1.3.3  试剂和仪器  Bio-Gide胶原膜介绍见表1；伊红液、苏木精、40 g/L多聚甲醛、乙二胺四乙酸(Sigma公司，美国)；RevertAid Reverse Transcriptase(Thermo公司)；RNA提取试剂盒、SYBR Green Real time PCR Master Mix(TAKARA，日本)；定制6孔不锈钢钢板、1.5 mm螺钉、KJ-I微型电动摆锯、电钻(张家港保康医疗器械有限公司)；DR拍片机(柯达DR7500，日本)；CFX96 Touch Deep Well定量PCR仪(Bio-Rad公司)。

1.3.4  定量PCR引物  运用美国ABI Primer Express 3.0软件设计，由Invitrogen公司合成，见表2。

(3)除外空白组，其余各组将自体骨骨粒植入骨缺损区，Bio-Gide 胶原膜植入骨缺损区，包绕至完全覆盖，见图1，强生4-0 Vicryl可吸收缝线仔细缝合，生理盐水冲洗术区，用4-0号丝线缝线依次缝合深筋膜、浅筋膜，1-0丝线缝合皮肤。空白组截骨后仅固定。

1.4.4  X射线影像学检查  术后第12周予3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，X射线检查观察成骨情况。按Lane-Sandhu X射线评分标准从骨形成、骨连接、骨塑形3个方面评估骨重建情况^[21-22]，见表3。

1.4.5  组织切片苏木精-伊红染色及Masson染色  在术

后第12周解剖、游离手术侧股标本，尽量保留骨膜，将股骨标本置于40 g/L多聚甲醛溶液固定48 h，3%硝酸溶液脱钙1-4周，至能容易地插入5号注射器针头为止。纵向石蜡包埋，4 μm连续切片，经苏木精-伊红染色及Masson染色后制作病理切片观察骨缺损部位的病理组织愈合和骨重建相关情况，按Huddleston组织学评分标准从纤维组织、软骨组织、编织骨组织、成熟骨组织等组织形态方面综合评估骨重建水平^[23]，见表4。

2.2  X射线影像学检查  术后第12周，X射线检查可见补肾高剂量组天然骨与自体移植骨连接处有新生骨组织及大量骨痂生成，连接截骨端，植骨区域呈现形状不规则的高密度影，骨小梁规则且厚实，骨折线消失，骨缺损部位无明显萎缩，愈合良好；补肾中剂量组骨痂骨质较多，骨小梁较整齐，骨折线不明显；补肾法低剂量组、骨肽片组及引导骨再生组中仅有少量骨痂生成，天然骨与自体移植骨连续性较差，截骨线依稀可见；而空白组截骨线清晰可见，骨缺损部位明显萎缩，愈合不良。除外空白组，其余各组均有不同程度成骨，Lane-Sandhu X射线评分与空白组差异有非常显著性意义(P < 0.001)。其中补肾高剂量组及补肾中剂量组截骨线完全消失，皮质重建良好，骨组织无明显吸收且成骨效能高，Lane-Sandhu X射线评分明显优于引导骨再生组(P < 0.01)，见图2及表5。

2.2  X射线影像学检查  术后第12周，X射线检查可见补肾高剂量组天然骨与自体移植骨连接处有新生骨组织及大量骨痂生成，连接截骨端，植骨区域呈现形状不规则的高密度影，骨小梁规则且厚实，骨折线消失，骨缺损部位无明显萎缩，愈合良好；补肾中剂量组骨痂骨质较多，骨小梁较整齐，骨折线不明显；补肾法低剂量组、骨肽片组及引导骨再生组中仅有少量骨痂生成，天然骨与自体移植骨连续性较差，截骨线依稀可见；而空白组截骨线清晰可见，骨缺损部位明显萎缩，愈合不良。除外空白组，其余各组均有不同程度成骨，Lane-Sandhu X射线评分与空白组差异有非常显著性意义(P < 0.001)。其中补肾高剂量组及补肾中剂量组截骨线完全消失，皮质重建良好，骨组织无明显吸收且成骨效能高，Lane-Sandhu X射线评分明显优于引导骨再生组(P < 0.01)，见图2及表5。

2.3  骨组织切片苏木精-伊红染色及Masson染色  在补肾高剂量组中，天然骨与自体移植骨连接处可见新生骨组织，新生骨周围成骨细胞核较大，排列整齐，可见血管形成及较密集的骨小梁，成骨效能佳；补肾中剂量组组骨小梁分布较密集、均匀，无明显断裂，可见少量新生骨组织及矿化现象；补肾低剂量组骨小梁稀疏且菲薄，结构纤细，形态幼稚；骨肽片组骨小梁密度较低，可见少量新生骨组织；引导骨再生组骨折端骨小梁密度低，且有部分连续性中断；空白组细胞成分复杂，骨小梁生成少，且间隙内可见纤维组织及软组织。除外空白组，其余各组均有不同程度成骨，Huddleston组织学评分与空白组差异有显著性意义(P < 0.001)。其中补肾高剂量组及补肾中剂量组可见密集分布的骨小梁及新生骨组织，Huddleston组织学评分明显优于引导骨再生组(P < 0.01)，见图3，4。

