2.1  培养细胞形态学观察  普通显微镜下观察可见，未经成骨诱导刺激的MC3T3-E1细胞成多角形，较短小；经成骨诱导7 d后的MC3T3-E1细胞外形呈长梭形，与周围细胞结合较紧密，经β-蜕皮甾酮处理7 d后的MC3T3-E1细胞具有与诱导刺激后类似的外观，见图1。

2.2.1  MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶染色结果  在经过  1-7 d和10 d诱导分化培养后的MC3T3-E1细胞，早期进行碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶表达量，均显示在诱导后第10天细胞碱性磷酸酶表达较高，见图2。

2.2.2  MC3T3-E1碱性磷酸酶活性检测  通过碱性磷酸酶试剂盒对成骨细胞诱导分化7，10 d的MC3T3-E1细胞中提取的蛋白进行定量检测，以量化出MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞的最适诱导时间，结果证明成骨细胞诱导10 d比诱导7 d的碱性磷酸酶更高；经过成骨诱导后的MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶活力单位明显升高。见表1，图3。

2.2.2  MC3T3-E1碱性磷酸酶活性检测  通过碱性磷酸酶试剂盒对成骨细胞诱导分化7，10 d的MC3T3-E1细胞中提取的蛋白进行定量检测，以量化出MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞的最适诱导时间，结果证明成骨细胞诱导10 d比诱导7 d的碱性磷酸酶更高；经过成骨诱导后的MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶活力单位明显升高。见表1，图3。

2.2.3  MC3T3-E1细胞Ⅰ型胶原蛋白细胞表达  将MC3T3-E1细胞接种于普通培养基和诱导培养基中10 d，进行Ⅰ型胶原蛋白免疫荧光染色检测，结果发现，在诱导分化培养基中接种的细胞染色后可见胞质内含有较多的绿色荧光显色部位，而在普通培养基中接种的细胞染色后胞质内几乎未见到绿色荧光颗粒。见图4。

2.2.4  经诱导后细胞内骨桥蛋白表达  MC3T3-E1细胞经成骨诱导培养14 d后，对其进行免疫细胞化学染色分析，提示细胞内骨桥蛋白明显表达，说明该细胞具有成骨分化的能力，且诱导分化培养基能促进MC3T3-E1细胞骨桥蛋白表达，从而诱导该细胞成骨，见图5。

2.2.5  MC3T3-E1细胞茜素红染色结果  未诱导、成骨诱导相同作用时间及成骨诱导不同作用时间处理后的MC3T3-E1细胞中茜素红染色显示钙结节形成程度有显著区别。成骨诱导细胞较未诱导细胞中钙结节数量明显增加，诱导28 d的较诱导21 d的细胞钙结节形成数量及大小更显著，说明该细胞具有骨化能力，诱导分化培养基具有促骨化能力，均可用于后续实验。见图6。

2.3  β-蜕皮甾酮对MC3T3-E1细胞的安全剂量测定  CCK8法测得浓度在0.01-100 μmol/L范围内的β-蜕皮甾酮对MC3T3-E1细胞均有促进增殖的作用。结果显示相对于对照组(未加入β-蜕皮甾酮)，β-蜕皮甾酮加药后第5，6，7天可见相同浓度无明显差异，而相同时间内药物浓度为0.01，0.1 μmol/L时细胞活性均最高，且无明显差异性，见表2，图7。后续实验均采取0.1 μmol/L为安全剂量。

2.3  β-蜕皮甾酮对MC3T3-E1细胞的安全剂量测定  CCK8法测得浓度在0.01-100 μmol/L范围内的β-蜕皮甾酮对MC3T3-E1细胞均有促进增殖的作用。结果显示相对于对照组(未加入β-蜕皮甾酮)，β-蜕皮甾酮加药后第5，6，7天可见相同浓度无明显差异，而相同时间内药物浓度为0.01，0.1 μmol/L时细胞活性均最高，且无明显差异性，见表2，图7。后续实验均采取0.1 μmol/L为安全剂量。

2.4.1  MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶表达  对照组未加入β-蜕皮甾酮，培养7 d后的细胞中可见明显碱性磷酸酶表达，培养10 d后的细胞中碱性磷酸酶表达较7 d增强，但明显较10 d实验组弱；实验组加入β-蜕皮甾酮，培养7 d后的细胞碱性磷酸酶表达进一步增加，培养10 d后的细胞中碱性磷酸酶表达较对照组以及7 d实验组明显增强。提示   β-蜕皮甾酮作用7 d和10 d后碱性磷酸酶定性及定量结果均增加。见图8，9，表3。

