构建靶向型Pluronic F127/芒柄花黄素纳米复合体系体外抗肝癌活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2364

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (4): 526-531.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2364

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构建靶向型Pluronic F127/芒柄花黄素纳米复合体系体外抗肝癌活性

柳扬，龚毅，范伟

贵州省人民医院肝胆外科二部，贵州省贵阳市 550002

收稿日期:2019-12-05 修回日期:2019-12-11 接受日期:2020-02-22 出版日期:2021-02-08 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 范伟，博士，主任医师，贵州省人民医院肝胆外科二部，贵州省贵阳市 550002
作者简介:柳扬，男，1986年生，河南省信阳市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事肝胆胰脾疾病治疗方面的研究。
基金资助:
2016年度贵阳市科技计划项目(20161001)

Anti-hepatoma activity of targeted Pluronic F127/formononetin nanocomposite system in vitro

Liu Yang, Gong Yi, Fan Wei

Second Department of Hepatobiliary Surgery, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China

Received:2019-12-05 Revised:2019-12-11 Accepted:2020-02-22 Online:2021-02-08 Published:2020-11-21
Contact: Fan Wei, MD, Chief physician, Second Department of Hepatobiliary Surgery, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China
About author:Liu Yang, Master, Chief physician, Second Department of Hepatobiliary Surgery, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China
Supported by:
the Science and Technology Program of Guiyang in 2016, No. 20161001

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
芒柄花黄素：是一种异黄酮，可从多种药用植物和草药中提取，包括红三叶草和黄芪。多项研究表明芒柄花黄素可促进包括乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌和肝癌在内的多种癌细胞的程序化死亡，由于水溶性差、体内代谢周期短和抗癌机制不明确限制了其临床应用。
薄膜水化法：是实验室研究中制备脂质体的最简单的方法之一，该方法通过去除圆底烧瓶中的有机溶剂制备脂质薄膜，通过匀浆搅拌分散介质形成粒径分布范围较大的异质脂质体，最后通过聚碳酸酯膜挤出，得到均质的小脂质体。

背景：天然黄酮类化合物芒柄花黄素是传统中药提取物，具有抗癌作用，但疏水性结构、体内代谢周期短限制了其临床应用。
目的：制备负载芒柄花黄素的Pluronic F127-叶酸共轭胶束，检测其体外释药性能与抗癌活性。
方法：采用碳二亚胺交联剂化学方法制备叶酸偶联的Pluronic F127(PF-FA)，采用薄膜水化法制备负载芒柄花黄素的Pluronic F127胶束(FN-PF)与负载芒柄花黄素的Pluronic F127-叶酸共轭胶束(FN-PF-FA)，检测FN-PF与FN-PF-FA胶束的包封率、载药量与体外释药性能。采用体外硫荷达明B实验检测游离芒柄花黄素、FN-PF胶束、FN-PF-FA胶束对叶酸过表达人肝癌HepG2细胞的体外抗癌活性。
结果与结论：①FN-PF和FN-PF-FA胶束的包封率分别为(84.12±2.15)%和(82.50±1.78)%，载药量分别为(21.33±2.27)%和(19.73±1.58)%；②两种胶束在酸性环境中的释药速率均快于碱性环境；在相同环境中，FN-PF-FA胶束的释药速率慢于FN-PF胶束；③在相同的药物浓度下，FN-PF胶束、FN-PF-FA胶束抑制人肝癌HepG2细胞增殖的能力强于游离的芒柄花黄素(P < 0.05)，并且FN-PF-FA胶束的抑制作用强于FN-PF胶束 (P < 0.05)；④抑制肿瘤所需的药物浓度顺序为FN-PF-FA胶束<FN-PF胶束<游离的芒柄花黄素，组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)；⑤结果表明，FN-PF-FA胶束具有靶向抗癌药物释放的潜力。

https://orcid.org/0000-0002-5240-8302 (柳扬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 纳米, 靶向, 肝癌, 叶酸, 胶束, 释药

