绝经后骨质疏松症关联长链非编码RNA uc431+相互作用蛋白质组学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3107

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (11): 1641-1646.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3107

• 骨组织构建 bone tissue construction • 下一篇

绝经后骨质疏松症关联长链非编码RNA uc431+相互作用蛋白质组学分析

李生强，谢冰颖，陈娟，谢丽华，黄景文，葛继荣

福建省中医药科学院基础研究所骨质疏松证候基因组学研究室，福建省福州市 350003

收稿日期:2020-04-27 修回日期:2020-04-28 接受日期:2020-05-28 出版日期:2021-04-18 发布日期:2020-12-21
通讯作者: 葛继荣，博士，研究员，博士生导师，福建省中医药科学院基础研究所骨质疏松证候基因组学研究室，福建省福州市 350003
作者简介:李生强，男，1979年生，福建省三明市人，汉族，博士，副研究员，主要从事中医药防治骨质疏松研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81774350)；福建省自然科学基金项目(2019J01339)

Interaction proteomics of long noncoding RNA uc431+ gene in postmenopausal osteoporosis

Li Shengqiang, Xie Bingying, Chen Juan, Xie Lihua, Huang Jingwen, Ge Jirong

Department of Osteoporosis Syndrome Genomics, Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medical Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China

Received:2020-04-27 Revised:2020-04-28 Accepted:2020-05-28 Online:2021-04-18 Published:2020-12-21
Contact: Ge Jirong, PhD, Researcher, Doctoral supervisor, Department of Osteoporosis Syndrome Genomics, Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medical Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
About author:Li Shengqiang, PhD, Associate researcher, Department of Osteoporosis Syndrome Genomics, Institute of Basic Research, Fujian Academy of Chinese Medical Sciences, Fuzhou 350003, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81774350; the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2019J01339

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
长链非编码RNA：没有编码蛋白潜力的RNA系列，称之为非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)。根据其长度是否超过200个核苷酸，非编码RNA分为小分子ncRNA(small noncoding RNA)及长链非编码 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)。lncRNA位于细胞核或胞质内，可形成二级结构，可与蛋白质、DNA和RNA相互作用。目前已发现lncRNA可通过多种机制(如染色质重塑、剪接调控、mRNA降解和翻译调控等)、在多种层面上(如表观遗传调控、转录调控、转录后调控)调控基因的表达，并可与靶基因或靶蛋白构成细胞内复杂的调节网络，既参与机体内多种重要的生理过程，也参与调节机体的各种病理过程。
相互作用蛋白质组学：是一种基于质谱技术对蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-药物/小分子化合物的相互作用进行大规模定性或定量研究的蛋白质组学方法。采用免疫沉淀或者pull down等亲和分离方法，将与特定分子结合的蛋白质进行分离，再采用质谱的方法进行定性或定量，获得一定数目的差异蛋白-相互作用蛋白，利用生物信息学对差异蛋白进行GO分析、信号通路预测及相互作用网络构建等分析预测，是研究蛋白质相互作用的重要工具。

背景：过表达LncRNA TUG1促进破骨细胞的增殖及抑制凋亡，采用siRNA敲低则取得了相反的结果，表明敲低LncRNA TUG1可能成为一个骨质疏松治疗的潜在靶点。
目的：研究与绝经后骨质疏松症关联非编码RNA uc431+相互作用的蛋白组并进行生物信息学分析。
方法：将甲醛交联的人单核细胞白血病细胞株(THP-1)细胞超声破碎，实验组与结合生物素标记的特异性探针的磁珠进行杂交，对照组与非特异性探针的磁珠进行杂交，获得的与非编码RNA uc431+结合的多肽进行质谱分析，获得的数据使用 MaxQuant 进行搜库和定量分析。对2组样品的定量结果进行统计学分析，得到对应的富集蛋白，并进行 GO、KEGG通路、蛋白互作分析和展示，构建蛋白质相互作用网络。
结果与结论：①获得的多肽总数为918条，蛋白总数为271个，过滤后蛋白总数为241个，与对照组相比，实验组差异蛋白为10个：DDOST、DMBT1、HPD、IGLL5、IGK、LTF、LYZ、MUC5AC、PIGR及RPL23；②GO富集分析表明，它们参与防御反应、白细胞激活等生物学过程及核糖体rRNA结合、溶菌酶活性等分子功能；③Kegg通路分析预测它们参与辅酶Q生物合成、苯丙氨酸代谢、核糖体信号肽及唾液分泌等信号通路；④结合蛋白质组学及生物信息学分析，预测绝经后骨质疏松症关联非编码RNA uc431+可能通过互作蛋白参与免疫调节及骨代谢过程。