2.4.1  MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶表达  对照组未加入β-蜕皮甾酮，培养7 d后的细胞中可见明显碱性磷酸酶表达，培养10 d后的细胞中碱性磷酸酶表达较7 d增强，但明显较10 d实验组弱；实验组加入β-蜕皮甾酮，培养7 d后的细胞碱性磷酸酶表达进一步增加，培养10 d后的细胞中碱性磷酸酶表达较对照组以及7 d实验组明显增强。提示   β-蜕皮甾酮作用7 d和10 d后碱性磷酸酶定性及定量结果均增加。见图8，9，表3。

2.4.1  MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶表达  对照组未加入β-蜕皮甾酮，培养7 d后的细胞中可见明显碱性磷酸酶表达，培养10 d后的细胞中碱性磷酸酶表达较7 d增强，但明显较10 d实验组弱；实验组加入β-蜕皮甾酮，培养7 d后的细胞碱性磷酸酶表达进一步增加，培养10 d后的细胞中碱性磷酸酶表达较对照组以及7 d实验组明显增强。提示   β-蜕皮甾酮作用7 d和10 d后碱性磷酸酶定性及定量结果均增加。见图8，9，表3。

2.4.2  MC3T3-E1细胞中Ⅰ型胶原蛋白表达  在终浓度为0.1 μmol/L的β-蜕皮甾酮培养10 d后，实验组MC3T3-E1细胞中Ⅰ型胶原蛋白荧光定性表达较对照组增加，见图10。

2.4.3  MC3T3-E1细胞中骨桥蛋白、骨钙蛋白表达  细胞爬片定性也显示β-蜕皮甾酮能增加MC3T3-E1细胞中骨桥蛋白、骨钙蛋白表达。普通诱导培养基诱导14 d后的细胞，经免疫组织化学染色后，细胞核为蓝色，核周棕黄色部位即表示有骨桥蛋白和骨钙蛋白表达，但颜色深度较浅；在终浓度为0.1 μmol/L的β-蜕皮甾酮培养14 d，经免疫组织化学染色后，细胞骨桥蛋白以及骨钙蛋白有明显表达，颜色较深。见图11。

2.4.4  MC3T3-E1细胞的矿化能力  经0.1 μmol/L β-蜕皮甾酮培养后的MC3T3-E1细胞矿化能力与未加β-蜕皮甾酮的对照组比无明显改变。对照组诱导28 d后可见细胞中钙结节形成较多，矿化能力较强；在0.1 μmol/L β-蜕皮甾酮组培养28 d进行茜素红染色，显示培养皿内钙结节形成情况也较浓，矿化能力较强，但与对照组相比无明显差异性。见图12。

人骨髓间充质干细胞是多能干细胞，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞和其他类型的中胚层细胞^[1-3]。据推测，随着年龄的增长骨髓间充质干细胞倾向于分化成脂肪细胞而不是成骨细胞，这可能是骨折术后不愈合、骨质疏松症的主要原因^[4-5]。雌激素在维持骨量方面起着重要作用，它通过刺激雌激素受体能诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化，这对骨质疏松症治疗有极其重要的意义^[6]。许多更年期女性有严重且快速的骨质流失，可以通过预防或雌激素替代逆转。尽管雌激素替代疗法一直是治疗骨质疏松症的主要疗法，但对其安全性仍存在许多担忧，例如，它可能会增加患心血管疾病和乳腺癌的风险^[7]。

在过去几年中，β-蜕皮甾酮已被作为雌激素的替代品受到关注。β-蜕皮甾酮是几种中草药的主要成分，如牛膝和露水草等，其具有多种活性，包括刺激蛋白质合成、促进碳水化合物和脂质代谢、缓解高血糖和高脂血症、增强免疫调节以及保护内皮细胞免于凋亡和诱导其增殖^[8]。OTAKA等^[9]报道蜕皮甾酮无论在体内实验还是体外实验中均可迅速刺激大鼠肝脏蛋白的合成；而且还能调节mRNA的合成速度^[10]。YOSHIDA等^[11]报道正常小鼠腹腔注射蜕皮甾酮对血糖水平无影响，而预先腹腔注射0.5 mg/kg蜕皮甾酮却能对抗腹腔注射胰高血糖素0.2 mg/kg及静脉注射抗胰岛素血清100 mg/kg引起的高血糖症。另外，日本科学家松田弘幸等^[12]通过给家兔口服蜕皮甾酮发现其可有效抑制高胆固醇喂养引起的血脂水平升高。此外，还有研究表明蜕皮甾酮可通过抑制抗IE诱导途径降低大鼠腹腔肥大细胞释放组胺，从而进行免疫调节^[13]。但是β-蜕皮甾酮对骨骼类的研究很少，鉴于β-蜕皮甾酮具有类似雌激素的类固醇骨架，因此，推测β-蜕皮甾酮可能具有与雌激素类似的活性。相关研究报道，β-蜕皮甾酮在治疗骨质疏松症^[14-17]、骨折和其他骨骼炎症性疾病方面有着重要的作用^[18-19]。

