慢性脑低灌注对大鼠回肠黏膜Occludin及Claudin-2表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2869

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (32): 5186-5191.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2869

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慢性脑低灌注对大鼠回肠黏膜Occludin及Claudin-2表达的影响

李思宇1，2，王庆松1，2

¹西南交通大学医学院，四川省成都市 610031；²西部战区总医院神经内科，四川省成都市 610083

收稿日期:2019-11-16 修回日期:2019-11-20 接受日期:2019-12-26 出版日期:2020-11-18 发布日期:2020-09-25
通讯作者: 王庆松，博士，博士后，教授，西南交通大学医学院，四川省成都市 610031；西部战区总医院神经内科，四川省成都市 610083
作者简介:李思宇，女，1993年生，黑龙江省牡丹江市人，汉族，2020年西南交通大学毕业，硕士，主要从事神经科学相关研究。
基金资助:
四川省卫计委科研课题(16PJ014)

Effect of chronic cerebral hypoperfusion on expression of Occludin and Claudin-2 in rat ileum mucosa

Li Siyu1, 2, Wang Qingsong1, 2

¹College of Medicine, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, Sichuan Province, China;²Department of Neurology, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China

Received:2019-11-16 Revised:2019-11-20 Accepted:2019-12-26 Online:2020-11-18 Published:2020-09-25
Contact: Wang Qingsong, MD, Professor, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, Sichuan Province, China; Department of Neurology, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
About author:Li Siyu, Master, College of Medicine, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, Sichuan Province, China; Department of Neurology, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Sichuan Provincial Health and Family Planning Committee, No. 16PJ014

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

慢性脑低灌注模型：通过永久结扎双侧颈总动脉构建的全脑慢性缺血模型，模拟慢性脑缺血损伤患者的病理生理状态，主要用于阐明神经变性疾病以及认知功能障碍的病理生理机制。

肠黏膜屏障：是一个复杂的半透屏障，吸收营养物质，感测免疫，同时限制有害抗原和微生物的运输，这种看似相互冲突的任务调节是通过结构成分和肠黏膜细胞之间的相互作用实现的，它们以动态方式运作以维持肠道完整性和免疫稳态。肠黏膜屏障主要由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障共同构成，机械屏障由肠道上皮细胞和它们之间的紧密连接构成，是维持肠黏膜屏障功能的主要因素，闭合蛋白occludin 及claudin是其中的重要组成部分，对维持上皮细胞极性及调节肠屏障的通透性发挥着重要的作用，维持肠上皮结构和功能的健全对于保护肠道屏障功能、防止细菌内毒素及毒性物质进入体内具有重要意义。

背景：前期研究发现，慢性脑低灌注可致大鼠肠道黏膜屏障发生改变，而闭合蛋白occludin 及claudin是构成肠道黏膜屏障的重要组成部分。

目的：探讨慢性脑低灌注对大鼠回肠黏膜屏障的影响。

方法：20只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术和慢性脑低灌注组。慢性脑低灌注组通过永久结扎双侧颈总动脉建立大鼠慢性脑低灌注模型；假手术组双侧颈总动脉只分离而不结扎和剪断。术后4周通过苏木精-伊红染色观察大鼠回肠组织形态学变化并评分，TUNEL荧光染色检测回肠细胞凋亡情况，Western blot检测回肠紧密连接蛋白Claudin-2，Occludin的表达水平，免疫组织化学检测Occludin表达变化。实验方案经西部战区总医院动物实验伦理委员会批准。

结果与结论：①苏木精-伊红染色形态学观察显示，与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠组织形态结构出现损伤不明显，病理评分无显著升高(P > 0.05)；②Western blot结果显示，与假手术组相比，慢性脑低灌注组大鼠回肠组织claudin-2表达升高，而Occludin表达降低(P < 0.05)；③TUNEL荧光染色显示，与假手术组相比，慢性脑低灌注组的细胞凋亡比例显著升高(P < 0.05)；④免疫组织化学结果显示，慢性脑低灌注组大鼠回肠组织Occludin表达降低(P < 0.05)；⑤结果说明，慢性脑低灌注会导致回肠黏膜屏障紧密连接蛋白Occludin表达降低及Claudin-2升高，可能存在一定肠道黏膜屏障功能损伤。

ORCID: 0000-0003-1961-1808(李思宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脑, 卒中, 慢性脑低灌注, Claudin-2, Occludin, 肠黏膜屏障, 动物, 模型

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that chronic cerebral hypoperfusion can cause changes in the intestinal mucosal barrier in rats, and Occludin and Claudin are important components of the intestinal mucosal barrier.

OBJECTIVE: To explore the effect of chronic cerebral hypoperfusion on the ileum mucosal barrier.

