一次性力竭运动模型促进大鼠肾脏NOD样受体蛋白3炎性小体的表达

doi:10.12307/2022.032

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (2): 190-196.doi: 10.12307/2022.032

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一次性力竭运动模型促进大鼠肾脏NOD样受体蛋白3炎性小体的表达

耿元文1，林琴琴1，李若明1，唐韶慨1，王柏慧1，田振军2

1燕山大学体育学院，河北省秦皇岛市 066004；2陕西师范大学体育学院，陕西省西安市 710062

收稿日期:2021-01-18 修回日期:2021-01-20 接受日期:2021-03-16 出版日期:2022-01-18 发布日期:2021-10-27
通讯作者: 林琴琴，博士，副教授，燕山大学体育学院，河北省秦皇岛市 066004
作者简介:耿元文，男，山东省诸城市人，硕士，讲师，主要从事运动与心血管方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31300978)，项目负责人：林琴琴；河北省自然科学基金(C2019203537)，项目负责人：林琴琴；河北省高等学校科学技术研究项目(QN2019068)，项目负责人：林琴琴

A single bout of exhaustive exercise induces renal NOD-like receptor protein 3 inflammasome expression in rats

Geng Yuanwen1, Lin Qinqin1, Li Ruoming1, Tang Shaokai1, Wang Baihui1, Tian Zhenjun2

1School of Physical Education, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, Hebei Province, China; 2School of Physical Education, Shaanxi Normal University, Xi′an 710062, Shaanxi Province, China

Received:2021-01-18 Revised:2021-01-20 Accepted:2021-03-16 Online:2022-01-18 Published:2021-10-27
Contact: Lin Qinqin, PhD, Associate professor, School of Physical Education, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, Hebei Province, China
About author:Geng Yuanwen, Master, Lecturer, School of Physical Education, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, Hebei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31300978 (to LQQ); the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. C2019203537 (to LQQ); Scientific and Technological Project of Colleges and Universities in Hebei Province, No. QN2019068 (to LQQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
NOD样受体蛋白3炎性小体：是一种细胞内多蛋白复合物，为炎症反应的关键递质，可作为激活半胱氨酸蛋白酶(Caspase-1)的分子平台，是由识别蛋白NOD样受体、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白1和效应蛋白Caspase-1等多种蛋白聚合形成的复合体，NOD样受体接触并识别某些危险刺激后自身聚集活化和信号传导，诱发效应蛋白Caspase-1活化，继而引起促炎因子白细胞介素1β和白细胞介素18的成熟和释放。
力竭运动：是生物体在超出其生理极限下进行的剧烈身体活动，会引起机体各组织产生一系列的变化。
背景：力竭运动导致机体多次血氧重新分配，诱发强烈炎症反应，增强全身炎症水平，损伤肾脏功能。
目的：基于miR-155/SIRT1/TXNIP通路途径下，探讨一次性力竭运动造成大鼠肾脏炎症损伤的作用及机制。
方法：将20只3月龄雄性SD大鼠随机分为对照组和力竭运动组，每组10只，力竭运动组采用三级递增运动负荷跑台训练建立一次性力竭运动实验动物模型，对照组不建模。训练结束后即刻取材，检测血清尿素氮、肌酐、肌酸激酶、丙二醛、胱抑素C和尿液肾损伤分子1水平，检测肾脏硫氧还蛋白结合蛋白水平，采用Western Blot法检测肾脏组蛋白去乙酰化酶SIRT1、NOD样受体蛋白3、凋亡相关斑点样蛋白1、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达，采用RT-qPCR法检测血清和肾脏miR-155及肾脏SIRT1 mRNA表达，同时进行肾脏细胞形态学观察。
结果与结论：①与对照组比较，力竭运动组大鼠血清和肾脏miR-155 mRNA表达均增多(P < 0.01，P < 0.05)；②与对照组比较，力竭运动组大鼠肾脏SIRT1 mRNA和蛋白表达下降(P < 0.01)，肾脏硫氧还蛋白结合蛋白水平升高(P < 0.01)；③与对照组比较，力竭运动组大鼠肾脏NOD样受体蛋白3、凋亡相关斑点样蛋白1、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达均增加(P < 0.05或P < 0.01)，血清尿素氮、肌酐、肌酸激酶、丙二醛、胱抑素C和尿液肾损伤分子1均升高(P < 0.05或P < 0.01)，肾组织病理损伤严重；④肾脏SIRT1蛋白表达与硫氧还蛋白结合蛋白、NOD样受体蛋白3蛋白表达呈负相关(r=-0.962，P < 0.01；r=-0.977，P < 0.01)；肾脏miR-155表达与SIRT1蛋白表达呈负相关(r=-0.989，P < 0.01)，与硫氧还蛋白结合蛋白和NOD样受体蛋白3蛋白表达呈正相关(r=0.902，P < 0.01；r=0.968，P < 0.05)；⑤提示一次性力竭运动可上调miR-155表达、抑制SIRT1表达、增加硫氧还蛋白结合蛋白表达、激活NOD样受体蛋白3炎性小体，引发炎症反应，加重肾组织的病理损伤，损伤肾功能，这可能是力竭运动后肾脏损伤的机制之一。

