2.1   体内实验结果
2.1.1   实验动物数量分析   所有兔都很好地耐受手术，术后至取材前没有明显的伤口感染、皮肤坏死，整个实验过程中无动物死亡。
2.1.2   组织学分析结果   苏木精-伊红染色显示，与术后2周相比，术后4周可见更明显的纤维化组织且更为紧密；马松及天狼猩红染色显示，与术后2周相比，术后4周产生更多的胶原且胶原排列更为紧密粗壮，并且通过天狼猩红染色中胶原颜色能够看到其胶原组成主要为Ⅰ和 Ⅲ 型，见图1，说明外基质与膝关节纤维化的发展具有相关性。




2.1.3   免疫组织化学染色结果   成纤维细胞计数分析显示，术后4周的膝关节纤维化组织中成纤维细胞更多，约为术后2周时的2倍；PCNA免疫组织化学染色结果显示，术后4周可见更多的细胞核聚集，处于增殖期的成纤维细胞约术后2周的2.4倍，见图2。



2.2   体外实验结果
2.2.1   外基质构建结果   前期研究发现，细胞分泌外基质厚度 ≥10 μm。激光共聚焦三维显微镜显示，纤维连接蛋白呈现网状结构，构成细胞生存的支架，且细胞核散在分布于网状结构的空隙，横切面显示外基质厚度≥10 μm，见图3。




2.2.2   免疫荧光染色结果   未脱细胞外基质可见大量的胶原蛋白、纤维连接蛋白及细胞形态，见图4A。脱细胞后，大量的Ⅰ和 Ⅲ 型胶原蛋白与纤维连接蛋白互相杂糅，构成细胞生存的网络系统，原始细胞形态已不存在，见图4B。结合动物纤维化组织中的胶原构成，表明脱细胞外基质基本能够模拟体内的外基质组成。



2.2.3   细胞膜染色与细胞黏附结果   细胞膜染色显示，三维培养的细胞呈现纺锤形，二维培养的细胞则呈现不规则图形并出现大量散乱的突触，见图5A，说明脱细胞外基质更利于细胞的早期功能维持。快速黏附实验结果示，脱细胞外基质更利于成纤维细胞的早期黏附，数量较二维培养增加了约5倍，见图5B。



2.2.4   扫描电镜观察结果   扫描电镜显示，脱细胞外基质是由大量纤维状组织构成的不规则体系，存在大量的空隙，见图6A。接种成纤维细胞5 h后，成纤维细胞呈现典型的纺锤形，其突触与脱细胞外基质的纤维状组织交织并可深入到脱细胞外基质的空隙，见图6B，从而促进细胞的黏附、迁移及生存。




2.2.5   细胞计数与EdU实验结果   细胞计数结果显示，接种于脱细胞外基质中的成纤维细胞能够更快地增殖，至72 h时细胞的增殖逐渐减缓；二维培养的细胞起始增长较慢，至72 h时细胞才处于快速增长阶段，但数量依然低于三维培养，见图7A。EdU实验结果显示，相较于二维培养，脱细胞外基质中处于增殖状态的成纤维细胞数量增加了1倍，见图7B，C。



2.2.6   细胞周期分析结果   结果显示，脱细胞外基质中处于S期的成纤维细胞数量约为二维培养的3倍，见图8A，B。
2.2.7   Western blot检测结果   Western blot检测结果示，脱细胞外基质中细胞的增殖蛋白PCNA、Cyclin D1表达水平高于二维培养，见图8C-E，说明脱细胞外基质更利于成纤维细胞的增殖；脱细胞外基质中细胞的p-MEK、p-ERK蛋白表达高于二维培养(P < 0.05)，见图9。