METHODS: Twenty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation (sham) group and chronic cerebral hypoperfusion model group. Animal model of chronic cerebral hypoperfusion was built by permanent bilateral common carotid artery ligation. The bilateral common carotid arteries of the sham group were isolated without ligation. The animals were killed at 4 weeks after operation, and their ileums were isolated for morphological observation and pathological scoring using hematoxylin-eosin staining. Apoptosis in the ileum cells was detected using TUNEL. Western blot was used to detect the expression of Claudin-2 and Occludin. immunohistochemical staining was used to detect the expression of Occludin. The study protocol was approved by the Animal Experiment Ethics Committee of General Hospital of Western Theater Command.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham group, hematoxylin-eosin staining showed that the ileum in the model group did not develop obvious injury with no higher pathological scores (P > 0.05). Western blot results indicated that compared with the sham group, the expression of claudin-2 was increased in the ileum tissue of the rats with chronic cerebral hypoperfusion, while the expression of Occludin was decreased (P < 0.05). TUNEL fluorescence staining showed that the apoptotic rate in the model group was significantly increased compared with the sham group (P < 0.05). Immunohistochemical results showed that the expression of Occludin in the ileum tissue of the chronic cerebral hypoperfusion group was significantly reduced (P < 0.05). These findings indicate that chronic cerebral hypoperfusion may damage the intestinal mucosal barrier by downregulating Occludin expression and upregulating Claudin-2 expression.

Key words: brain, stroke, chronic cerebral hypoperfusion, Claudin-2, Occludin, intestinal mucosal barrier, animal, model

中图分类号:

李思宇, 王庆松. 慢性脑低灌注对大鼠回肠黏膜Occludin及Claudin-2表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(32): 5186-5191.

Li Siyu, Wang Qingsong. Effect of chronic cerebral hypoperfusion on expression of Occludin and Claudin-2 in rat ileum mucosa[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(32): 5186-5191.

图/表（结果） 4

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引言

卒中等脑血管病是由各种疾病导致的脑缺血或出血性意外，是导致中国成年人残疾或死亡的首位病因^[1]，严重威胁人类健康，特别是危害50岁以上中老年人的健康，具有高患病率、高致残率、高死亡率和并发症多的特点，随着中国社会老龄化日益加剧，脑血管病患者也越来越多。据中国脑卒中防治报告显示，2016年全世界死于脑血管疾病的人数高达550余万人，成为仅次于心血管疾病的第二大死因^[2]，其中缺血性卒中占卒中总数比例高达70%^[3]。目前溶栓是治疗缺血性卒中的主要措施^[4]，通过在最短的时间内改善患者脑血流灌注^[5]，规避不可逆损伤，降低病残、病死率。尽管溶栓治疗是一个相当有效的治疗措施，但由于缺血性卒中并发症多，病理联系错综复杂，患者的预后仍不佳，据统计，合并严重并发症的缺血性卒中患者死于卒中的可能性是无并发症患者的4.86倍^[⁶^]，因此亟待找到新方法解决目前的困境。越来越多的研究证实肠黏膜屏障对脑血管病的预后有着十分重要的影响^[⁷^]，临床研究发现缺血性卒中后存在慢性感染状态，这可能与肠道菌群移位有关^[⁸^-⁹^]，缺血性卒中亦可引起肠道菌群变化^[¹⁰^]，而肠道菌群与认知行为具有重大关系^[1¹^]，甚至肠道菌群亦可影响卒中后脑梗死面积^[1²^-1⁴^]。肠道黏膜屏障作为宿主与肠道菌群相互作用的屏障，在脑-肠相互作用的过程中可能发挥着重要的作用，具有重要研究价值。

肠黏膜屏障是一个复杂的半透屏障，吸收营养物质，感测免疫，同时限制有害抗原和微生物的运输^[1⁵^]。这种看似相互冲突的任务调节是通过结构成分和肠黏膜细胞之间的相互作用实现的，其以动态方式运作以维持肠道完整性和免疫稳态。肠黏膜屏障主要由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障共同构成，机械屏障由肠道上皮细胞和他们之间的紧密连接构成，是维持肠黏膜屏障功能的主要因素^[1⁶^]，闭合蛋白occludin及claudin是其中的重要组成部分，对维持上皮细胞极性及调节肠屏障的通透性发挥着重要的作用，维持肠上皮结构和功能的健全对于保护肠道屏障功能、防止细菌内毒素及毒性物质进入体内具有重要意义^[1⁷^{- 1}⁸^]。

此次研究通过观察慢性脑低灌注状态下，大鼠肠道黏膜屏障紧密连接蛋白的表达，探讨肠黏膜屏障的损伤情况以及探讨它在缺血性卒中的作用及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年12月在西部战区总医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠20只，清洁级，体质量(250±20)g，购自成都市达硕实验动物中心，动物合格证编号：SCXK(川)2015-030。饲养于西部战区总医院中心实验室动物房，恒温(24±2)℃,恒湿(40%-60%)，通风良好，光照明暗交替每天12 h，自由取食饮水。