此次实验使用小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1，此细胞克隆来源于C57BL/6小鼠颅骨，重复传代培养能维持成骨细胞表型，具有高度碱性磷酸酶活性，在体外可以分化为成骨细胞和骨细胞，形成钙化骨组织和羟基磷灰石矿物沉淀^[20]。该细胞系已被证明是探索成骨细胞增殖、成熟和分化的可行模型^[21]，是研究药物对骨细胞影响较常用的细胞系。研究验证β-蜕皮甾酮是否能促进MC3T3-E1细胞的增殖，β-蜕皮甾酮能否提高MC3T3-E1细胞成骨分化能力，为天然植物类药物在骨损伤性疾病中的应用提供借鉴。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验观察。

1.2  时间及地点  实验于2019年3月至12月在川北医学院影像学研究所完成。

1.3  材料  小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1细胞株(普诺赛，中国)；β-蜕皮甾酮(源叶，中国上海)；细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；0.25%胰蛋白酶、培养细胞总蛋白抽提试剂、SABC-FITC免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒、PBS(博士德，中国武汉)；倒置显微镜(徕卡，德国)；MC3T3-E1细胞诱导分化培养基(赛业，中国广州)；碱性磷酸酶染色液、40 g/L多聚甲醛、茜素红S染色液(0.2%)(索莱宝，中国北京)；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天，中国)；细胞培养皿(康宁，美国)；二甲基亚砜(Sigma，美国)；酶标仪(bio-rad，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  MC3T3-E1细胞培养  收到MC3T3-E1细胞后，取出25 cm²培养瓶，用体积分数75%乙醇擦拭，拆下封口膜，放入细胞培养箱(37 ℃，体积分数5%CO₂)中静置2.0-3.0 h以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养基继续培养。

细胞传代：细胞生长至覆盖培养瓶的90%面积时，弃25 cm²培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞1次；添加0.25%胰蛋白酶消化液约1 mL至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min；弃上清，沉淀细胞用12 mL完全培养基重悬，然后按1∶2比例进行分瓶传代，最后放入细胞培养箱中培养。取传至第4代细胞进行以下实验。

1.4.2  药物的配制  将β-蜕皮甾酮20 mg常温下溶于400 μL二甲基亚砜中，反复吹打至完全溶解，得到     1×10⁵ μmol/L β-蜕皮甾酮。依次稀释得到1 μmol/L-  1×10⁴ μmol/L的β-蜕皮甾酮，存放于-20 ℃冰箱内备用，此方法可保存2周。经过长时间观察，溶液中不会有β-蜕皮甾酮沉淀析出。实验时取1-1×10⁴ μmol/L 5种浓度的β-蜕皮甾酮溶液至100 μL培养基中得出终浓度为0.01，0.1，1，10，100 μmol/L的含β-蜕皮甾酮培养基。

1.4.3  MC3T3-E1细胞成骨鉴定  实验分为成骨细胞诱导组和未诱导组，通过观察4个成骨标志蛋白：碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白及骨钙蛋白的定性表达鉴定MC3T3-E1细胞的成骨能力。分别采取碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶活性检测对比诱导前后和是否加药对MC3T3-E1细胞中的碱性磷酸酶表达的影响；通过免疫荧光和免疫细胞化学染色的方法检测细胞中Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达量；茜素红S染色观察MC3T3-E1细胞成骨钙化的情况。

(1)碱性磷酸酶染色：分别将MC3T3-E1细胞以15 000/孔接种至6孔板中。培养1，2，3，4，5，6，7，10 d后，弃去细胞培养基，用PBS清洗2次，加入碱性磷酸酶固定液，15 min后弃去固定液，PBS再次清洗3次，每次3 min，加入事先按(B1液：B2液)1∶1配置好的碱性磷酸酶孵育液，37 ℃避光孵育30 min，弃液后PBS清洗3次，倒置显微镜下观察染色结果并拍照。

