌骨骨微结构的改善具有挑战性。此次实验在短期内观察低剂量唑来膦酸对下颌牙槽骨骨代谢及破骨细胞的作用与影响，并探讨其可能的作用途径，结果说明，在下颌骨组织病理结构观察中，给药后的大鼠牙槽骨骨小梁结构致密，小梁骨间距减小，纤维结构排列趋于整齐，与前期的研究数据相一致。同时，因雌激素缺乏，下颌第一磨牙根尖隔是牙槽骨骨质疏松症最敏感的区域，研究者通常将其作为感兴趣区[44]；此次实验结果显示，相较骨质疏松组，唑来膦酸组牙槽骨骨体积分数、骨小梁厚度、骨密度增加，骨小梁间距降低，提示唑来膦酸可以改善牙槽骨的病理状况，抑制牙槽骨吸收，促进牙槽骨再生。
破骨细胞是机体唯一具有骨吸收功能的细胞，体内促炎细胞因子对破骨细胞的分化与成熟具有促进作用，促炎因子对骨稳态有明显的影响，雌激素水平下降可导致机体内促炎因子水平升高，刺激骨微环境中RANKL水平升高，增强破骨细胞骨吸收功能，而骨保护素水平下降，RANKL/骨保护素轴平衡失调，导致骨丢失。既往体内外研究发现，唑来膦酸可以抑制RANKL介导核因子κB的激活[15，45]，核因子κB在体内分布广泛，可调控炎症相关基因的表达[46]，而NLRP3炎症小体活化可依赖于核因子κB的激活，有学者发现NLRP3炎症小体被多种宿主损伤相关分子模式激活，活化的核因子κB能诱导NLRP3和白细胞介素1β前体的转录。与各种骨代谢性疾病相关，ZANG等[47]认为NLRP3炎症小体在炎症性骨病条件下对骨吸收起关键作用，NLRP3的缺失会降低与衰老相关的骨质减少程度。从此次实验结果显示，唑来膦酸给药后，抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察到牙槽骨破骨细胞数目减少，抑制了破骨细胞形成，有效减少了骨吸收。免疫组织化学染色中可见细胞浆上NLRP3蛋白表达有所降低，可能抑制了炎性小体的活化组装，使得骨吸收减弱。同时对NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素1β用Western blot法进一步分析证实，骨质疏松组三者表达量均明显上升，给药之后，三者表达量均下降。其中白细胞介素1β是极具有促炎活性的炎症因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，研究报道，白细胞介素1β在各种骨吸收疾病中有重要作用，包括骨质疏松症、类风湿关节炎等系统性代谢疾病以及牙周黏膜疾病、正畸治疗过程中都会增加白细胞介素1β的产生，诱发RANKL蛋白表达增加，破骨细胞吸收活性增强，加重骨骼流失[48]。此次实验虽然从一定程度上验证了唑来膦酸抑制NLRP3炎症小体相关蛋白的表达，但是否通过核因子κB信号通路调控，还需阻断实验、具体的作用靶点以及下游分子更进一步验证；从而探索出唑来膦酸能否通过抑制核因子κB活化，调控NLRP3转录，从而干扰破骨细胞的分化与成熟，抑制下颌牙槽骨骨吸收；同时还需要延长给药时间以及对药物作用效果的时效等进行深入研讨。
综上所述，短期内应用唑来膦酸可以明显改善去卵巢骨质疏松大鼠下颌牙槽骨的骨微结构，增加牙槽骨骨密度，减少骨量丢失，对下颌牙槽骨骨吸收有一定抑制作用，同时唑来膦酸可能下调牙槽骨组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平。此次研究对临床上合理使用唑来膦酸有了进一步思考，通过探讨唑来膦酸对NLRP3炎症小体的影响，为后续研究该药的具体作用机制有了进一步认识，并为该药在口腔种植领域的应用奠定了理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

唑来膦酸干预去势大鼠牙槽骨骨代谢及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体表达的变化

Effects of zoledronic acid on alveolar bone metabolism and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome in the alveolar bone of ovariectomized osteoporosis rats

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