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纤维化粘连是膝关节术后最严重的并发症之一，据统计全膝关节置换及交叉韧带重建术后膝关节纤维化发生率分别高达3%-10%及4%-35%[1-3]。由于膝关节术后术区过度纤维化导致其与周围神经、骨、韧带等组织发生粘连，从而引发患者下肢疼痛及运动障碍、甚至不能运动，给医生及患者带来深深的困扰[4-6]。
近年来为了预防关节纤维化的发生，科研及医务人员采取了多种解决方案，包括通过局部应用药物如丝裂霉素C、秋水仙碱、羟基喜树碱等，尽管取得了一定的效果，但由于其不良反应制约了临床应用[7-8]；还可采用物理治疗、应用抗炎药物、微创手术等方法，但由于效果参差不齐或者存在方法自身的不足，如再复发、感染、费用等，并未得到医务工作者的普遍认可[9-13]。因此，膝关节术后过度纤维化的机制研究依然重要。
医务及科研工作者一直在探究膝关节术后纤维化粘连的发生机制。一项体内研究发现，小鼠膝关节纤维化是由于转化生长因子β1刺激成纤维细胞的局部过量增殖及分化所导致[14]。全膝关节置换术后过量的外基质生成是膝关节纤维化的主要表现。此外，一项膝关节核糖核酸测序研究发现，外基质组织基因如胶原蛋白等在关节纤维化患者中表达明显增加[15]。目前普遍认为由于术后血肿机化、术区生成过量的外基质最后形成瘢痕而与周围组织发生粘连，诱发下肢运动障碍及躯体疼痛[16]。
基于以上基础，作者认为外基质在膝关节外纤维化发生发展中起着至关重要的作用，因此实验旨在探究脱细胞外基质模拟体内外基质对成纤维细胞的影响，阐明外基质在膝关节术后纤维化发生中的可能机制。 
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，细胞实验。
1.2   时间及地点   实验于2019年3月至2020年1月在扬州大学动物实验中心及靖江人民医院中心实验室完成。
1.3   材料   人瘢痕组织来源的成纤维细胞购买自雅吉生物科技有限公司(上海，中国)。
1.3.1   实验动物   12只健康成年新西兰大白兔，雄性，体质量3.5-4.0 kg，由扬州大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(苏)2016-0019，动物实验取得扬州大学动物伦理委员会批准，批准号：2017KY-114。
1.3.2   主要试剂与仪器   抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 、Cyclin D1、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、GAPDH抗体购买于CST公司；抗纤维链接蛋白、胶原蛋白(ColⅠ/Ⅲ )购买自Abcam公司；Bradford蛋白检测试剂盒(P0006，碧云天)；DIO染液(C1038，碧云天)；显微镜(AXIO-VERT-A1 蔡司，德国)；激光共聚焦显微镜(TCS SP8，徕卡，德国)；流式细胞仪(MoFlo TM XDP，贝克曼，美国)；荧光显微镜(AXIO-SCOPE-A1蔡司，德国)；扫描电镜(GeminiSEM 300 FESEM，蔡司，德国)。
1.4   实验方法
1.4.1   体内实验
兔膝关节粘连模型构建：膝关节模型构建步骤依据前期实验方法[17]。简述如下：12只实验兔禁食过夜，20%氨基甲酸乙酯(4 mL/kg)耳缘静脉麻醉，待深度麻醉后将兔仰卧位固定于手术台，左下肢术区备皮，后予以碘伏消毒。根据定位逐层分离皮下组织、筋膜、肌肉至股骨内外侧髁，术中做好止血并保持术区清洁，于内外侧髁各钻取直径8 mm的骨缺损区直至松质骨，术中保护膝关节韧带、软骨等组织，充分止血后逐层缝合，碘伏消毒，克氏针固定屈曲位，做好术后皮肤消毒。术后连续3 d行耳缘静脉注射动物用庆大霉素(8×104 U/d)。2周及4周后可见膝关节依然处于屈曲位，大体观察术区及膝关节瘢痕组织形成，证实造模成功。
实验取材：术后2，4周分别安乐死6只实验兔，远离术区两端分别离断，10倍组织体积40 g/L中性多聚甲醛固定48 h，EDTA脱钙，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，连续4 µm切片。
苏木精-伊红染色：二甲苯透明处理，递减梯度乙醇水化，自来水清洗1 min，苏木精浸染10 min，自来水清洗
1 min，1%盐酸乙醇分化，流水缓慢清洗15 min，1%尹红浸染3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透化，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。
马松染色：切片脱蜡依次至自来水蒸馏水，苏木精染液染色5 min，充分水洗，丽春红浸染5 min，水洗，快速1%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸水溶液分化3 min，苯胺蓝染5 min，快速1%冰醋酸快速分化，脱水封固，显微镜下观察并拍照。
天狼猩红染色：切片脱蜡至水，天青石蓝染色5 min，蒸馏水洗3 min，天狼星红饱和苦味酸染液浸染15 min，无水乙醇分化脱水，二甲苯透化，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。