(2)碱性磷酸酶活性检测：用移液枪小心吸去培养液，加入适量预冷的PBS清洗，按照400 μL/孔加入细胞裂解液，4 ℃孵育30 min后，轻轻刮下裂解细胞，并将裂解液转入1.5 m LEP管中，以10 000×g离心10 min，取上清液即为蛋白提取物。按照碱性磷酸酶检测试剂盒使用说明设置空白对照组、标准品组和样品组，依次加入显色底物、样品以及标准工作液，37 ℃孵育10 min，每孔加入100 μL反应终止液，利用酶标仪在405 nm测定吸光度。绘制标准曲线并根据酶活力单位定义计算出酶活力单位。

(3)免疫荧光染色：将MC3T3-E1细胞以20 000/孔接种于6孔板中，培养10，14 d后，弃去培养液，加入适量40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，5 min/次，体积分数3%双氧水灭活10 min，枸橼酸盐缓冲液60 ℃水浴30 min，滴加稀释的正常血清封闭液(稀释比1∶10)室温20 min，甩干，滴加I型胶原蛋白一抗，4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次，滴加荧光标记的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗后荧光显微镜观察并拍照。

(4)免疫细胞化学染色：将MC3T3-E1细胞以15 000/孔接种于6孔板中，培养14 d后，弃去培养液，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS清洗，体积分数3%双氧水灭活10 min，枸橼酸盐缓冲液60 ℃水浴30 min，5%BSA封闭液37 ℃孵育30 min后甩干，分别滴加骨桥蛋白或骨钙蛋白一抗，4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次，滴加普通山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，滴加SABC后继续37 ℃孵育   30 min，采用DAB试剂盒(1 mL蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴)显色，苏木精复染后显微镜观察并拍照。

(5)茜素红染色：取第4代MC3T3-E1细胞复苏后以 15 000/孔接种于6孔板中，分别培养21，28 d后，移除培养皿中的培养基，PBS清洗2次，用40 g/L多聚甲醛固定10-15 min，弃去固定液，ddH₂O清洗3次，将水吸净后加入茜素红S染色液，染色30 min，弃去染料，再用ddH₂O清洗3-5次后在大体及显微镜下观察。

1.4.4  CCK8法检测β-蜕皮甾酮对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响  取7个96孔板，将96孔板划分为空白组、实验组和对照组，分别为：100 μL培养基(无细胞)+1 μL PBS；100 μL细胞混悬液+1 μL β-蜕皮甾酮溶液(浓度分别为0.01，0.1，1，10，100 μmol/L)；100 μL细胞混悬液+1 μL PBS。选取第4代对数期MC3T3-E1细胞，以5 000/孔的细胞接种于96孔板中，每组分别设置6个复孔，于体积分数5%CO₂、37 ℃培养24，48，72，96，120，144，168 h。更换新鲜普通培养基后，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育1 h，用酶标仪在450 nm测定吸光度。根据公式：细胞存活率=[(实验孔-空白孔)]/[(对照孔-空白孔)]×100%，计算细胞存活率。

1.4.5  β-蜕皮甾酮对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用  设定空白组为含体积分数10%胎牛血清的基础培养基组，对照组为成骨诱导分化培养基组，实验组为诱导分化培养基+0.1 μmol/L β-蜕皮甾酮组。通过检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白及骨钙蛋白指标观察β-蜕皮甾酮对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用，检测方法同上。

1.5  主要观察指标  ①培养细胞形态学观察；②碱性磷酸酶表达及活性；③Ⅰ型胶原蛋白细胞免疫荧光染色；④MC3T3-E1细胞茜素红染色结果；⑤β-蜕皮甾酮作用后MC3T3-E1细胞的增殖活性；⑥β-蜕皮甾酮作用的MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白表达。

1.6  统计学分析  用SPSS 19.0统计软件处理实验数据，实验中计量数据(包括碱性磷酸酶活性检测、CCK8、蛋白相对表达量)均采取x(_)±s形式表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采取q检验。检验水准α值取0.05。