Abstract: BACKGROUND: Natural flavonoid formononetin (FN) is traditional Chinese medicine extract and has anticancer effect, but the hydrophobic structure and short half-life in vivo limit their clinical applications.
OBJECTIVE: To prepare FN loaded pluronic (PF)-folic acid (FA) conjugated micelles (FN-PF-FA) and to test in vitro drug release and anticancer activity.
METHODS: FA coupling PF was prepared by carbodiimide crosslinker chemical method. FN-PF-FA micelles were prepared by film hydration method. The encapsulation efficiency, drug loading and drug release performance of FN-PF and FN-PF-FA micelles were measured. The in vitro anti-cancer activity of flavin, FN-PF micelles, and FN-PF-FA micelles on folic acid-overexpressing human liver cancer HepG2 cells was measured by in vitro thiohodamine B experiment.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The encapsulation efficiency of FN-PF and FN-PF-FA micelles was (84.12±2.15)% and (82.50±1.78)%, respectively, and the drug loading was (21.33±2.27)% and (19.73±1.58)%, respectively. (2) The release rate of both micelles in acidic environment was faster than that in alkaline environment. In the same condition, the release rate of FN-PF-FA micelles was slower than that of FN-PF micelles. (3) At the same drug concentration, the ability of FN-PF micelles and FN-PF-FA micelles to inhibit the proliferation of human liver cancer HepG2 cells was stronger than that of free FN (P < 0.05). Moreover, the inhibitory effect of FN-PF-FA micelles was stronger than that of FN-PF micelles (P < 0.05). (4) The order of drug concentration required to inhibit tumors was FN-PF-FA < FN-PF < free FN, and there was a significant difference between groups (P < 0.01). (5) Results suggested that FN-PF-FA micelles had the potential to target the release of anticancer drugs.

Key words: materials, nano, targeting, liver cancer, folic acid, micelle, drug release

中图分类号:

柳扬, 龚毅, 范伟. 构建靶向型Pluronic F127/芒柄花黄素纳米复合体系体外抗肝癌活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 526-531.

Liu Yang, Gong Yi, Fan Wei. Anti-hepatoma activity of targeted Pluronic F127/formononetin nanocomposite system in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(4): 526-531.

图/表（结果） 7

2.1 PF-FA共轭傅里叶变换红外光谱的表征 PF、PF-NH2、叶酸和PF-FA的傅里叶变换红外光谱如图1所示。PF在 3 522.5 cm-1处出现典型的羟基峰，而PF-NH2在3 364， 1 521 cm-1处出现新的吸收峰，分别对应于胺基(N-H，宽)和羰基(C=O)峰[19]。在叶酸中，3 600-3 000 cm-1出现羟基(-OH)和N-H拉伸振动峰，羧基的C=O拉伸振动出现在 1 692 cm-1处，1 640 cm-1处出现峰值，这与-CO-NH基团的C=O键拉伸振动有关；1 605 cm-1处为N-H振动的弯曲模态，1 412 cm-1处为苯基骨架的-OH变形带，苯环的特征吸收峰出现在1 483 cm-1。在PF-FA中，3 399 cm-1(N-H)和1 521 cm-1 (C=O)处出现的吸收峰与PF-FA结构中的酰胺基(-CO-NH)有关。

2.2 临界胶束浓度检测结果临界胶束浓度是影响载药胶束体内外稳定性的重要参数。实验中碘被用作疏水探针来监测PF和PF-FA胶束的形成，结果显示PF-FA的临界胶束浓度远低于PF(表1)。

2.3 FN-PF-FA胶束的表征 FN-PF和FN-PF-FA胶束的大小直接影响其稳定性、药物释放、生物分布和细胞摄取。透射电子显微镜显示两种胶束表面光滑，呈球形(图2)。FN-PF胶束的平均粒径小于FN-PF-FA。颗粒表面的Zeta电位反映了颗粒表面的Zeta电位，Zeta电位在胶体稳定性和与细胞的相互作用中起着重要作用。FN-PF胶束表现出负Zeta电位较低(表1)，这可能是由于胶束表面存在的PF的末端聚氧化乙烯(PEO)基团；FN-PF-FA胶束表现出较高的负Zeta电位(表1)，这可能是由于外周叶酸羧酸基团的存在所致[20]。

2.4 芒柄花黄素的包封率和体外释放 FN-PF和FN-PF-FA胶束的包封率分别为(84.12±2.15)%和(82.50±1.78)%，两种胶束具有很高的包封率，这可能是由于PF分子的非极性基团很大，形成了一个与FN相互作用的强疏水核，允许更多的包封。FN-PF和FN-PF-FA胶束的载药量分别为(21.33±2.27)%和(19.73±1.58)%。
两种胶束释放的芒柄花黄素如图3所示，在最初的 12 h(30%-40%)内观察到一次突释，随后进入缓释期，在相同pH值下，FN-PF-FA胶束释放芒柄花黄素的速率慢于FN-PF；同一胶束不同pH值下，pH=5.3时约80%的芒柄花黄素在5 d内释放，而同期只有约50%的芒柄花黄素在pH=7.4下释放(P < 0.01)，这可能是由于在酸性pH值下芒柄花黄素的分散性较高[21]。