https://orcid.org/0000-0003-1552-2322 (耿元文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 一次性力竭运动, 肾脏, 炎症损伤, miR-155, SIRT1, NLRP3炎性小体, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Exhaustive exercise leads to multiple redistribution of blood oxygen in the body, induces a strong inflammatory response, enhances the level of systemic inflammation, and damages kidney function.
OBJECTIVE: To determine the effects of a single bout of exhaustive exercise on the expressions of renal NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome in rats and possible mechanism.
METHODS: Twenty male Sprague-Dawley rats aged 3 months were randomly divided into a control group and an exhaustive exercise group, with 10 rats in each group. In the exhaustive exercise, three-level incremental exercise load treadmill training was performed to establish a one-time exhaustive exercise experimental animal model. No modeling was performed in the control group. Immediately after training, blood sample was collected from each rat, and then the kidney tissue was removed for hematoxylin-eosin staining to observe the morphological changes of renal cells. Renal thioredoxin-interacting protein (TXNIP), serum blood urea nitrogen, creatinine, creatine kinase, malondialdehyde, cystatin C and urine kidney injury molecule-1 levels were detected. Western blot was used to detect renal SIRT1, NLRP3, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) 1, Caspase-1 and interleukin-1β protein expression. RT-qPCR was performed to detect serum and renal miR-155 and renal SIRT1 mRNA expression. Meanwhile, renal cell morphology was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the levels of serum and renal miR-155 were significantly increased in the exhaustive exercise group (P < 0.01, P < 0.05). Compared with the control group, the protein and mRNA expression of renal SIRT1 was significantly decreased (both P < 0.01), while the protein expression of renal TXNIP, NLRP3, ASC-1, Caspase-1 and interleukin-1β was significantly increased in the exhaustive exercise group (P < 0.05 or 0.01). Moreover, the levels of serum blood urea nitrogen, creatinine, creatine kinase, malondialdehyde, cystatin C and urine kidney injury molecule-1 were significantly increased in the exhaustive exercise group compared with the control group (P < 0.05 or 0.01), and renal pathologic changes were aggravated. The expression of SIRT1 was negatively related to the protein expression of TXNIP and NLRP3 (r=-0.962, P < 0.01; r=-0.977, P < 0.01). The expression of miR-155 was negatively related to the protein expression of SIRT1 (r=-0.989, P < 0.01), and positively related to the protein expression of TXNIP and NLRP3 (r=0.902, P < 0.01; r=0.968, P < 0.05). Therefore, a single bout of exhaustive exercise increases the levels of serum and renal miR-155, reduces the expression of renal SIRT1 protein and mRNA, increases the expression of renal TXNIP, activates NLRP3 inflammasome, triggers inflammatory response and then aggravates the renal pathological damages, thereby impairing renal function. This may be one of the mechanisms of kidney injury induced by a single bout of exhaustive exercise.

Key words: a single bout of exhaustive exercise, kidney, inflammatory injury, miR-155, SIRT1, NLRP3 inflammasome, rat

中图分类号:

耿元文, 林琴琴, 李若明, 唐韶慨, 王柏慧, 田振军. 一次性力竭运动模型促进大鼠肾脏NOD样受体蛋白3炎性小体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 190-196.