https://orcid.org/0000-0003-3077-6144 (李生强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨质疏松症, 绝经, 非编码RNA, 蛋白组学, 质谱, 乳铁蛋白, 骨代谢, 生物信息学

Abstract: BACKGROUND: Overexpression of LncRNA TUG1 promotes osteoclast proliferation and inhibits apoptosis. Knockdown with siRNA has achieved the opposite result, indicating that knockdown of LncRNA TUG1 may become a potential target for osteoporosis treatment.
OBJECTIVE: To study the proteins interacting with the non-coding RNA uc431+ associated with postmenopausal osteoporosis and carry out bioinformatics analysis.
METHODS: Human monocytic leukemia cell line (THP-1) cells crosslinked with formaldehyde were broken by ultrasound. The experimental group was hybridized with magnetic beads combined with biotin labeled specific probes. The control group was hybridized with the magnetic beads of non-specific probes. The obtained peptides were identified using mass spectrometry. The data were searched and quantified by MaxQuant. The quantitative results of the two sets of samples were statistically analyzed, and the corresponding enrichment proteins were obtained. Gene ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway, protein-protein interaction analysis and display were performed, and the protein-protein interaction network was constructed.
RESULTS AND CONCLUSION: The total number of peptides obtained was 918, with 271 proteins in total, and the total number of proteins after filtration was 241. Compared with the control group, there were 10 differential proteins in the experimental group, including DDOST, DMBT1, HPD, IGLL5, IGK, LTF, LYZ, MUC5AC, PIGR, and RPL23. GO enrichment analysis showed that they were involved in biological processes such as defense reaction, leukocyte activation, ribosomal rRNA binding, lysozyme activity and other molecular functions. KEGG pathway analysis predicted that they were involved in ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis, phenylalanine metabolism, ribosome and salivary secretion. Combined with the analysis of proteomics and bioinformatics, it is predicted that uc431+, a gene related to postmenopausal osteoporosis, may be involved in immune regulation and bone metabolism by interacting proteins.
Key words: osteoporosis; menopause; non-coding RNA; proteomics; mass spectrum; lactoferrin; bone metabolism; bioinformatics

Key words: osteoporosis, menopause, non-coding RNA, proteomics, mass spectrum, lactoferrin, bone metabolism, bioinformatics

中图分类号:

李生强, 谢冰颖, 陈娟, 谢丽华, 黄景文, 葛继荣. 绝经后骨质疏松症关联长链非编码RNA uc431+相互作用蛋白质组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1641-1646.

Li Shengqiang, Xie Bingying, Chen Juan, Xie Lihua, Huang Jingwen, Ge Jirong. Interaction proteomics of long noncoding RNA uc431+ gene in postmenopausal osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(11): 1641-1646.