2.5 体外抗癌实验结果相对于空白对照组和对照组，芒柄花黄素组、FN-PF组、FN-PF-FA组的细胞数量减少，其中FN-PF-FA组细胞均呈现圆形，几乎无细胞贴壁生长，见图4。用GI50值来量化芒柄花黄素在PF-FA胶束制剂50%孵化细胞在设计时间段内的生长[22]。从图5A可以看出相对于芒柄花黄素，在相同浓度下FN-PF和FN-PF-FA胶束对HepG2细胞的抑制作用显著提高(P < 0.05)；相同浓度下与FN-PF胶束对比，FN-PF-FA胶束对HepG2细胞抑制作用显著提高(P < 0.05)。
芒柄花黄素的GI50为(28.6±1.2) mg/L，FN-PF胶束的GI50大幅度降低至(17.4±0.78) mg/L，即降低了38.46%；FN-PF-FA胶束的GI50值为(9.5±0.4) mg/L，即与芒柄花黄素相比减少66.43%，与FN-PF胶束相比减少44.83%(P < 0.01)，见图5B。

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引言

芒柄花黄素(7-羟基-4’-甲氧基异黄酮)是一种异黄酮类植物雌激素，存在于黄芪、苦参、鸡血等多种中药中，可缓解绝经引起的骨流失和动脉顺应性[1-3]。研究表明芒柄花黄素对部分恶性肿瘤有显著抑制作用，是传统医学中治疗癌症的标准药物之一[4]。由于疏水性和机体代谢作用，口服芒柄花黄素在血液和癌症组织中的浓度较低，疗效受限，为提高治疗效果需高浓度、频繁给药，而这通常会导致严重的不良反应。为提高芒柄花黄素的生物利用度、降低不良反应，多种纳米给药体系已被制备如脂质体、纳米乳液、脂质球粒和碳纳米管等[5-8]，其中脂质体优势明显，但其结构复杂、价格昂贵、稳定性差、载药量低。此外，纳米乳液在室温下不稳定，随着时间的推移粒径随着相分离而增大[9]。故价格低廉、安全有效、能长期稳定释放的给药体系，对于芒柄花黄素的应用具有重要意义。
癌症治疗的有效性是在不损害健康组织的情况下降低和消除肿瘤的增殖能力。对肿瘤的靶向性因可显著降低药物对健康组织的毒性，在病灶区域富集而受到广泛关注[3]。聚合物胶束作为一种用于负载疏水性药物的多功能纳米载体，由于纳米尺寸、疏水性药物载负能力及配体介导的主动靶向性，聚合物胶束获得了理想的生物制药学和药代动力学特性[10]。
Pluronic F127(PF)是聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的三嵌段共聚物，可以组装成胶束，其中心是由疏水聚环氧丙烷段构成，壳层或电晕的外层是由亲水性聚环氧乙烷构成[11]。疏水部分可用于在胶束内疏水药物的装载，而胶束表面的聚环氧乙烷起到保护胶束避免免疫系统识别与血清蛋白相互作用，增加药物在血浆中的滞留时间[12]。叶酸作为一种有效的靶向配体已被广泛研究[13]，其来源广泛，分子质量低，与受体亲和力高。文献表明氧化形式的叶酸可以和多种形式的生物活性分子结合，通过受体介导的内吞作用进入细胞内部。叶酸受体在卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌、肝癌等多种人类癌细胞中过度表达，而在正常组织中分布很少[14]。
实验首次将芒柄花黄素负载到PF-叶酸共轭胶束中，通过溶解度和靶向性的改善提高芒柄花黄素的生物利用度，为黄酮类化合物的应用提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2016年11月至2019年5月在贵州大学医学院实验室完成。
