1.3  数据库、软件及分析平台  见表1。

2.1  牛膝-桑寄生活性成分  通过TCMSP收集得到牛膝-桑寄生的药物活性成分共222个，其中176个来自牛膝，46个来自桑寄生。根据生物利用度≥30%、类药性≥0.18，筛选出牛膝的化合物分子20个，桑寄生2个。除重后得到牛膝-桑寄生药对的活性成分共21个，将21个活性成分归纳见表2。其中靶点数超过10个的有：MOL000098槲皮素(232个)、MOL000422山柰酚(63个)、MOL000173次黄芩素(45个)、MOL000358 β-谷甾醇(38个)、MOL002714黄芩素(37个)、MOL000449豆甾醇(31个)、MOL000785黄藤素(195个)、MOL001454黄连素(17个)、MOL002897表小檗碱(11个)。

2.2  药物治疗骨关节炎潜在靶点筛选结果  TCMSP数据库检索出的牛膝-桑寄生21个活性成分中18个成分可查到相关靶点，共获取相关靶点522个，去除重复项后共预测得到潜在作用靶点218个。通过DisGeNET数据库搜索到骨关节炎靶点基因92个，GENE数据库搜索到骨关节炎相关靶点基因601个，去除重复基因后共得出626个不同骨关节炎靶点基因。绘制牛膝-桑寄生药物靶点与骨关节炎疾病靶点维恩图，见图1，共筛选出48个牛膝-桑寄生药对防治骨关节炎潜在靶点，主要包括雌、雄激素受体、白细胞介素、半胱天冬酶、丝裂原活化蛋白激酶、凋亡调节剂等，48个靶点中在骨关节炎发生发展过程中上调的有27个，下调的有21个，与牛膝有关的靶点48个，与桑寄生有关的靶点36个。

2.3  药物-活性成分-治疗骨关节炎潜在靶点网络构建   将2味药物、可预测到靶点的18个活性成分及预测到的48个治疗骨关节炎潜在交集靶点输入cytoscape 3.6.1软件，绘制药物-活性成分-防治骨关节炎潜在靶点网络，该网络由68个节点和134条边构成，见图2。在该网络中，椭圆形节点表示药物，三角形节点表示活性成分，长方形节点表示治疗骨关节炎潜在靶点，每条边代表靶点之间的作用关系。对网络进行分析发现quercetin(槲皮素)、wogonin(次黄芩素)、kaempferol(山柰酚)、β-sitosterol(β-谷甾醇)的degree值超过10是该网络中自由度较高的化合物成分。

2.4  牛膝-桑寄生防治骨关节炎潜在靶点蛋白互作网络构建  48个靶点中有1个靶点(CHRNA7)与其他靶点无交集，PPI网络由47个节点和485条边构成，见图3。在该网络中，圆形节点表示在骨关节炎中上调的靶点，棱形节点表示在骨关节炎中下调的靶点，每条边代表靶点之间的靶向相互作用关系。对网络进行拓扑学性质分析，Betweenness Centrality表示靶点的中介中心性，值越大表示该节点在网络中的主导性越高，节点Betweenness Centrality值越大节点形状越大。根据分析，可知在该网络中起主导作用的前10个靶点包括：白细胞介素6、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、肿瘤坏死因子、半胱天冬酶3、前列腺素G/H合酶2、丝裂原激活蛋白激酶8、白细胞介素1β、雌激素受体β、磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶、基质金属蛋白酶9，主要与炎症反应、氧化应激及细胞凋亡有关。

2.5  GO富集结果  48个交集靶点通过Omicshare动态GO富集软件进行分析并绘制GO二级分类图展示基因在GO二级分类的基因数量和百分比，见图4。根据P值<0.01，共获取1 970个GO条目，生物过程(biological process)占 1 862个，细胞组分(cellular component)占29个，分子功能(molecular function)占79个。牛膝-桑寄生作用于骨关节炎靶点涉及的生物过程包括对细胞和机体对生物刺激、炎症、细胞因子、激素、有机物和各种化合物的反应及机体对细胞代谢、应激、凋亡的调节等；涉及的分子功能包括核受体、转录因子、蛋白质二聚体、类固醇激素受体活性及蛋白质、酶、RNA、DNA、受体结合等；涉及的细胞组分包括质膜、内膜系统、树突膜等细胞的内外膜结构及线粒体、细胞质、死亡诱导信号复合体、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核转录因子复合体、分泌颗粒等。提示骨关节炎的发病机制及牛膝-桑寄生治疗骨关节炎的机制跟以上富集结果有关。