图/表（结果） 5

参考文献

[1] SOWERS MR, ZHENG H, GREENDALE GA, et al. Changes in bone resorption across the menopause transition: effects of reproductive hormones, body size, and ethnicity. J Clin Endocrinol Metab. 2013; 98(7):2854-2863.
[2] DJEBALI S, DAVIS CA, MERKEL A, et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 2012;489(7414):101-108.
[3] HUYNH NP, ANDERSON BA, GUILAK F, et al. Emerging roles for long noncoding RNAs in skeletal biology and disease. Connect Tissue Res. 2017;58(1):116-141.
[4] MA Z, GUO C. Advances on the effects of lncRNA on bone metabolism related signaling pathways in Osteoporosis. Chin J Osteoporos. 2018; 4(4):547-551.
[5] WU QY, LI X, MIAO ZN, et al. Long Non-coding RNAs: A New Code for Osteoporosis. Front Endocrinol. 2018;9:587.
[6] SILVA AM, MOURA SR, TEIXEIRA JH, et al. Long noncoding RNAs: a missing link in osteoporosis. Bone Res. 2019;7:10.
[7] ZHANG HL, DU XY, DONG QR. LncRNA XIXT promotes osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells and alleviates osteoporosis progression by targeting miRNA-30a-5p. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(20):8721-8729.
[8] HAN Y, LIU C, LEI M, et al. LncRNA TUG1 was upregulated in osteoporosis and regulates the proliferation and apoptosis of osteoclasts. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):416
[9] LING L, HU HL, LIU KY, et al. Long noncoding RNA MIRG induces osteoclastogenesis and bone resorption in osteoporosis through negative regulation of miR-1897. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019; 23(23):10195-10203.
[10] CHEN J, XIE L, LI S, et al. Analysis of lncRNA expression and regulation network in postmenopausal osteoporosis patients with Kidney Yin deficiency. Chin J Osteoporos. 2015;21(5):553-559.
[11] LI S, XU H, CHEN J, et al. Study on the expression of lincRNA uc431+ in postmenopausal osteoporosis patients with kidney-yin deficiency syndrome. Chin J Osteoporos. 2016;22(8):966-971.
[12] SETA N, OKAZAKI Y, KUWANA M. Human circulating monocytes can express receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and differentiate into functional osteoclasts without exogenous stimulation. Immunol Cell Biol. 2008;86(5):453-459.
[13] WANG H, SHEN Y. MicroRNA 20a negatively regulates the growth and osteoclastogenesis of THP 1 cells by downregulating PPARγ. Mol Med Rep. 2019;20(5):4271-4276.
[14] MOULINE CC, QUINCEY D, LAUGIER JP, et al. Osteoclastic differentiation of mouse and human monocytes in a plasma clot/biphastic calcium phosphate microparticles composite. European cells and materials. 2010;20:379-392.
[15] SZKLARCZYK D, GABLE AL, LYON D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-613.
[16] OKAZAKI Y. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 2002;420(6915):63-73.
[17] 熊坤,邓江,黄文良,等.长链非编码RNA参与调控成骨细胞分化和破骨细胞的生成[J].中国组织工程研究,2020,24(14):2229-2234.
[18] WANG H, ZHAO W, TIAN QJ, et al. Effect of lncRNA AK023948 on rats with postmenopausal osteoporosis via PI3K/AKT signaling pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(5):2181-2188.
[19] WANG H, LI YK, CUI M, et al. Effect of lncRNA AK125437 on postmenopausal osteoporosis rats via MAPK pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(5):2173-2180.
[20] FAN P, FENG XY, HU N, et al. Expression of long-chain non-coding RNA NEAT1 in osteoporosis and its effect on differentiation of osteoblasts and osteoclasts. Joural of clinical and experimental medicine. 2019;18 (23):2504-2507.