1.3 材料芒柄花黄素(上海联迈生物工程有限公司)；PF(上海阿拉丁试剂有限公司)；叶酸、咪唑羰基、二环己基二亚胺(DCC)、琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基亚砜(美国sigma公司)；二氯甲烷、乙腈(高效液相色谱级)、甲醇(高效液相色谱级)、1，2-乙二胺、磷酸二氢钾、乙醚(北京化工公司)；透析袋(分子质量12 000 Da，德国Sigma-Aldrich公司)；傅里叶变换红外光谱(FTIR，Bruker Vertex-70/80，日本东京)；Zetasizer 300 HSA(英国马尔文仪器有限公司，Malvern，英国)；分光光度计(Shimadzu UV-2401，Shimadzu，Tokyo，Japan)。
1.4 实验方法
1.4.1 叶酸偶联PF(PF-FA)[15-16] 将PF(12.7 g，1 mmol)和咪唑羰基(0.25 g，1.5 mmol)溶解于20 mL二甲基亚砜，混合于100 mL的圆底烧瓶中，加入0.2 mL三乙胺，闭光氮气保护下搅拌4 h，得到咪唑羰基活化的PF(PF-CDI)。
将PF-CDI(12.6 g，1 mmol)溶解于干燥的乙腈(15 mL)中，室温下在乙腈(15 mL)中滴加过量的N，NO-羰基二咪唑(1.62 g，10 mmol)，在氮气中放置2 h。继续搅拌混合物4 h，溶液在旋转蒸发器中浓缩并倒入过量乙醚。这个过程被重复6-8次以移除未反应的咪唑羰基。PF-CDI在真空脱水下干燥并收集为白色粉末。
将PF-CDI(12.7 g，1 mmol)溶于干燥乙腈(15 mL)中，于室温下滴加至10 mL 1，2-乙二胺中，反应过夜。旋转蒸发除去未反应的乙二胺，将粗品倒入过量乙醚中得到白色沉淀。该过程重复6-8次，将PF-NH2在真空脱水下干燥并收集为白色粉末。将PF-NH2(91 g，0.079 mmol)、叶酸(105 mg，0.237 mmol)、NHS (60 mg，0.522 mmol)和DCC(108 mg，0.522 mmol)溶于10 mL二甲基亚砜中，合成叶酸偶联的PF(PF-FA)。将混合物置于在氮气中，室温，闭光，过夜搅拌。然后用20 mL去离子水稀释混合物，离心分离未反应的DCC。上清液用去离子水透析2 d后冻干，进一步纯化。
1.4.2 负载芒柄花黄素的PF和PF-FA胶束制备采用膜水合法制备负载芒柄花黄素的PF和PF-FA胶束[17]。首先将5 mg 芒柄花黄素和10 mg PF-FA共轭(1∶2)，在含甲醇的7 mL圆底烧瓶中溶解。溶剂在50 ℃下经旋转蒸发器蒸发约30 min得到药物聚合物。室温下真空中除去残余甲醇。室温下用20 mL超纯水将所得聚合物水合，得到负载芒柄花黄素的PF-FA胶束(FN-PF-FA胶束)。采用同样方法制备了负载芒柄花黄素的PF胶束(FN-PF胶束)。
1.4.3 PF-FA共轭红外光谱对样品进行了傅里叶变换红外光谱分析，粉碎，加压150 kg/cm2制备颗粒。在范围4 000-400 cm-1内扫描了PF、叶酸和PF-FA的红外光谱。