适应性喂养1周后，随机数字表法随机分为2组：假手术组(n=10)和慢性脑低灌注组(n=10)。研究所有动物实验已通过西部战区总医院动物实验伦理审查。

1.3.2 主要试剂与仪器小鼠抗Claudin-2，小鼠抗Occludin单克隆抗体(Santa Cruz)；苏木精-伊红染色试剂盒及SP-POD免疫组织化学试剂盒(索莱宝)；TUNEL染色试剂盒(凯基生物)；石蜡包埋机(Histostar)、烤片机(Slide Driving)、摊片机(Section Bath)、半自动石蜡切片机(Finesse E+)、组织包埋机(Histostar)、冰冻切片机(Crytome FE)均购自英国珊顿公司，倒置显微镜(IX81，日本欧林巴斯)；生物显微镜(DM3000，德国莱卡仪器股份有限公司)；电泳槽及转印系统(MINI-p TRANS-BLOT，美国BIO-RAD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 慢性脑低灌注模型建立及分组经课题组前期研究证实^[1⁹^-²⁰^]，术后4周，大鼠学习记忆能力明显受损同时存在肠道黏膜屏障明显受损，故选择术后4周对肠黏膜屏障做重点探讨。根据课题组前期方法学基础^[1⁹^，2¹^]，大鼠术前禁食8-12 h，禁水4 h。称质量，用1.5%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，手术区备皮消毒，于颈正中线切开1 cm左右切口，钝性分离筋膜，在胸锁乳突肌内侧有明显搏动处找到颈总动脉腱鞘，用玻璃分针轻柔钝性分离出颈总动脉。慢性脑低灌注组大鼠结扎左侧颈总动脉两端并剪断，缝合伤口，消毒并注射青霉素预防感染(2× 10⁵U/mL，0.15 mL/只)，1周后相同方法处理右侧颈总动脉，完成慢性脑低灌注模型建立。假手术组方法同前，但双侧颈总动脉只分离而不结扎和剪断。造模结束后密切观察大鼠的一般状况，发现情况异常的从研究中剔除。

1.4.2 肠组织标本的制备术后4周，用1.5%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠(70 mg/kg)，沿腹中线剪开，右下腹找到盲肠，在距回盲部5 cm处取回肠末段组织(长度约3 cm)，PBS漂洗，平均分成3段，每段1 cm左右，一份迅速放入液氮中，取材完毕后储存至-80 ℃冰箱，另外2份至40 g/L多聚甲醛中固定，1份固定24 h，制成石蜡标本，1份固定 4 h左右，OTC包埋后至于-80 ℃冰箱储存。

1.4.3 回肠组织苏木精-伊红染色用40 g/L多聚甲醛对回肠组织固定24 h后，依次脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切取4 μm厚的标本进行苏木素染色，分色后伊红染色，光镜下观察组织形态学变化并拍照，并参照Chiu氏肠黏膜损伤评分法进行病理损伤评估，正常黏膜绒毛0分；绒毛轻度水肿，上皮下空间扩张1分；黏膜上皮下空间扩张伴黏膜上皮层从固有层轻度抬高2分；大量上皮细胞从绒毛侧面下移，一些绒毛顶端裸露3分；黏膜固有层裸露伴毛细血管扩张4分；黏膜出血、溃疡固有层崩解5分。

1.4.4 Western blot检测紧密连接蛋白水平取出冻存的回肠组织100 mg，至于玻璃匀浆器中剪碎，并向其中加入1 mL RIPA(含10 μL PMSF)，上下研磨50下，得到的组织液体离心，4 ℃ 12 000×g 20 min，得到的上清分装后，按4∶1加入5xloading buffer后煮沸10 min，放入-20 ℃冻存。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳湿转法，配置10%分离胶检测Occludin，12%分离胶检测Claudin-2，然后上样，电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，用5%牛奶TBST 1∶200稀释一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗3×15 min，孵二抗1 h，TBST洗3×15 min，最后显影液孵育后曝光，使用Image J软件分析条带灰度值。

1.4.5 TUNEL检测回肠细胞凋亡情况将石蜡标本切成 4 μm厚，使用前60 ℃烘片60 min，经常规脱蜡复水后，PBS洗3次，每次5 min，滴加1×蛋白酶K 37 ℃孵育 30 min，PBS洗3次，每次5 min，配置TdT酶反应液，避光37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加荧光标记链霉素反应液，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，DAPI染色液复染细胞核，室温避光孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，使用含荧光淬灭剂的封片液封固，200×倒置荧光显微镜下分析凋亡细胞数量，随机选择5个视野计数，取其平均值。