[21] ZHANG J, HAO X, YIN M, et al. Long non-coding RNA in osteogenesis: A new world to be explored. Bone Joint Res. 2019;8(2):73-80.
[22] VICENTINI C, GALUPPINI F, CORBO V, et al. Current role of non-coding RNAs in the clinical setting. Noncoding RNA Res. 2019;4(3):82-85.
[23] GHAFOURI-FARD S, TAHERI M. Long non-coding RNA signature in gastric cancer. Exp Mol Pathol. 2019;113:104365.
[24] HAN Y, LIU C, LEI M, et al. LncRNA TUG1 was upregulated in osteoporosis and regulates the proliferation and apoptosis of osteoclasts. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):416.
[25] 孙强,赵轶男,王远瑞,等. LncRNA HOTAIR调控miR-130a-3p对骨关节炎软骨细胞增殖和分化的影响[J].中国骨与关节杂志,2019, 8(12):931-937.
[26] CAITLIN AC, ELIZABETH AM, JAMES DM. Production of Human Lactoferrin and Lysozyme in the Milk of Transgenic Dairy Animals: Past, Present, and Future. Transgenic Res. 2015;24(4):605-614.
[27] THOMAS JH, GARY M, ARNOLD JK. Lysozyme synthesis in osteoclasts. J Bone Miner Res. 1990;12(5):1217-1222.
[28] DAGENG H , YANGYANG W, JING L, et al. Proteomic profiling analysis of postmenopausal osteoporosis and osteopenia identifies potential proteins associated with low bone mineral density. PeerJ. 2020;8: e9009.
[29] CORNISH J, CALLON KE, NAOT D, et al. Lactoferrin is a potent regulator of bone cell activity and increases bone formation in vivo. Endocrinology. 2004;145(9):4366-4374.
[30] LIU M, FAN F, SHI P, et al. Lactoferrin promotes MC3T3-E1 osteoblast cells proliferation via MAPK signaling pathways. Int J Biol Macromol. 2018;107(Pt A):137-143
[31] FAN F, SHI P, LIU M, et al. Lactoferrin preserves bone homeostasis by regulating the RANKL/RANK/OPG pathway of osteoimmunology. Food Funct. 2018;9(5):2653-2660.
[32] CHEN XW, LI YH , ZHANG MJ, et al. Lactoferrin ameliorates aging-suppressed osteogenesis via IGF1 signaling.J Mol Endocrinol. 2019; 63(1):62-75.
[33] XU Y, AN JJ, TABYS D, et al. Effect of Lactoferrin on the Expression Profiles of Long Non-coding RNA during Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2019;20(19) pii: E4834.
[34] LI Y, ZHANG W2, REN F, et al. Activation of TGF-β Canonical and Noncanonical Signaling in Bovine Lactoferrin-Induced Osteogenic Activity of C3H10T1/2 Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2019; 20(12) pii: E2880.
[35] HANSTOCK HG, EDWARDS JP, WALSH NP. Tear Lactoferrin and Lysozyme as Clinically relevant biomarkers of mucosal immune competence. Front Immunol. 2019;10:1178.
[36] ANDRÉ GO, POLITANO WR , MIRZA S,et al. Combined effects of lactoferrin and lysozyme on streptococcus pneumoniae killing. Microb pathog . 2015;89:7-17.
[37] VAN BERKEL PH, GEERTS ME, VAN VEEN HA, et al. N-terminal stretch Arg2, Arg3, Arg4 and Arg5 of human lactoferrin is essential for binding to heparin, bacterial lipopolysaccharide, human lysozyme and DNA. Biochem J. 1997;328(Pt 1):145-151
[38] XIE L, FAN C, LI S, et al. Effects of liuwei dihuang pill on difference-expressed genes of kidney Yin deficiency syndrome in postmenopausal osteoporosis. Chin J Osteoporos. 2015;21(8):971-976+985.
[39] SHEN Z, WANG W. Reference standard for syndrome differentiation of deficiency syndrome in traditional Chinese medicine. Chin J Integr Med.1986;6(10):598．
[40] CHANG Z,FEN C,SHI X,et al.Research progress of immunity and osteoporosis.Chin J Osteoporos. 2015;21(4):508-513.
[41] LI S, FENG E, ZHANG Y, et al. Study of the gene expression profile in the bone tissue with kidney yin deficiency syndromes in primary osteoporosis. Chin J Osteoporos. 2013;19(12):1215-1218+1253.