2.6  KEGG通路富集结果  将48个牛膝-桑寄生治疗骨关节炎的潜在靶点基因导入DAVID数据平台进行KEGG通路富集分析，根据P < 0.01筛选得到108条通路，与CTD数据库检索到的骨关节炎相关信号通路比对，得到76条牛膝-桑寄生治疗骨关节炎的潜在通路。主要包括癌症、晚期糖基化终末产物及其受体、肿瘤坏死因子、白细胞介素17、Toll样受体、核因子κB、细胞凋亡、破骨细胞分化等信号通路。取前20条结果，去掉肿瘤、乙肝、流感等与骨关节炎关系较小的通路后，利用Cytoscape 3.6.1软件绘制信号通路-潜在靶点网络图，见图5，其中椭圆形节点表示治疗骨关节炎潜在靶点，长方形节点表示信号通路。从图5可知，一条KEGG通路往往富集到多个靶点基因，而一个靶点基因同时又可以出现在多条通路中。

骨关节炎是最常见的关节退行性疾病，临床表现以缓慢性关节疼痛、肿大、僵硬伴关节功能障碍为主，由于对骨关节炎病因病机的认识尚未明确，故目前无论是药物治疗还是外科治疗都不能根治此疾病^[1]。传统中医药历史悠久，经过长期的经验积累与临床实践检验，具有疗效确切、安全稳定等优势，逐渐成为许多疑难病治疗与新药开发的研究热点^[2]。临床文献报道显示中药内治法治疗骨关节炎远期疗效确切，但涉及的中药种类与功效繁多，包括补益肝肾药、温阳药、祛风除湿药、舒筋活络药等^[3]。为了探寻临床中医药防治骨关节炎的选方用药规律，有研究者借助中医传承辅助系统对中药治疗骨关节炎的相关文献进行检索提取，从用药频次、组方规律、核心组合及新方分析等方面进行数据挖掘。秦娜等^[4]通过分析平乐郭氏治疗骨关节炎的传统药物运用规律，发现在882首方剂、138种药物中牛膝的使用频率最高(589次)，牛膝-桑寄生也是郭氏治疗骨关节炎常用的药物组合(122次)。吕东富^[5]分析了南京中医药大学附属医院风湿免疫科治疗痹症的处方用药规律，发现牛膝和桑寄生在治疗骨关节炎的218味药物中使用频率排名前5(牛膝52次，桑寄生47次)。高曼^[6]通过检索中文数据库纳入了208首处方进行分析，结果表明牛膝-桑寄生药对是临床治疗膝骨关节炎最常用的药物组合(置信度0.877 55、频次46)，见于独活汤(《证治准绳•女科》)、独活寄生汤(《千金要方》)、舒筋散(《中华人民共和国药典》)、补肾壮膝方等方药中。

网络药理学是在系统生物学、多向药理学、计算生物学等多学科技术基础上，发展出来的研究药物机制的新方法^[7]，其所具有的整体性与系统性特点与中医药不谋而合，为中药复方潜在活性成分与作用靶点的进一步研究开辟了新道路。此次研究基于网络药理学，通过数据挖掘与分析，筛选和系统预测牛膝-桑寄生药对治疗骨关节炎的潜在作用靶点和信号通路，以期为骨关节炎的治疗提供新的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods 

1.1  设计  生物信息学实验。

1.2  时间及地点 于2019年10月至2020年1月在福建中医药大学完成。

1.3  数据库、软件及分析平台  见表1。

1.4  方法

1.4.1  牛膝-桑寄生活性成分收集及作用靶点筛选  通过TCMSP平台^[8]，以“牛膝，桑寄生”为关键词检索2味中药的全部化合物成分，借助TCMSP平台的检索过滤器，以化合物生物利用度≥30%、类药性≥0.18作为活性化合物的筛选条件^[9]，筛选牛膝-桑寄生中具有较高活性的化合物，获取化合物的相关靶点，得到牛膝-桑寄生的潜在作用靶点。

1.4.2  骨关节炎疾病相关靶点的筛选  通过DisGeNET 数据库与GENE数据库以“osteoarthritis”为关键词进行搜索，物种限定为人类，获得骨关节炎的相关靶点。