免疫组织化学染色：脱蜡水化，抗原修复，封闭，一抗抗PCNA，4 ℃ 孵育过夜，PBS清洗，对应的二抗抗兔室温孵育30 min，PBS清洗，DAB显色剂显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。
1.4.2   体外实验
脱细胞外基质的构建：操作参考文献[18]中的方法。将0.2%DPBS+(+代表添加Ca2+和Mg2+ ；-代表不添加Ca2+和Mg2+)稀释明胶均匀铺于6孔培养板底部，放入细胞培养箱60 min；1%DPBS+稀释戊二醛固定明胶30 min，1 mol/L乙醇胺30 min；DPBS+清洗后，将成纤维细胞按1×106/孔接种于6孔板，每孔加入2 mL完全培养基，16 h后更换含有
50 mg/L抗坏血酸的培养基，后每2 d更换一次。7 d后行脱细胞处理，2 mL每孔裂解液(DPBS-稀释的，体积比0.5% Triton X-100，20 mmol/L NH4OH)裂解三四分钟，可见大量的絮状细丝，看不到完整形态的细胞，DPBS-清洗。DNase I
 2 mL/well培养箱30 min，DPBS-清洗，4 ℃保存。
免疫荧光实验：取脱细胞前后外基质，40 g/L中性多聚甲醛固定30 min，2%Triton-100通透15 min，3%BSA封闭
30 min。一抗(纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白)
4 ℃ 孵育 16 h，PBS 清洗3次，二抗室温下孵育2 h，PBS清洗，DAPI复染细胞核10 min，激光共聚焦显微镜下拍摄。
细胞膜DIO染色：将成纤维细胞与培养基稀释的DIO染液(10 μmol/L)混匀，37 ℃摇床旋转混匀30 min。离心收集细胞，PBS重悬清洗，重复以上两步骤4次，消除残留DIO染料。将标记后的成纤维细胞分别接种于脱细胞外基质(3%BSA预封闭)(三维培养)和空24孔板内(二维培养)，细胞浓度为5×107 L-1，每孔1 mL。培养箱继续培养5 h后，
40 g/L中性多聚甲醛固定，荧光显微镜下拍摄。
细胞快速黏附实验：Hoechst 33342标记成纤维细胞核8 min，PBS重悬并洗涤，离心收集，反复洗涤3次。将标记后的成纤维细胞分别接种于脱细胞外基质(三维培养)和空24孔板内(二维培养)，细胞浓度为5×108  L-1，每孔1 mL。培养10 min后PBS冲洗，40 g/L中性多聚甲醛固定25 min，PBS冲洗 3遍，荧光显微镜下观察并拍摄。
扫描电镜分析：将成纤维细胞接种于脱细胞外基质上，细胞浓度为5×106  L-1，每孔1 mL。5 h后弃去培养基，PBS清洗，2.5%戊二醛4 ℃固定12 h；梯度乙醇(体积分数30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%)脱水，每梯度2次，每次15 min；临界点干燥，均匀喷金，扫描电镜下观察并拍照。
细胞计数实验：弃去脱细胞外基质上层的PBS，PBS清洗3次。将2×104 的成纤维细胞分别接种于脱细胞外基质(三维培养)和空24孔板内(二维培养)，24，48，72，96 h后消化并收集细胞，完成细胞计数。
EdU实验：将成纤维细胞分别接种于脱细胞外基质(三维培养)和空24孔板内(二维培养)，接种密度为5×
104/孔，相同完全培养基下培养48 h，培养基稀释的
20 µmol/L 5-ethynyl-2’-deoxyuridine 继续培养4 h。40 g/L多聚甲醛固定 25 min，2%Triton X-100透膜10 min，click-iT混合物避光室温孵育30 min，PBS 洗3次，Hoechst 33342细胞核复染10 min，荧光显微镜下观察并拍摄。
细胞周期分析：将成纤维细胞分别接种于脱细胞外基质(三维培养)和空培养皿内(二维培养)，接种密度为1×106/孔。培养48 h后消化并收集细胞，弃上清，4 ℃ 预冷的PBS洗涤并重悬细胞3次；收集细胞，4 ℃下预冷体积分数70%乙醇再次重悬并4 ℃过夜，0.5 mL的PI染液重悬，室温下避光静置放置30 min，流式细胞仪上样检测。
Western blot检测：将成纤维细胞分别接种于脱细胞外基质(三维培养)和空培养皿内(二维培养)，接种密度为1×106/孔。培养箱培养48 h后提取总蛋白[18]，16 100 ×g离心15 min，收集上清。Bradford蛋白检测试剂盒检测总蛋白。取40 μg蛋白质，8%-10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(抗PCNA、Cyclin D1、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、GAPDH)4 ℃过夜孵育，二抗室温孵育2 h。GAPDH用作内参蛋白。
1.5   主要观察指标   外基质在膝关节术后纤维化中的作用及体外对成纤维细胞增殖能力的影响。
1.6   统计学分析   采用SPSS 14软件进行数据处理，以x±s表示，数据间比较采用t 检验，P < 0.05表明数据差异有显著性意义。