引言

绝经后骨质疏松症是一种以骨量低下、骨微结构破坏导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病，对绝经后妇女的健康影响甚大。传统观点认为体内雌激素水平下降[1]，成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间失衡是骨质疏松发生的重要机制，但详细的发病机制仍需要进一步研究。近年随着组学及测序技术的快速发展，越来越多的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)被鉴定及功能注释[2]，它们已经成为探讨骨质疏松症发病、治疗机制的新热点[3-4]。
lncRNA在骨质疏松症中的作用机制研究近两年开始有较多的报道[5]，越来越多的研究表明，lncRNA参与了骨代谢过程，在骨形成、骨吸收等过程中起着重要作用[6]。ZHANG等[7]发现，LncRNA XIXT在骨质疏松症患者血清中表达降低，在成骨过程中其表达显著提升，通过吸收mi-30a-5p，LncRNA XIXT上调RUNX2促进人骨髓间充质干细胞的分化，从而减轻骨质疏松。HAN等[8]发现，与健康人群相比，LncRNA TUG1在骨质疏松症患者血清中表达更高，而且其表达水平随着临床分期的进展而升高。进一步的研究发现，过表达LncRNA TUG1促进破骨细胞的增殖及抑制凋亡；采用siRNA敲低则取得了相反的结果，表明敲低LncRNA TUG1可能成为一个骨质疏松治疗的潜在靶点。Lnc MIRG在破骨生成中表达提高，它作为miR-1897的分子海绵可以靶向调节NFATc1，促进破骨生成及骨吸收[9]。
课题组前期已采用长链非编码RNA芯片技术检测绝经后骨质疏松症肾阴虚证患者外周血单核细胞 lncRNAs 的表达水平[10]，并对差异表达的非编码RNA uc431+进行了临床扩大标本验证[11]，实时定量PCR证实它在绝经后骨质疏松症肾阴虚证患者外周血中存在低表达。因临床采血的血液样品中单核细胞的数量难以达到实验要求，且前期长链非编码RNA芯片检测标本来源于人外周血单核细胞，而人单核细胞白血病细胞株THP-1也具有分化成破骨细胞的干性[12-14]，因此为了进一步研究 uc431+功能，此次研究采用RNA亲和纯化技术，合成特异性探针，从人单核细胞白血病细胞株THP-1中纯化与uc431+相互作用蛋白，质谱分析差异蛋白，对其进行生物信息学预测及分析，对于进一步分析、探讨uc431+在骨质疏松症的功能具有重要意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2019年1至5月在福建省中医药科学院中心实验室完成；期间探针合成及质谱检测委托上海康成生物工程有限公司完成。
1.3 材料人单核细胞白血病细胞株THP-1购自武汉大学细胞库；DMEM培养基、Dynabeads® M-270 Streptavidin购自美国Thermol Scientific公司，胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；二甲基亚砜、碘乙酰胺(iodoacetamide)购自美国Sigma公司；蛋白酶抑制剂购自上海康成生物工程有限公司。二氧化碳细胞培养箱、Q-Exactivee台式四极杆轨道阱高分辨质谱仪、EASY-nLC1200纳升级液相色谱仪均为美国Thermol Scientific公司产品。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养人单核细胞白血病细胞株THP-1购自武汉大学细胞库。细胞株培养于含有体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，置于体积分数5% CO2、37 ℃二氧化碳细胞培养箱中培养，三四天进行细胞传代。取对数生长期的细胞进行甲醛交联，收集用于下一步实验。
1.4.2 互作蛋白的获得实验分为实验组和对照组。根据 uc431+碱基系列，设计并合成生物素标记的探针；将甲醛交联的THP-1细胞超声破碎，实验组与结合生物素标记的特异性探针的磁珠进行杂交过夜，洗脱液去交联、沉淀，还原烷基化及Trypsin酶解，获得的多肽再经脱盐、真空干燥，重溶多肽至10 μL。对照组与非特异性探针的磁珠进行杂交。见表1。