在MC3T3-E1细胞成骨化过程中，碱性磷酸酶是成骨化的特异性因子^[22]，可调节骨形态发生^[23]。碱性磷酸酶的激活在细胞外基质形成的早期阶段以高水平发生，但随着时间的推移而降低^[24]。此次实验结果表明在培养细胞到第7-10天时，实验组碱性磷酸酶活性高于对照组(P < 0.05)；说明β-蜕皮甾酮能够增强体外成骨细胞的碱性磷酸酶活性。骨钙蛋白的生理功能是保持骨的正常矿化，调节羟基磷灰石结晶的形成和增长，是成骨细胞分化的中期敏感标志物^[25]。此次实验结果表明，实验组骨钙蛋白水平显著高于对照组(P < 0.05)，由此可知，β-蜕皮甾酮可促进MC3T3-E1细胞的中期分化。

此外在实验后期，茜素红S染色观察到明显的钙结节形成和矿化。因小鼠MC3T3-E1细胞属于小鼠成骨细胞的早期细胞或者成骨前体细胞，在常规培养早期不会出现较为明显或者大体可见的大块红色沉淀(钙结节染色阳性结果表现)，故选择培养21 d和28 d细胞标本进行观察，结果显示实验组与对照组之间的钙结节矿化水平无明显差异。因此，如果将β-蜕皮甾酮用于治疗骨折，骨缺损等疾病，可以促进局部引导骨再生期间较早的钙化结节形成，提高一般骨生成过程的效率。

骨桥蛋白是存在于矿化和活性沉积区，是一种含有Arg-Gly-Asp(RGD)结构的酸性糖蛋白，它与诱导成骨细胞成熟表型表达和矿化骨基质形成的活性蛋白密切相关。在成矿阶段，骨连接素、纤连蛋白与骨桥蛋白的表达高度相关^[26]。Ⅰ型胶原是钙盐沉积和细胞附着的支架，可促进细胞附着并刺激细胞分化^[27]。实验采用含有不同浓度β-蜕皮甾酮的培养基诱导MC3T3-E1细胞14 d，发现随着β-蜕皮甾酮浓度的增加，MC3T3-E1细胞培养物中的骨钙蛋白、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白表达水平逐渐增加，实验组所有成骨细胞标志物的量均高于对照组，说明在成骨矿化期，β-蜕皮甾酮可促进成骨细胞相关基因表达，更有利于新骨组织的矿化，以利于新骨的形成。

有学者指出在Ⅰ型胶原、骨钙蛋白及骨桥蛋白等成骨细胞相关基因的启动子区都有成骨细胞特异性顺式作用元件2(Osteoblast-specific cis-acting element2，OSE2)样元 件^[28]，Runx2能与这些OSE2样元件结合激活这些基因表达。众所周知，BMP-SMAD、Wnt/β-Catenin、Notch、Hedgehog、MAPK、FGF信号通路在成骨分化过程中最为关键，BMP-2/Smads/Runx2/OSE2信号转导通路是经典的成骨信号通路。其具体机制为骨形态发生蛋白2通过结合靶细胞表面2种丝氨酸/苏氨酸激酶受体(BMPR-I，BMPR-II)向胞内传递信号^[28]，骨形态发生蛋白2与持续表现激酶活性的BMPR-II结合后，BMPR-I能够特异性与此二聚体结合而发生自身磷酸化。骨形态发生蛋白诱导信号受 R-Smads (Smad1、Smad5、Smad8)和Co-Smads(Smad4)调节，BMPR-I通过磷酸化Smadl、Smad5或Smad8使其活化，被激活的Smad1、Smad5或Smad8结合Smad4进入胞核，调节特定基因转录的功能。Smads蛋白作为共调节子和Runx2相互作用共同参与成骨细胞表型基因表达和分化。Runx2可以和骨钙蛋白启动子区的OSE2相结合刺激骨钙蛋白的表达，Runx2还能与Smads蛋白共同调节成骨细胞胶原的表达。

β-蜕皮甾酮属于昆虫生长代谢调节激素，最早为昆虫学家所研究，但随后人们发现蜕皮激素在植物界的分布不仅较动物界高，而且遍布广、资源丰富，如国产的牛膝、川牛膝、桑叶、白毛夏枯草、露水草等均含有其类似物。近30年来，不少学者致力于对β-蜕皮甾酮化学结构以及药理活性的研究，β-蜕皮甾酮具有与人体雌激素类似的化学结构式，又被称作“植物雌激素”，其生理作用方面也有诸多相似之处，其中包括诱导成骨细胞分化^[18，29]、抗骨质疏松^[14，17]、抑制糖皮质激素导致的成骨细胞凋亡与自噬^[15-16]、抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡和炎症反应等^[19]。此次实验利用CCK8法测得β-蜕皮甾酮在0.01-100 μmol/L均能不同程度的促进MC3T3-E1细胞增殖，当药物作用至第5天后达到峰值并逐渐趋于稳定，其中以0.01，0.1 µmol/L最明显；此外，发现在0.1 µmol/L浓度下，β-蜕皮甾酮能有效增加Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白和骨钙蛋白表达及碱性磷酸酶活性。即通过实验证明β-蜕皮甾酮不仅能够促进MC3T3-E1细胞增殖，而且在安全剂量下能有效诱导MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化。