Geng Yuanwen, Lin Qinqin, Li Ruoming, Tang Shaokai, Wang Baihui, Tian Zhenjun. A single bout of exhaustive exercise induces renal NOD-like receptor protein 3 inflammasome expression in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(2): 190-196.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 20只大鼠在实验过程中无脱失，全部进入结果分析。
2.2 力竭运动对大鼠肾脏和血清miR-155表达的影响与对照组比较，力竭运动组大鼠血清miR-155 mRNA表达量显著增加(P < 0.01)，肾脏miR-155 mRNA表达量增多(P < 0.05)，见图1。

2.3 力竭运动对大鼠肾脏SIRT1表达的影响与对照组比较，力竭运动组大鼠肾脏SIRT1 mRNA和蛋白表达均显著减少 (P < 0.01)，见图2。

2.4 力竭运动对大鼠肾脏TXNIP表达的影响与对照组比较，力竭运动组大鼠肾脏TXNIP 蛋白表达显著性增多(P < 0.01)，见图3。

2.5 力竭运动对大鼠肾脏NLRP3炎性小体表达的影响与对照组比较，力竭运动组大鼠肾脏NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白1、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达均明显增多 (P < 0.01，P < 0.01， P < 0.05，P < 0.01)，见图4。

2.6 力竭运动对大鼠肾功能的影响与对照组比较，力竭运动组大鼠血清尿素氮、肌酐、肌酸激酶、丙二醛和胱抑素C水平明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，尿液肾损伤分子1水平显著增加(P < 0.01)，见表1。

2.7 力竭运动后大鼠肾脏形态学变化通过形态学观察发现，对照组大鼠肾脏组织着色均匀，结构清晰致密，核大小均匀，无淤血、变性和水肿，肾小管管腔内无管型；力竭运动组大鼠肾小球有淤血现象，肾小球囊腔变大，肾小球萎缩变小，血管球数目减少，肾小囊囊壁增厚，肾小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张，管腔中有少量的脱落绒毛和上皮细胞及各种管型，管腔扩张，间质增宽，见图5。