1.4.3  牛膝-桑寄生药物治疗骨关节炎潜在靶点映射  利用Omicshare云平台作图工具中的维恩图软件筛选牛膝-桑寄生作用靶点中与骨关节炎有关靶点，获得牛膝-桑寄生治疗骨关节炎的潜在靶点，绘制牛膝-桑寄生药物与骨关节炎交集靶点维恩图。

1.4.4  药物-活性成分-治疗骨关节炎潜在靶点作用网络及潜在靶点蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络构建  将药物和所获得药物活性成分及治疗骨关节炎潜在靶点导入cytoscape 3.6.1软件，根据节点性质设置颜色及形状，构建药物-活性成分-治疗骨关节炎潜在靶点网络。将所获得的潜在靶点导入String数据库，选择Multiple protein，限定物种为人，分析得到蛋白相互作用，将node1、node2、Combined score值导入cytoscape 3.6.1软件，并根据Betweenness Centrality值及靶点属性设置节点大小及颜色，构建蛋白互作网络图。

1.4.5  牛膝-桑寄生治疗骨关节炎潜在靶点基因本体论(gene ontology，GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)通路富集分析  通过Ensembl基因组数据库将所得到的牛膝-桑寄生治疗骨关节炎潜在靶点转化为Ensembl ID，利用Omicshare云平台作图工具中的动态GO富集软件分析潜在靶点的GO生物学功能。将潜在靶点输入DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，得到相关分析结果。在CTD数据库上以“osteoarthritis”为关键词检索骨关节炎相关信号通路，与DAVID数据库所富集的通路进行匹配分析，作为牛膝-桑寄生治疗骨关节炎的潜在作用通路。取前20条结果利用cytoscape 3.6.1软件绘制信号通路-潜在靶点网络图。

骨关节炎属于祖国医学“痹证”“骨痹”等范畴，《张氏医通》曰：“经云，膝者，筋之府，屈伸不能，行将偻俯！筋将惫矣。故膝痛未有不因肝肾虚者，虚则风寒湿气袭之”。《素问·痹论》云：“其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为著痹也”。故痹证的基本病机可概括为肝肾亏虚为本，外感风寒湿邪等致病因素而致风寒湿痰瘀痹阻经络为标，形成本虚标实，虚实夹杂的证候^[10]。牛膝归肝、肾经，既能补肝肾、强筋骨，又能活血祛瘀，性善下走，用治下半身腰膝关节酸痛，为其专长。桑寄生归肝、肾经，能祛风湿，舒筋络，治疗风湿痹痛。两药配伍在补益肝肾的同时，兼祛风湿、通血脉而利关节，针对痹证肝肾亏虚为本、风寒湿痰瘀阻络为标的病因病机可达标本兼治之效，独活寄生汤、壮骨健膝方、补肾祛痛方、益肾通络汤等方药中均包含该药对，且报道显示其临床疗效良好^[11-14]。

网络药理学结合了药物分子-疾病-靶点三者之间的关系，能多维度阐明药物以及疾病的分子机制，与中医药整体观和辩证观的理念和中药多成分、多途径的特征有着相似性和契合性。此次研究从网络药理学的策略出发，利用中医药化合物成分与靶点数据库和人类疾病基因数据库筛选出了牛膝-桑寄生药对的21个活性成分及48个防治骨关节炎的潜在靶点，并利用多个生物功能数据库与软件对牛膝-桑寄生作用于骨关节炎的靶点进行了GO和KEGG富集分析。槲皮素、次黄芩素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分和白细胞介素6、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、肿瘤坏死因子、半胱天冬酶3、前列腺素G/H合酶2、丝裂原激活蛋白激酶8、白细胞介素1β、雌激素受体β、磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶、基质金属蛋白酶9等靶点在牛膝-桑寄生治疗骨关节炎潜在靶点网络中起重要作用。其中槲皮素degree值达38，远高于其他化合物，槲皮素是一种黄酮类化合物，存在于多种中药中，具有抗氧化应激、抗炎等多种作用，可以通过减少白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶等细胞因子的生成、影响肿瘤坏死因子、白细胞介素17、核因子κB、细胞凋亡、丝裂原激活蛋白激酶等信号通路，抑制炎症反应和软骨基质降解等方面保护关节软骨^[15]。次黄芩素和山柰酚可以降低白细胞介素1β诱导的骨关节炎软骨细胞模型中环氧化酶2、前列腺素G/H合酶2、诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素6、基质金属蛋白酶13、等细胞因子表达，调控环氧化酶2、丝裂原激活蛋白激酶等信号通路，影响骨关节炎进展^[16-17]。β-谷甾醇具有类激素样作用，可以通过调节下丘脑-垂体-肾上腺素轴系统和抑制白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α和半胱天冬酶1发挥抗炎作用^[18]，同时β-谷甾醇还具有调节骨代谢平衡、抗氧化等作用^[19]。以上研究结果与现代药理研究显示牛膝和桑寄生具有抗炎、镇痛及抗衰老等作用相一致^[20-21]。