1.4.3 LC-MS/MS 每个样品取5 μL 多肽经 nano-UPLC 液相系统 EASY-nLC1200 进行分离，分离后连用 Q-Exactive 质谱仪在线进行质谱分析。分析时长：120 min/sample，正离子检测模式，母离子扫描范围：350-1 400 m/z。DDA采集方式为：每次全扫描后采集 10 个碎片图谱(MS2 scan，HCD)。MS1在m/z 200 时分辨率为70 000，MS2 在m/z 200 时分辨率为 35 000；MS1 AGC 为1E+6 ，MS2 AGC 为1E+5，最大离子注入时间(Max IT)：MS1，100 ms，MS2，120 ms。标准化碰撞能量 (NCE) 为 28%，隔离窗口为2 m/z，动态排除时间 30 s。
1.4.4 MaxQuant 搜库和 label-free定量 LC-MS/MS原始数据使用 MaxQuant (version 1.5.6.0) 进行搜库和定量分析。蛋白数据库为：UNIPROT_HUMAN_2018_09；定量方式为 MS1定量。特异性酶为trypsin/P，最大漏切数 3；可变修饰有Oxidation (M)，Acetyl(protein N-term)，固定修饰 Carbamidomethyl (C) ；多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01；用于定量的多肽仅包括Unique，可变修饰的多肽不用于定量；同时进行iBAQ非标定量。
1.5 主要观察指标 ①获得的多肽、蛋白、过滤后蛋白总数；②差异蛋白；③GO分析；④KEGG 通路分析；⑤STRING 蛋白互作分析。
1.6 统计学分析和生物信息学分析对两组样品的定量结果进行统计学分析，符合正态分布的两组间比较，采用t 检验；非正态分布，采用秩和检验。P < 0.05为差异有显著性意义。筛选条件为：实验组∶对照组> 10，同时满足 unique peptide数 ≥2；并进行后续 GO、KEGG通路、蛋白互作分析和展示。