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引言

诸多研究证实，力竭运动导致机体多次血氧重新分配，造成肾脏缺血缺氧，诱发强烈炎症反应，引起肾脏损伤[1-3]，但确切机制和靶点尚不清楚。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体是近年来新发现的炎症标记物，与炎症反应进程密切相关[4]，是肾脏损伤的重要介质[5]。NLRP3炎性小体是由识别蛋白NOD样受体、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白1和效应蛋白Caspase-1等多种蛋白聚合形成的复合体，NOD样受体接触并识别某些危险刺激后自身聚集活化和信号传导，诱发效应蛋白Caspase-1活化，继而引起促炎因子白细胞介素1β和白细胞介素18的成熟和释放[6]。研究发现，激活肾脏NLRP3表达可促进炎症因子白细胞介素1β和白细胞介素18表达增多，诱发炎症级联反应，加速炎症细胞浸润，加快肾脏损伤[7]，表明NLRP3炎性小体在肾脏炎症反应中起着关键性作用。国内外研究证实，急性力竭运动可激活NLRP3炎性小体，触发大鼠心肌炎症反应，刺激下游炎性因子增多，损伤心功能[8-10]。但一次性力竭运动是否激活NLRP3炎性小性参与肾脏炎症反应及其机制研究，文献报道尚少。
大量研究证实，microRNAs(miRNAs)可能是炎症性疾病的预后指标和/或潜在治疗靶标。miR-155是炎症的主要调节者[11]，可显著促进炎症因子产生并激活信号通路，加剧炎症反应引起的病理组织损伤[12]。研究发现，缺血再灌注导致大鼠肾脏组织和人肾皮质近曲小管上皮细胞中miR-155表达显著增加，而miR-155外源性表达上调Caspase-1及白细胞介素1β和白细胞介素18的表达[13]。动物和细胞实验证实，间歇性缺氧可显著增加肾脏组织和细胞中的miR-155表达，抑制miR-155表达可显著抑制缺氧诱导的肾小管细胞NLRP3炎性小体的激活，而过表达miR-155增强NLRP3炎性小体的表达[14]。但针对一次性力竭运动是否通过上调肾脏miR-155表达激活NLRP3炎性小体表达，损伤肾脏功能，缺少文献报道。
研究证实，组蛋白去乙酰化酶SIRT1是肾脏疾病治疗的新靶点[15]。体内外实验发现，SIRT1可通过抑制炎症经典通路核因子κB信号通路，减少脂多糖诱导的肾脏集合管细胞炎症因子的表达和减轻单侧输尿管梗阻小鼠肾脏间质的炎症反应[16-17]。SIRT1过表达可显著抑制人脐静脉内皮细胞中NLRP3炎症小体的激活和白细胞介素1β分泌，而SIRT1基因沉默可显著增强NLRP3炎症小体的激活[18]。另有研究证实，硫氧还蛋白结合蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)可与NLRP3直接结合介导NLRP3的活化，而SIRT1激活可抑制TXNIP蛋白表达，调节NLRP3的表达[19]。最新研究证实，miR-155可直接靶向抑制靶基因SIRT1表达促进炎症反应，加速高糖诱导的肾近端小管细胞损伤[20]。但一次性力竭运动是否通过miR-155激活SIRT1-TXNIP通路，增加NLRP3炎性小体表达，诱发肾脏炎症反应，目前尚不清楚。因此，实验通过建立大鼠一次性力竭运动模型，探究力竭运动是否通过miR-155-SIRT1-TXNIP通路途径促进大鼠肾脏组织炎症损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用独立样本t 检验。
1.2 时间及地点实验于2017年7月至2018年7月在陕西师范大学体育学院暨运动生物学研究所运动与心血管健康研究室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 3月龄雄性SD大鼠20只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号：陕医动证字SCXK2012-098，标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食。
1.3.2 主要试剂 SIRT1、凋亡相关斑点样蛋白1、Caspase-1和白细胞介素1β抗体购于美国Santa Cruz公司；大鼠TXNIP、肾损伤分子1和胱抑素C的ELISA试剂盒购于美国R&D公司；血清尿素氮、肌酐、肌酸激酶和丙二醛的试剂盒购于南京建成生物工程研究所；NLRP3 抗体购于美国Bioworld公司；GAPDH和二抗购于北京天德悦生物科技有限责任公司；PCR引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司；反转录试剂盒和SYBR Green荧光染料购于宝日医生物技术(北京)有限公司。
1.4 方法

1.4.1 动物分组与运动方案适应性喂养１周后，将20只大鼠随机分为对照组与力竭运动组，每组10只。力竭运动组大鼠进行适应性跑台训练，跑台坡度为0°，速度10 m/min，持续时间10 min ，共训练3 d。正式实验采用BEDFORD根据大鼠体质量/摄氧量回归方程所建立的递增运动负荷训练大鼠模型[18]。跑台坡度为0°，按以下运动程序运动至力竭：第一级负荷，8.2 m/min，15 min；第二级负荷，15 m/min， 15 min；第三级负荷，20 m/min运动至力竭。判断力竭标准：到运动末期，大鼠先后滞留跑道后1/3处达到3 次及以上，各种刺激驱赶均无效；停止跑步后体征表现为呼吸急促，神情倦怠，俯卧位，对刺激反应迟钝，捕捉时，逃避反应较运动前大幅减弱[1，21]。对照组不建模。