1.4.6 免疫组织化学检测回肠组织Occludin表达情况将石蜡标本切成4 μm厚，使用前60 ℃烘片60 min，经常规脱蜡复水后，体积分数3%过氧化氢室温处理10 min以灭火内源性过氧化物酶，蒸馏水洗5 min，抗原修复：将组织切片置0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)，微波炉加热 5 min，冷却3 min后，重复沸腾5 min，自然冷却至室温。滴加封闭液，室温20 min。甩去多余液体，用稀释液将一抗按1∶250稀释，滴加稀释的一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，2 min/次。滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，2 min/次，滴加链酶亲和素-POD工作液，37 ℃孵育30 min，PBS洗4次，5 min/次。DAB室温显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤终止反应，苏木素轻度复染，自来水冲洗2 min，吹干、封固、镜检、采图。使用Image J软件分析图片染色情况。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠回肠黏膜形态观察及病理损伤评分；②大鼠回肠组织中紧密连接蛋白Claudin-2表达水平；③大鼠回肠组织细胞凋亡情况；④回肠组织Occludin表达情况。

1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 25软件进行统计分析。所有计量资料采用x(_)±s表示。组间比较采用独立样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

慢性脑低灌注在中老年人中是一个常见的病理生理状态，它可以导致认知障碍^[1⁹^]，以往有大量研究阐明脑缺血相关病理生理机制包括线粒体老化和结构紊乱^[2²^-2⁴^]、丝切蛋白棒状结构形成^[2⁵^]，神经血管单元破坏^[2⁶^]，但都局限于大脑实质，很少有对脑外器官的探讨，近些年来，越来越多的研究证实，脑与肠道关系密切^[1¹^，2⁷^]。肠道内居住着大量微生物，高达10万亿，是人体细胞的10倍，肠道菌群不仅能影响体质量和消化，还能影响认知，甚至还能对卒中病兆及预后发挥作用^[1²^，1⁴^，2⁸^-2⁹^]。肠道黏膜屏障在宿主和微生物的相互作用之中起着十分重要的作用，研究发现肠道黏膜屏障完整性破坏导致肠腔内抗原(微生物、毒素)通过黏膜易位，随后破坏了肠黏膜稳态，从而增加了对全身感染，慢性炎症和吸收不良的敏感性^[³⁰^-³¹^]。临床发现，卒中后患者多处于慢性炎症、营养不良状态^[⁹^，3²^-3³^]。另外临床研究发现卒中后感染的致病菌多来自于肠道菌群^[⁸^]。除此之外，临床研究还发现急性缺血性脑卒中患者血清中D-乳酸、脂肪酸结合蛋白升高^[³⁴^]，这标志着肠黏膜通透性升高。这些结果与肠道黏膜屏障受损密不可分。

Claudin-2主要在近端肠段渗透上皮中表达，介导阳离子和水的运输，并阻止大分子物质如抗原的摄取^[3⁵^-3⁶^]，研究发现，其能够诱导紧密连接蛋白形成通道，在肠易激综合征^[3⁷^]、炎症性肠病中^[3⁸^]，不论是大肠还是小肠都发现了Claudin-2上调，引起紧密连接不连续，并能诱导其他紧密连接蛋白下调，如Claudin-3、Occludin，这些都标志着肠黏膜屏障受损^[3⁹^]。同时有研究发现Claudin-2表达降低伴随肠黏膜屏障功能增加的现象^[⁴⁰^]。

Occludin是第一个鉴定的完整膜的紧密连接蛋白，广泛存在于脑、肠的上皮细胞和内皮细胞中^[⁴¹^]，在大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，有研究发现回肠Occludin表达水平降低^[4²^-4⁴^]，而在慢性脑缺血中，此次研究发现回肠Occludin也存在不同程度降低，目前已有的研究发现，缺血性卒中后存在肠道菌群的变化，而肠道菌群及其代谢产物能够影响Occludin蛋白表达^[4⁵^]。另外，有研究发现缺血性卒中后体内白细胞介素17升高^[1⁴^]，而白细胞介素17能够通过干扰紧密连接蛋白的表达，进而损伤肠道黏膜屏障功能^[4⁶^]，而屏障功能损害后又会导致菌群移位、慢性感染、吸收不良等并发症，形成恶性循环。

此次实验发现，慢性脑低灌注状态下，大鼠肠道黏膜屏障紧密连接蛋白Occludin表达降低而Claudin-2表达升高，同时伴有肠道黏膜上皮细胞凋亡比例增加，因此实验推测肠道黏膜屏障功能可能存在一定程度损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

慢性脑低灌注对大鼠回肠黏膜Occludin及Claudin-2表达的影响

Effect of chronic cerebral hypoperfusion on expression of Occludin and Claudin-2 in rat ileum mucosa

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