讨论

3.1 既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题自从2002年日本学者OKAZAKI[16]在小鼠身上第一次发现并鉴定了一类较长的转录产物，并将其命名为LncRNA以来，越来越多的长链非编码RNA的功能及作用机制被阐明。在骨质疏松领域，自从2018年以来才开始有较多的相关文献发表。科学家发现，无论在骨形成过程中还是骨吸收过程中，lncRNA都参与其中，甚至直接参与骨代谢相关信号通路[17-20]，为阐释骨质疏松的新机制提供新的思路。部分文献的不足之处在于，它们在阐释机制的时候，缺乏直接证据，并没有找到lncRNA直接作用的分子或蛋白。
3.2 作者研究区别于他人他篇的特点 lncRNA本身并不翻译蛋白，其发挥调控功能需要结合蛋白质，因此研究lncRNA与蛋白的相互作用，鉴定与lncRNA相结合的蛋白质，已经成为研究lncRNA功能及分子作用机制的重要手段。此次研究在前期筛选出特异表达非编码RNA uc431+[10]，并临床扩大标本验证之后[11]，采用先分析与lncRNA相互作用蛋白，采用亲和层析-质谱技术，筛选到10个与lncRNA相互作用的蛋白质分子，这样明显缩小了互作蛋白的范围，为今后研究uc431+的作用机制提供便利和直接证据。
3.3 研究的局限性 LncRNA属于较新的RNA分子，也是机体复杂调控机制的重要组成。LncRNAs在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上均可能发挥作用，其作用机制十分复杂[21]，比如，lncRNA可能发挥海绵的作用[7，9]，结合特异siRNA，降低siRNA的效应，这样的作用机制此次研究方法就难以发现。
3.4 研究的重要意义 LncRNAs作为机体调控网络体系的一部分，其多样的调控机制明显增加了机体调控的复杂程度[22-25]。从lncRNA角度可能发现复杂疾病——骨质疏松的发生发展的新机制。
此次研究中，共筛选到10个差异蛋白，其中互作蛋白溶菌素和乳铁蛋白都是先天免疫系统的一部分，在眼泪、黏液和整个胃肠道中分泌[26]。溶菌素还可以与病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA形成复盐，使病毒失活。据报道，破骨细胞合成大量溶菌素及其mRNA，含量是巨噬细胞的2-4倍[27]。绝经后妇女外周血蛋白表达谱研究表明，Lysozyme C (P61626)的表达与骨密度呈负相关[28]。因此，推测溶菌素与 uc431+的相互作用可能与单核细胞、破骨细胞功能相关。
互作蛋白乳铁蛋白是转铁家族的铁结合糖蛋白，与骨代谢的关系十分密切，与骨质疏松的关系也得到了较为深入的研究。早在2004年已发现乳铁蛋白促进成骨分化，减少细胞凋亡达50%-70%；在小鼠骨髓，破骨细胞生成受到乳铁蛋白抑制并呈现剂量依赖性；在成年小鼠颅骨上注射乳铁蛋白，4 mg剂量的乳铁蛋白使新骨形成增加了4倍[29]。在体外MC3T3-E1细胞系的研究中发现，乳铁蛋白能增强成骨细胞的增殖能力并呈剂量依赖性，其机制是通过促进ERK、JNK及p38的磷酸化，诱导c-Fos 及 c-Jun的表达，从而促进MC3T3-E1成骨细胞增殖[30]。用乳铁蛋白喂养卵巢切除小鼠，它能提高血清碱性磷酸酶的水平，降低抗酒石酸酸性磷酸酶，提高小鼠的骨密度；根据Micro CT结果，乳铁蛋白能够促进长骨的数量、厚度、骨容量及钙、磷含量，进一步的研究发现乳铁蛋白可能与RANKL/RANK/OPG信号通路调节相关[31]。最近的研究表明，乳铁蛋白可以通过胰岛素样生长因子1信号通路促进骨生成，阻止老年性骨质疏松[32]。乳铁蛋白能促进大鼠间充质干细胞的成骨分化[33]，lncRNA表达谱生物信息学分析表明，乳铁蛋白使转化生长因子β诱导功能紊乱，但对核因子κB信号通路起促进作用 [34]，为乳铁蛋白对成骨分化lncRNA的作用机制提供新见解。所有这些研究表明，预测长链非编码RNA uc431+的作用机制很可能通过乳铁蛋白发生作用，但具体的机制仍需要进一步研究。
人缺铁乳铁蛋白和溶菌酶是黏膜固有免疫系统的2个重要组成部分，对多种微生物具有溶解作用。它们可能是黏膜免疫功能的标记物[35]。由于它们在宿主的类似的微环境中被发现，有学者提出缺铁乳铁蛋白和溶菌素可以协同控制细菌在黏膜的传播[36]。在体外实验中，缺铁乳铁蛋白和溶菌素的结合已被证明能够增强对不同病原体的杀灭作用，它们之间存在着相互的协同作用。研究表明，arg-Arg-Arg-Arg这4个连续精氨酸残基的N端延伸在人乳铁蛋白与肝素、脂质a、人溶菌酶和DNA的相互作用中起决定性作用[37]。
在前期的绝经后骨质疏松症患者外周血全基因表达谱芯片实验中，乳铁蛋白在绝经后骨质疏松症组与正常组中并没有显著差异，但在六味地黄丸服药前后的全基因表达谱芯片结果中，发现乳铁蛋白基因水平提升1.50倍[38]，表明了乳铁蛋白很可能参与了补肾中药治疗骨质疏松症的过程。
KEGG信号通路分析中，发现差异蛋白中DMBT1、MUC5AC及溶菌素参与唾液分泌等信号通路，而绝经后骨质疏松症阴虚证患者常有口舌干涩或咽燥口干等临床症状[39]，它们之间是否具有一定联系，值得进行探讨。此外，从图3中可以就看出，DMBT1、MUC5AC及溶菌素3个蛋白之间存在着相互作用，增加了该信号通路的可信度。
互作蛋白IGLL5、IGK、PIGR都与免疫相关，一方面是因为从人单核细胞白血病细胞株筛选互作蛋白谱，与免疫密切相关；另一方面，从既往研究中也发现，从骨质疏松症患者血液中筛选的差异基因中，许多都与免疫调节相关[40-41]，说明骨质疏松与免疫调节的密切关系，非编码RNA uc431+的功能很可能与此相关。目前还没有IGLL5、IGK、PIGR与骨代谢的相关报道。
总之，文章采用亲和层析和质谱的方法，分析了绝经后骨质疏松症关联非编码RNA uc431+的互作蛋白，构建了uc431+互作蛋白网络。生物信息学预测这些蛋白参与了免疫调节、骨代谢等生物学过程。长链非编码RNA uc431+与乳铁蛋白之间的相互作用，具有较大潜力，值得深入研究，对于从非编码RNA角度探讨骨质疏松症的分子机制具有重要参考价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