运动结束后即刻，腹腔注射5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉两组大鼠，膀胱取尿、腹主动脉取血后，迅速选取一侧肾脏，置于体积分数10%中性甲醛溶液中固定，用于苏木精-伊红染色。另取肾脏，液氮骤冷，转移至-80 ℃超低温冰箱保存备用。
1.4.2 ELISA法检测采用ELISA法检测肾脏中TXNIP、血清胱抑素C及尿液肾损伤分子1的含量。称取50 mg肾脏组织，加入裂解液后匀浆，4 ℃下5 000×g离心5 min，留取上清，置于-20 ℃保存；血液及尿液样本离心后留取上清液，置于-20 ℃保存。在已包被抗体的96孔板中分别加入40 μL肾脏上清样本及TXNIP抗体10 μL，或40 μL血清样本和胱抑素C抗体10 μL，或40 μL尿液上清样本及肾脏损伤分子1抗体10 μL，后加入HRP标记亲和素50 μL，37 ℃孵育60 min，洗涤液清洗3次，滤纸吸干，加入底物显色，37 ℃避光孵育10 min，终止液终止反应，酶标仪在450 nm处测吸光度值。
1.4.3 石蜡切片的制作过程样本采集时取出肾脏组织，放入固定液，再经脱水、透明、透蜡后进行石蜡包埋。制备 5 μm厚度切片，石蜡切片依次通过脱蜡、水化、苏木精染色、分化、反蓝、伊红染色、脱水、透明、封固的过程，制成苏木精-伊红染色切片。将切片放大400 倍，进行显微镜形态学观察，并随机选取视野进行组间对比观察。
1.4.4 大鼠肾功能指标检测将5 mL全血置于非抗凝负压采血管中，室温静置30 min待其自然凝固，4 ℃3 000 r/min离心10 min，留取上层血清，置于-20 ℃冰箱保存。采用二乙酰肟比色法测定血清尿素氮浓度，除蛋白化学法检测血清肌酐，比色法测定肌酸激酶活性，硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛浓度。
1.4.5 Western Blot检测采用Western Blot检测肾脏SIRT1、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白1、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白的表达。取肾脏组织进行匀浆，RIPA试剂提取总蛋白质，BCA试剂盒蛋白定量。等量蛋白质上样、电泳、转膜后，3%BSA室温封闭，30 min后加入一抗，分别为：SIRT1(1∶400)、NLRP3(1∶200)、凋亡相关斑点样蛋白1(1∶ 200)、Caspase-1(1∶200)和白细胞介素1β(1∶200)，4 ℃过夜，复温30 min后洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗抗体(1∶10 000)孵育30 min，室温下洗膜3次后用化学发光底物ECL(Millipore) 进行发光显迹。内参为GAPDH 蛋白，计算目的蛋白与内参蛋白条带的积分吸光度。
1.4.6 RT-qPCR检测采用RT-qPCR检测肾脏SIRT1 mRNA的表达以及血清和肾脏miR-155的表达。利用TRIzol提取肾脏总RNA，取3 μg总RNA经反转录试剂盒进行cDNA合成。利用PCR试剂盒及其说明书进行Real-time PCR系统检测。每个样本设3组独立重复实验。引物序列：SIRT1上游引物：5’-CAG TTC CAG CCA TCT CTG TG-3’，下游引物：5’-GCA ACC TGC TCC AAG GTA TC-3’；GAPDH 上游引物：5’-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3’，下游引物：5’-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3’。利用比较Ct法(2-∆∆Ct)计算相对基因表达量。
利用TRIzol试剂提取血清和肾脏总RNA，按microRNA反转录试剂盒说明方法反转录合cDNA，再以此cDNA为模板按PCR试剂盒进行PCR反应。引物和探针由宝生物工程有限公司(TaKaRa)设计和合成，U6为内参。反应条件如下： 95 ℃ 30 s，1 个循环；95 ℃5 s，60 ℃20 s，39 个循环。每个样品重复检测3次。利用2-∆∆Ct法计算miR-155的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①两组大鼠肾组织的形态结构及生化指标；②两组大鼠血清尿素氮、肌酐、肌酸激酶、丙二醛、胱抑素C和尿液肾损伤分子1及肾脏TXNIP水平；③两组大鼠肾脏SIRT1、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白1、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达；④两组大鼠血清和肾脏miR-155及肾脏SIRT1 mRNA表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0 for Windows统计软件对所获得的实验数据进行统计分析，所有数据以x±s表示。组间比较采用独立样本t 检验。采用双变量的Pearson线性相关性分析功能进行两种指标间的相关性分析。显著性差异选择P < 0.05和P < 0.01水平。