      复习近年来相关文献报道，JIAN等^[29]在一项实验研究中指出，与对照组相比β-蜕皮甾酮能显著提高牙周膜干细胞细胞中骨形态发生蛋白2、RUNX2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素基因的表达，并下调骨形态发生蛋白3 mRNA表达，作者还提供了β-蜕皮甾酮激活ERK1/2MAP激酶但不激活p38 MAP激酶或JNK的证据。从而表明β-蜕皮甾酮通过ERK途径诱导骨形态发生蛋白2表达和成骨分化。GAO等^[14]也证实了β-蜕皮甾酮以雌激素受体依赖性方式诱导间充质干细胞的体外成骨分化，并减轻了小鼠模型的骨质疏松程度。由此推测β-蜕皮甾酮诱导MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化机制可能与BMP-2/Smads/Runx2/ OSE2 信号通路有关。但是在一项利用含雌激素受体的猪子宫细胞质提取物测试β-蜕皮甾酮与雌激素受体的结合能力的实验中，β-蜕皮甾酮未能激活雌激素受体，作者由此认为β-蜕皮甾酮不会通过激活雌激素受体达到促进成骨分化的作用^[30-31]。此外，TANG等^[16]认为β-蜕皮甾酮可诱导成骨细胞的分化，其作用取决于mTOR信号通路的失活。综上所述，显然需要更多的研究阐明β-蜕皮甾酮的促成骨分化作用机制。

此次实验隶属于探究β-蜕皮甾酮促成骨细胞分化的作用及其机制研究课题，现就β-蜕皮甾酮促MC3T3-E1细胞成骨分化的现象结果作一报告。未来将在后续实验中探索β-蜕皮甾酮能提高MC3T3-E1细胞分化能力的最佳时间-浓度梯度，同时重点探讨β-蜕皮甾酮诱导MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化与BMP-2/Smads /Runx2/OSE2信号通路的关系。

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文题释义：

β-蜕皮甾酮：又称蜕皮激素、20-羟基蜕皮甾酮，分子式C₂₇H₄₄O₇，为黄棕色至白色粉末，味苦；主要存在于昆虫、蚕、露水草、牛膝、川牛膝等动植物体内，具有调节血糖血脂、促进胶原蛋白合成、抗疲劳、促进细胞生长和刺激真皮细胞分裂等作用，目前广泛应用于化妆品、医疗以及养殖业等领域。

骨形态发生蛋白质2：是从脊椎动物骨骼基质中分离提纯的蛋白质，具有内肽酶活性、表皮生长因子模体，同源二聚体之间以二硫键相连，属于转化生长因子β家族，能诱导骨与软骨形成。

骨桥蛋白：存在于矿化和活性沉积区，是一种含有Arg-Gly-Asp(RGD)结构的酸性糖蛋白，它与诱导成骨细胞成熟表型表达和矿化骨基质形成的活性蛋白密切相关。在成矿阶段，骨连接素、纤连蛋白与骨桥蛋白的表达高度相关。Ⅰ型胶原是钙盐沉积和细胞附着的支架，可促进细胞附着并刺激细胞分化。

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骨形态发生蛋白质2是从脊椎动物骨骼基质中分离提纯的蛋白质，具有内肽酶活性、表皮生长因子模体，同源二聚体之间以二硫键相连，属于转化生长因子-β家族，能诱导骨与软骨形成。

骨桥蛋白是存在于矿化和活性沉积区，是一种含有Arg-Gly-Asp(RGD)结构的酸性糖蛋白，它与诱导成骨细胞成熟表型表达和矿化骨基质形成的活性蛋白密切相关。在成矿阶段，骨连接素、纤连蛋白与骨桥蛋白的表达高度相关。Ⅰ型胶原是钙盐沉积和细胞附着的支架，可促进细胞附着并刺激细胞分化。

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