KEGG通路分析显示，牛膝-桑寄生可能通过调节晚期糖基化终末产物及其受体晚期糖基化终末产物及其受体、肿瘤坏死因子、白细胞介素17、Toll样受体、核因子κB、细胞凋亡、破骨细胞分化、丝裂原激活蛋白激酶、Nod样受体等信号通路来发挥防治骨关节炎作用。

研究表明，与年龄相关的主要变化之一是晚期糖基化终末产物的积累，这是由于还原糖与蛋白质的自发反应或蛋白质的非酶糖基化作用引起的。它会导致组织的硬度和脆性增加，并降低软骨细胞重构细胞外基质的能力，从而使软骨组织更容易受到机械损伤。糖基化终末产物受体的激活可能导致软骨细胞和滑膜细胞产生更多的金属蛋白酶，进而诱导软骨降解和软骨碎片的释放。晚期糖基化终末产物还会降低基质金属蛋白酶对基质蛋白的水解降解速率，影响蛋白多糖和胶原蛋白的合成^[22]，进一步导致软骨退变。GARG等^[23]的随机双盲对照研究显示出晚期糖基化终末产物抑制剂可减轻骨关节炎患者的疼痛和炎症，并增加其日常活动和出行能力。目前尚无中医药通过抑制该通路影响骨关节炎进展的研究，但有研究表明丹参、吴茱萸、葛根等中药可通过降低晚期糖基化终末产物及其受体信号通路的表达影响与之相关的疾病进展，故中药、晚期糖基化终末产物及其受体信号通路与骨关节炎三者的关系值得进一步探索。

虽然目前骨关节炎的发病机制尚未清晰，但其核心病理变化为关节软骨的不同程度丢失以及关节的炎症反应。研究表明，人体衰老过程中增高的促炎症反应状态、滑膜炎症反应及各种炎症因子构成的复杂调控网络，对骨关节炎的发病以及进展过程具有重要的作用^[24]。关节软骨退变是骨关节炎最早出现和最重要的结构性改变，包括大量软骨细胞凋亡及细胞外基质过度降解。HERAUD等^[25]检测了正常人和骨关节炎患者的关节软骨细胞，结果显示，在正常人只有2%-5%的软骨细胞出现凋亡，而骨关节炎患者中有17%-20%的软骨细胞出现凋亡，软细胞大量减少，也会使其合成软骨基质的能力减弱。因此目前延缓骨关节炎临床进展的治疗方法，大部分是通过抑制炎症反应和软骨细胞凋亡起作用的。KEGG通路分析结果中的肿瘤坏死因子、白细胞介素17、Toll样受体、核因子κB、细胞凋亡、丝裂原激活蛋白激酶等信号通路目前已有大量研究证明它们可以直接或间接调控炎症反应与细胞凋亡，从而影响骨关节炎的进展，且大量防治骨关节炎的中药均对其有调控作用，不再赘述^[26-28]。

综上，此次研究对临床上治疗骨关节炎常用药物组合牛膝-桑寄生进行了网络药理学研究，通过多个中医药物质基础与疾病基因数据库，建立了药物-化合物-疾病交集靶点网络，并对所预测靶点进行GO基因和KEGG通路富集分析，从理论预测、整体分析角度，探讨了牛膝-桑寄生药对治疗骨关节炎的潜在作用机制，为骨关节炎防治提供了新的思路与线索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：#br# 网络药理学：基于系统生物学的理论，对生物系统网络进行分析，从成分-靶点-通路进行整体预测及阐明药物在体内的作用机制。#br# 骨关节炎：是以中年后可动关节的关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，以关节疼痛、活动受限和关节畸形为主要表现，又称退行性关节炎。#br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨关节炎：是以中年后可动关节的关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，以关节疼痛、活动受限和关节畸形为主要表现，又称退行性关节炎。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程