绝经后骨质疏松症关联长链非编码RNA uc431+相互作用蛋白质组学分析

Interaction proteomics of long noncoding RNA uc431+ gene in postmenopausal osteoporosis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	肖方骏, 陈树东, 栾继耀, 侯宇, 何坤, 林定坤. 丹参干预骨质疏松症：网络药理学解释的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 772-778.
[2]	李平, 林煜, 陈翔, 刘振涛, 肖莉莉, 林学义, 华鹏. 二至丸提取物干预去势骨质疏松雌性模型大鼠的骨重建特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 191-195.
[3]	黄朱宋, 林煜, 陈翔, 蓝锦福, 关勇, 高曦. 巴戟天醇提物对卵巢切除肥胖模型大鼠脂代谢及骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 205-210.
[4]	曹国龙, 田发明, 刘家寅. 洛伐他汀联合胰岛素干预双侧卵巢切除2型糖尿病SD模型大鼠骨折的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 673-681.
[5]	李绍烁, 顾一丹, 尹恒, 郭杨, 马勇, 王建伟. 基于网络药理学方法分析“龟板-鹿角”药对活性成分治疗骨质疏松症的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(35): 5668-5674.
[6]	孙国平, 罗选翔, 潘彬. 绝经后骨质疏松症的预防和药物联合序贯治疗[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(33): 5385-5390.
[7]	何丽, 刘斋, 高志梅, 刘春颖, 赵君禄, 任庆云. 腰椎磁共振影像组学对女性骨质疏松症的诊断价值[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(30): 4841-4846.
[8]	何琪, 张罡瑜, 王海彬, 陈鹏. 大型跨膜蛋白Piezo1在骨科相关疾病中的参与及意义[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(30): 4882-4888.
[9]	温霜威, 武青梅. 有氧运动联合左旋甲状腺素与维生素D3改善亚临床甲减大鼠骨质疏松的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4118-4124.
[10]	李绍烁, 顾一丹, 邵阳, 尹恒, 王建伟. CiteSpace知识图谱可视化分析中医药防治绝经后骨质疏松症[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4224-4230.
[11]	陈天宁, 杨铁毅, 邵进, 孔德策, 刘树义, 周文超, 张岩. 免疫相关基因在绝经后骨质疏松症患者外周血白细胞中的表达 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(25): 4033-4038.
[12]	钱光, 余月明, 董有海, 洪洋, 王明海. 脉冲电磁场磁疗与骨硬化蛋白单克隆抗体联合干预绝经后新西兰大白兔骨代谢和骨微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(20): 3130-3134.
[13]	吴慧婷, 崔田田, 欧阳厚淦, 欧阳彦楚, 易岚, 陈楚. 不同疗程热敏灸干预骨质疏松症模型大鼠穴位周围结缔组织及脊髓的形态学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(20): 3135-3139.
[14]	周倚墨, 张建宁, 单中书. 补骨脂提取物干预骨质疏松模型大鼠骨密度及骨生物力学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 165-170.
[15]	程余婷, 伍超, 黄晓林, 李芳, 石前会, 周倩, 洪伟, 王永, 廖健. 低剂量唑来膦酸对去势拔牙大鼠破骨及成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(17): 2686-2693.