1.4.4 临界胶束浓度利用碘紫外分光光度法测定双蒸馏水中PF和PF-FA的临界胶束浓度[17]。为制备标准的KI/I2溶液，将1 g碘和2 g碘化钾溶解在100 mL双蒸馏水中。制备含相同含量KI/I2(25 mL标准溶液)的PF或PF-FA聚合物溶液(浓度范围为0.000 1%-0.1%)，在室温下避光平衡12 h，然后进行测量。用紫外可见分光光度计测量不同聚合物浓度在250 nm处的紫外吸收值。吸收强度与聚合物质量浓度对数呈正比。
1.4.5 FN-PF和FN-PF-FA胶束的表征采用透射电子显微镜对FN-PF-FA胶束的表面形貌进行研究。将一滴FN-PF-FA胶束 (1 g/L)放置在铜网格上，用滤纸除去多余的液体，在室温下干燥约半小时，用透射电镜观察含有FN-PF-FA胶束的铜网格。通过Zetasizer 300 HSA将样品分散到蒸馏水中，25 ℃测量zeta电位。
1.4.6 药物载负和体外释放 12 000 r/min离心分离胶束悬浮液中未包封的芒柄花黄素，测定FN-PF和FN-PF-FA胶束的包封率，上清液用PBS(pH=7.4)稀释，在250 nm处测定游离药物含量。包封率=胶束中药物的实际包封量/胶束中药物的初始用量×100%。
以PBS为释放介质，在pH=7.4(相当于生理pH值)和pH=5.3(模拟肿瘤中的微酸性环境)下，采用透析袋法从FN-PF和FN-PF-FA胶束中检测芒柄花黄素的体外释放。将等量芒柄花黄素溶液(1 g/L，1 mg)添加到透析袋(纤维素膜，Mw=12 000)中密封并浸入50 mL介质中，整个系统保持在(37.0±0.5) ℃100 r/min连续磁搅拌。在选定的时间间隔内取下样品并用新的培养基替换，于250 nm处的紫外吸收率确定释放芒柄花黄素的量。
1.4.7 体外抗癌活性和细胞摄取研究采用体外硫荷达明B实验(SRB法)检测游离芒柄花黄素、FN-PF、FN-PF-FA和PF-FA胶束对叶酸过表达人肝癌HepG2细胞(来自贵州大学医学院实验室)的体外抗癌活性[18]。将人肝癌HepG2细胞在加入体积分数10%胎牛血清和2 mmol/L L-左旋谷氨酸的DMEM培养基中培养。按5×103的密度接种在96孔板中，在37 ℃、100%相对湿度下培养24 h，用100 μL含有不同质量浓度(5，10，20，30 mg/L)自由芒柄花黄素的新鲜培养基及含有等量芒柄花黄素的FN-PF、FN-PF-FA替代培养基，以PF-FA胶束做对照，以不含任何药物的培养基为空白对照。孵育48 h后，加入50 μL冷三氯乙酸终止测定，4 ℃孵育60 min后取出培养基，无菌PBS洗涤，干燥。将50 μL的SRB溶液(0.4 g/L，1%乙酸)加入各孔中，室温下继续孵育20 min。染色后用1%醋酸洗涤去除未结合的染料，风干。用10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷洗脱结合染色液，在570 nm波长的ELISA平板阅读器上测量吸光度，计算细胞存活率，根据结果计算抑制肿瘤所需的药物浓度GI50。
1.5 主要观察指标游离芒柄花黄素、FN-PF胶束、FN-PF-FA胶束对叶酸过表达人肝癌HepG2细胞的体外抗癌活性。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件行统计处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，方差齐者采用t检验，方差不齐者采用矫正t检验进行统计处理。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