膝关节术后关节纤维化严重影响患者的生活质量，同时给医务工作者也带来了极大的挫败感。过量的关节内纤维化会导致瘢痕生成并与周围组织及韧带、神经根发生粘连，诱发下肢运动障碍及疼痛[5，9，19-20]。有研究报道，膝关节置换术后关节纤维化的发生率高达28.2%，且再手术率更是高达17.4% [21]。然而其机制及治疗手段尚未研究透彻，目前普遍认为由于膝关节术后血肿机化，周围细胞分泌大量的炎性因子、细胞因子诱导成纤维细胞迁移、增殖，进而产生大量的外基质，细胞外基质又进一步促进成纤维细胞的大量增殖，最终生成过量的外基质沉积于关节周围，最后形成瘢痕纤维黏附于膝关节周围[22-23]。前文所述，外基质成分(如胶原蛋白、整合素、胞外胺氧化酶)在膝关节纤维化患者瘢痕组织中的表达明显增加[15]，然而膝关节纤维化的机制尚未得到证实，鉴于以上文献，作者猜想术后膝关节外基质可能是通过促进成纤维细胞的增殖进一步促进自身的合成，从而导致膝关节术后纤维化形成。通过兔膝关节粘连模型发现，关节纤维化严重程度与术区外基质的胶原含量呈现一致性，这表明外基质分泌与膝关节术后关节纤维化密切相关，这一发现也与之前的研究结论相一致[2，24]。并且随着外基质的增加，成纤维细胞数量和处于增殖期的阳性细胞也明显增多，说明外基质可能是通过促进成纤维细胞的增殖导致膝关节纤维化。此外，兔膝关节模型的组织胶原组成主要是由Ⅰ型和Ⅲ 型胶原构成，与临床术后关节纤维化组织的胶原组成基本一致[15，25]，说明此次实验的动物模型能够较好地模拟人膝关节术后关节纤维化的发生发展。
为了验证外基质与成纤维细胞的关系，构建了成纤维细胞来源的脱细胞外基质模型，经基质厚度及脱细胞外基质功能测定表明构建的脱细胞外基质达到了实验要求[18， 26]。脱细胞外基质能够在早期即塑造成纤维细胞的纺锤形形态，这证明脱细胞外基质能很好地模拟体内细胞的生存状态，并且提供了细胞快速黏附的条件。免疫荧光染色结果示，脱细胞外基质中含有大量的Ⅰ型和Ⅲ 型胶原，这与动物模型基本契合，说明脱细胞外基质模拟体内外基质构成具有一定的可行性。通过细胞计数、EdU、细胞周期、Western blot实验发现，相同处理时间下脱细胞外基质中成纤维细胞处于增殖期的数量更多，说明外基质可能是通过促进细胞的增殖加速术后关节纤维化的发展。虽然，前期研究证明外基质能够调控细胞的增殖、迁移、黏附[27]，但是外基质对成纤维细胞的增殖及关节纤维化粘连的影响尚未研究，通过此次实验初步证实了外基质能够促进关节纤维化。
外基质究竟是因为什么促进细胞的增殖？通过3D影像及扫描电镜图像发现，脱细胞外基质是由大量的胶原蛋白、纤维连接蛋白等大分子蛋白构成的丝状的三维结构，其间充斥着脱细胞后的空隙。将细胞重新接种后发现，细胞早期即呈现典型的纺锤型，并且生出大量的细胞突触与脱细胞外基质的纤维相互交织杂糅，且部分突触探入到脱细胞后的空隙中，可能这些都有利于细胞的增殖、迁移。因此，可能是由于外基质构建的三维空间结构及外基质中的大分子成分促进了成纤维细胞的增殖。
实验存在以下几点不足：首先，实验建立在猜想的基础上，后续将加入外基质构型及外基质成分对成纤维细胞的影响；其次，脱细胞外基质硬度能够影响肌成纤维细胞的分化[28]，实验未涉及脱细胞外基质的硬度问题，后续可能进一步探究脱细胞外基质结构、成分、硬度等对细胞功能的作用；最后，动物实验尚停留在模拟阶段，与临床真实情况存在偏差，后期将进步改善动物模型并加入临床标本研究。
综上所述，实验初步探索了外基质对关节纤维化粘连的影响，外基质可能通过激活ERK信号通路促进成纤维细胞的增殖而导致关节纤维化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

外基质：细胞在正常及病理状态下都会产生并分泌大量的纤维连接蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等蛋白及多糖，这些物质在细胞表面或细胞之间形成网络状的三维空间构成了细胞生存的空间，维持细胞功能，将细胞裂解并去除细胞碎片及遗传物质便会得到脱细胞外基质。

膝关节粘连：膝关节术后或创伤可引发膝关节过度纤维化而形成瘢痕，致使其与周围神经、骨、韧带等组织发生粘连，导致患者下肢疼痛及运动障碍。4%-10%行全髋关节置换的患者术后会发生膝关节粘连，严重影响患者的生活及工作。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1动物实验显示，兔膝关节纤维化模型能够很好的模拟人体关节纤维化，外基质与膝关节纤维化粘连及成纤维细胞的增殖呈现一致性。

2 实验构建的脱细胞外基质能够很好的模拟体内细胞所处的外基质环境，且此次脱细胞外基质根据前期研究能够达到标准。

3 细胞实验发现，外基质能够促进成纤维细胞增殖可能是通过激活FAK/MEK/ERK的磷酸化实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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