讨论

3.1 一次性力竭运动激活肾脏NLRP3炎性小体表达增强炎症反应，损伤肾脏功能诸多研究证实，力竭运动诱发急性肾损伤。力竭运动可显著增加大鼠血清尿素氮、肌酐、肌酸激酶和尿蛋白，诱导炎症因子表达增加，导致肾小管上皮细胞严重受损，细胞凋亡增多。此次实验结果显示，力竭运动后大鼠血清血清尿素氮、肌酐、肌酸激酶、丙二醛水平显著升高，与上述研究结果相一致。血尿素氮和肌酐是临床肾功能评价的常用指标，但因血清肌酐浓度受各种非肾脏因素影响，仅以血尿素氮和肌酐作为诊断指标很难实现急性肾损伤早期诊断目标。肾损伤分子1和胱抑素C是近年来新发现的反映肾损伤的新型标志物。尿液肾损伤分子1水平对于肾损伤的诊断比传统标志物(血尿素氮、肌酐)具有更好的敏感性和特异性，且是病理改变轻微时唯一能够发现肾小管损伤的指标。胱抑素C是一种低分子质量蛋白质，因其不受许多肾外因素的干扰，可作为评价肾小球滤过功能指标。研究发现，叶酸或顺铂诱导肾毒性大鼠肾组织及尿中肾损伤分子1表达上调均先于肌酐的上升，而在急性肾损伤期间胱抑素C的浓度峰值早于肌酐，且比肌酐更早检测到肾功能障碍[22-23]。此次实验结果显示，与对照组比较，一次性力竭运动组大鼠尿液肾损伤分子1和血清胱抑素C水平显著升高，肾脏组织病理损伤严重，说明一次性力竭运动诱发大鼠肾小球滤过功能下降，肾小管损伤，导致肾脏功能受损。但一次性力竭运动对大鼠肾脏损伤的机制研究，尚少见文献报道。研究表明，NLRP3炎性小体的激活是触发急性肾损伤的递质[5]。肾脏损伤后，肾脏NLRP3表达增加，促进Caspase-1、白细胞介素1β和白细胞介素18表达增多，诱发肾脏炎症级联反应，加速肾脏损伤，加快肾功能恶化[24]。此次实验结果显示，与对照组比较，一次性力竭运动组大鼠肾脏NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白1、Caspase-1和白细胞介素1β蛋白表达均显著升高，提示一次性力竭运动可激活NLRP3炎性小体，引起促炎性细胞因子白细胞介素1β成熟和释放，触发肾脏炎症反应，诱发肾脏损伤。
3.2 一次性力竭运动可激活大鼠肾脏miR-155/SIRT1/TXNIP通路损伤肾脏功能大量研究证实，循环miRNAs水平不仅在病理过程中改变，还受运动训练的影响，可作为运动能力的潜在生物标志物[25-27]。急性力竭运动可显著上调健康男性miR-146a和miR-21的血浆水平 [28]，上调慢性心力衰竭患者血清miR-21、miR-378和miR-940水平[29]。超马拉松运动可显著增加业余选手血液循环中miR-155的水平，诱导促炎性细胞因子表达增多[30]。此次实验结果显示，与对照组相比，一次性力竭运动大鼠血清miR-155水平显著升高。miR-155是与炎症相关miRNAs中最重要的一种，发挥促炎性因子作用[11]，由此推测，力竭运动促进循环炎症相关miRNAs的上调表达，诱发全身炎症反应，导致器官损伤，减弱器官功能。研究证实，肾脏是高强度运动或超负荷训练的易损伤器官之一[31]，而诸多炎症性肾脏疾病，如急性肾损伤[32]、高血糖诱发肾病[33]、慢性肾病和糖尿病肾病中miR-155表达显著增加[34-35]。体内外实验研究证实，缺血再灌注导致大鼠肾脏组织和人肾皮质近曲小管上皮细胞中miR-155表达显著增加，过表达miR-155显著增强缺氧诱导的肾小管细胞中NLRP3炎性小体表达[14]。此次实验结果显示，一次性力竭运动大鼠肾脏miR-155表达显著增多，NLRP3炎性小体表达增多，且miR-155表达与NLRP3蛋白表达呈显著正相关。结果表明，一次性力竭运动可能通过上调肾脏miR-155的水平，促进NLRP3炎性小体表达，扩大炎症反应，加重肾脏损伤。