纳米药物作为抗癌药物的缓释载体已被广泛应用于各种天然药物载体的研发，以提高安全性、有效性和患者依从性[23]。一些可食用植物衍生化合物与癌症的化学预防和治疗关系密切[24]，其中黄酮类化合物在预防和治疗癌症方面显示出良好的药理特性。芒柄花黄素是以苯色酮环为基础的酚类化合物，属于异黄酮类，植物次生代谢产物可抑制不同类型癌症的生长，但由于水溶性差、体内代谢周期短和抗癌机制不明确限制了其临床应用。作者开发了PF和PF-FA共轭胶束作为芒柄花黄素的载体，以提高其疗效和生物利用率。
用不同的PF/叶酸摩尔比合成PF-FA共轭胶束，以确保PF的2个羟基中至少有一个或多个与叶酸的羧酸基共轭。为了合成PF-FA，PF首先被咪唑羰基活化形成咪唑氨基甲酸酯中间体(PF-CDI)。随后，PF-CDI与乙二胺反应生成端氨基的PF-NH2。叶酸与二环己基二亚胺和琥珀酰亚胺反应活化叶酸，由叶酸的羧基与PF-NH2反应生成PF-FA共轭物。傅里叶变换红外光谱结果显示PF-FA共轭成功，形成了酰胺基(-CO-NH)特征峰。
在低浓度下，PF-FA分子在水介质中分散良好。随着浓度的增加，体系的自由能增加，这是由于疏水区与周围水分子之间的不能相互作用。在特定临界胶束浓度下，具有适当几何结构的两亲性分子以这样的方式使疏水段与水环境分离，达到最小能量的状态，从而形成胶束。临界胶束浓度的明显降低表明，PF-FA胶束在悬浮液中具有良好的稳定性，使其对稀释相对不敏感，并使其比表面活性剂胶束具有更长的循环时间[25]。通常，在PF聚合物浓度达到临界胶束浓度之前溶解度很低，当聚合物的浓度高于高于临界胶束浓度是，其溶解度随PF聚合物浓度呈线性增加。
PF-FA形成的胶束有一个疏水(PPO)核锌，表面为亲水(PEO)壳，药物通过疏水相互作用和氢键浸入胶束的疏水核心。叶酸由2-氨基-4-羟基-6-甲基蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸三个一级结构组成，含有亲水性羧基和氨基，它们可以通过氢键相互作用。因此，作者推测胶束中叶酸含有的亲水性羧基和氨基的相互吸引作用，可能导致胶束的尺寸分布更宽。两种制剂的粒径均在50 nm以上和200 nm以下，适于经肠外途径高效给药[26]。这是一个显著的优点，因为大于10 nm的纳米颗粒可以逃过肾清除，小于200 nm的纳米颗粒可以逃过巨噬细胞的吞噬，延长循环半衰期。表面电势显示FN-PF-FA较FN-PF有更高的负Zeta电位，在网状内皮系统中具有较高的负Zeta电位，具有较长的血液循环时间，通过增强的渗透滞留效应到达癌细胞。
FN-PF和FN-FA-PF胶束对于芒柄花黄素都具有较高的包封率，表明叶酸的引入对胶束的包封率影响较小。叶酸和PF结合后降低了芒柄花黄素的是释放速率，可能是由于叶酸的芳香环和芒柄花黄素的酚羟基之间的氢键作用[27]。在0-12 h的时间段内，当pH=7.4和pH=5.3时，FN-PF-FA组释放率低于FN-PF组(P < 0.05)，尤其12 h间点更为明显，这可能是叶酸和芒柄花黄素结合后，负载负芒柄花黄素的FA-PF形成了氢键之外的键合，降低了芒柄花黄素的释放速率，确切的键合作用和化学键断裂机制还有待进一步研究。此外与正常生理pH值相比，肿瘤内的pH值是微酸性的，芒柄花黄素在微酸性环境下的释放速率高于正常生理pH环境(P < 0.01)，这可能是由于芒柄花黄素在酸性pH值下的溶解度增加，导致药物释放更高[28]。pH值依赖性释放有助于提高FN-PF-FA胶束作为高效传递体系的效率，而正常细胞不受影响。肿瘤内的酸性环境可触发FN-PF-FA胶束的快速释放，从而显著增强其细胞毒性，这可能有助于提高肿瘤细胞选择性和靶向摄取的优势。
体外细胞实验显示，FN-PF和FN-FA-PF胶束显著提高了芒柄花黄素的靶向型和抗癌活性(P < 0.05)。与FN-PF胶束相比，FN-PF-FA胶束对HepG2细胞的抑制作用也显著提高 (P < 0.05)，FN-PF-FA胶束的GI50值与FN相比减少66.43%，与FN-PF相比减少44.83%(P < 0.01)。而PF-FA本身不具有毒性，这说明共轭胶束本身具有良好的生物相容性。此外，FN-FA-PF表面高的负电位不利于胶束被细胞捕获。故FN-PF-FA对FN-PF的毒性提高作用可以归因于靶向性化合物的叶酸引入，提高了HepG2细胞对芒柄花黄素的内吞作用[29]。
实验成功制备了负载芒柄花黄素的PF-FA胶束，胶束尺寸较小，表面光滑呈球形，包封率高，呈pH依赖性芒柄花黄素释放。此外，FN-PF-FA胶束对叶酸过表达的人肝癌HepG2细胞显示出积极的靶向作用，提高了芒柄花黄素的生物利用度，这将有利于降低使用剂量，延长给药间隔，减少不良反应，提高患者依从性。此次实验结果表明，FN-PF-FA胶束可能是一种很有前途的抗癌药物，其优良的水溶性和生物活性将为黄酮类化合物在抗癌领域的应用提供新思路。进一步的研究将集中在体内抗肿瘤效率和药物剂量的优化，以获得治疗过程中不良反应少及最有效的剂量。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

构建靶向型Pluronic F127/芒柄花黄素纳米复合体系体外抗肝癌活性

Anti-hepatoma activity of targeted Pluronic F127/formononetin nanocomposite system in vitro

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