SIRT1是第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，其和同源基因作用调节氧化应激、炎症和细胞衰老等多种生理活动。新近研究发现，4周大强度力竭运动可显著减少大鼠肾脏SIRT1表达，增加肾脏炎症反应，导致运动性肾损伤[36]。此次实验结果显示，一次性力竭运动显著降低大鼠肾脏SIRT1 mRNA和蛋白表达，说明SIRT1的表达降低导致力竭运动炎症反应增加，加重疾病进程。SIRT1是肾脏疾病治疗的新靶点[15]，其通过抑制炎症信号通路减少炎症因子表达，抑制肾脏炎症反应，保护肾脏功能[37]。SIRT1激活可显著减少镉诱导的人肾小管上皮细胞NLRP3炎性小体的表达[38]。另研究证实，SIRT1激活可显著减少高尿酸血症大鼠或2型糖尿病小鼠肾脏中NLRP3炎性小体的表达[39-40]，说明SIRT1可通过抑制NLRP3炎性小体激活而发挥抗炎特性；反之，抑制SIRT1表达，增加NLRP3炎性小体表达，诱发炎症反应。此次实验结果显示，一次性力竭运动显著减少大鼠肾脏SIRT1表达，增多NLRP3炎性小体表达，且SIRT1蛋白表达与NLRP3蛋白表达呈显著负相关。提示一次性力竭运动抑制SIRT1表达，激活炎症反应，损伤肾功能。
TXNIP为一种硫氧还蛋白抗氧化剂内源性抑制剂，可激活炎症反应，参与急性肾损伤[24]、慢性肾病[41]、糖尿病肾病和高尿酸血症性肾病等肾脏疾病的病理过程[42-43]。肾脏损伤后，肾脏TXNIP表达显著增加，促进炎性因子释放，扩大炎症级联反应，加速肾脏损伤[44]。此次实验发现，一次性力竭运动大鼠肾脏TXNIP表达显著增加，说明TXNIP参与力竭运动后肾脏炎症反应。研究证实，TXNIP可与NLRP3直接结合介导NLRP3的活化，增加促炎因子表达，诱发炎症反应[45]。而SIRT1激活可抑制TXNIP表达，阻断TXNIP与NLRP3的相互作用，抑制NLRP3炎性小体的激活，抑制炎症反应[19]。此次实验发现，一次性力竭运动大鼠肾脏SIRT1表达减少，TXNIP表达增多，NLRP3表达升高，且SIRT1蛋白表达与TXNIP和NLRP3蛋白表达呈显著负相关，提示一次性力竭运动可能通过抑制肾脏SIRT1表达激活TXNIP信号通路，诱发炎症反应，损伤大鼠肾脏功能。另有研究证实， miR-155通过直接靶标抑制靶基因表达调节炎症递质的产生，而SIRT1的表达受miRNAs调节[46]。研究证实，miR-155靶标SIRT1，抑制SIRT1表达，促进炎症反应，加速脂多糖诱导的急性肾损伤[47]。此次实验发现，一次性力竭运动显著增加大鼠肾脏miR-155，减少SIRT1的表达，且miR-155表达与SIRT1蛋白表达呈显著相关，与TXNIP和NLRP3蛋白表达呈显著正相关，推测一次性力竭运动可能通过增加肾脏局部miR-155表达激活其下游信号通路SIRT1/ TXNIP，激活NLRP3炎性小体，诱发大鼠肾脏炎症反应。表明一次性力竭运动损伤大鼠肾脏功能，可能与miR-155/SIRT1/TXNIP通路的激活有关。
综上所述，一次性力竭运动可显著上调大鼠血清和肾脏miR-155表达，激活miR-155/SIRT1/TXNIP信号通路，增加肾脏NLRP3炎性小体表达，诱发肾脏炎症反应，损伤肾脏功能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

一次性力竭运动模型促进大鼠肾脏NOD样受体蛋白3炎性小体的表达

A single bout of exhaustive exercise induces renal NOD-like receptor protein 3 inflammasome expression in rats

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