2.4  骨组织中碱性磷酸酶、核心结合因子2、血管内皮生长因子及骨形态发生蛋白2 mRNA表达  RT-PCR法检测结果显示，除外空白组，其余各组对骨组织中碱性磷酸酶、核心结合因子2、血管内皮生长因子及骨形态发生蛋白2 mRNA表达均有不同程度的上调作用，且在补肾高剂量组、补肾中剂量组及骨肽片组作用更为明显，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，其中补肾高剂量组及补肾中剂量与引导骨再生组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，其作用在0.054-0.216 g/(kg?d)之间存在一定的量效关系，见图5及表6。

近年来，国内各种高能量创伤、感染、骨肿瘤的发病率有逐渐升高的趋势，由各种原因导致的骨缺损也逐渐增多，这不仅严重影响患者生存质量，而且造成了严重的经济和社会负担^[1]。骨缺损的治疗方法较多，如骨移植、Masquelet技术、Ilizarov技术等。但骨移植技术存在材料来源受限、骨缺损区位点吸收萎缩等问题和风险^[2-3]；Masquelet技术面临治疗周期过长、新生骨成骨质量不佳且需要第二次手术等问题^[4-6]；Ilizarov技术则存在牵张、骨矿化时间长，钉道感染及延长部位再骨折等风险^[7-8]。

     引导骨再生技术(guided bone regeneration, GBR)是NYMAN和KARRING在20世纪80年代早期发现了一种骨缺损愈合的生物学方法^[9]，最早应用于口腔科修复牙槽骨缺损。引导骨再生技术通过将生物膜固定在软组织和骨缺损之间，利用生物膜屏障阻止生长速度更快的上皮细胞和成纤维细胞长入，创造出骨组织优势生长的环境^[10]，成骨细胞优先进入骨缺损，无竞争生长。在配合骨缺损处的骨移植时，生物膜还能防止植入物泄漏，协助创口封闭^[11]。并且引导骨再生技术多只需一次手术，能有效缩短治疗时间、减轻患者痛苦，是目前公认的安全、有效、可靠的骨增量技术^[12-13]。引导骨再生技术虽然已广泛运用于口腔医学领域^[14-16]，但其在长骨骨干骨缺损中的研究报道很少。《黄帝内经》曰：“肾为先天之本，主骨生髓”，“肾主骨”理论在中医骨伤临床实践发挥了重要的指导作用^[17-18]。此次研究旨在探究引导骨再生技术结合中药补肾治疗对大

鼠股骨骨缺损修复的影响，加深对中医补肾法的认识，为临床应用提供一定的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2018年2至9月在广州中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心完成。

1.3  材料

1.3.1 实验动物  SPF级SD雄性大鼠36只，体质量280-320 g，购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤) 2013-0034]。饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级实验动物中心[SYXK(粤)2013-0092]，已经通过动物实验伦理委员会批准(编号：TCMF1-2018002)。

1.3.2  实验药物  补肾中药选用强骨胶囊(北京岐黄制药有限公司生产)，主要有效成分为骨碎补总黄酮，   0.25 g/粒。西药选用骨肽片(安徽宏业药业有限公司)，规格：40 mg/片。

1.3.3  试剂和仪器  Bio-Gide胶原膜介绍见表1；伊红液、苏木精、40 g/L多聚甲醛、乙二胺四乙酸(Sigma公司，美国)；RevertAid Reverse Transcriptase(Thermo公司)；RNA提取试剂盒、SYBR Green Real time PCR Master Mix(TAKARA，日本)；定制6孔不锈钢钢板、1.5 mm螺钉、KJ-I微型电动摆锯、电钻(张家港保康医疗器械有限公司)；DR拍片机(柯达DR7500，日本)；CFX96 Touch Deep Well定量PCR仪(Bio-Rad公司)。

1.3.4  定量PCR引物  运用美国ABI Primer Express 3.0软件设计，由Invitrogen公司合成，见表2。

1.4  方法

1.4.1  分组  将36只雄性SD大鼠随机分为6组：空白组、引导骨再生组、补肾高剂量组、补肾中剂量组、补肾低剂量组、骨肽片组，每组6只。

1.4.2  大鼠骨缺损模型建立及引导骨再生治疗  建立大鼠股骨骨缺损模型，空白组截骨后仅用微钢板固定，其余各组均采用引导骨再生技术植入自体骨及Bio-Gide胶原膜治疗，具体操作如下：

(1)所有大鼠术前禁食禁饮12 h，3%戊巴比妥钠   (1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，除外空白组，其余各组均截取大鼠尾部远端3节尾骨，剔除软组织后制作自体骨骨粒，浸泡于无菌生理盐水中备用。

(2)每只大鼠右下肢备皮，体积分数75%乙醇消毒。沿右侧大腿外侧依次切开皮肤、浅筋膜，钝性劈开阔筋膜张肌，于股外侧肌和股二头肌肌间隙将2组肌肉向两侧牵开，显露股骨至大转子水平。于股骨干中部外侧置入1枚6孔、1.5 mm不锈钢微型接骨板，于接骨板远近两端各拧入2枚1.5 mm皮质骨螺钉，将接骨板固定于股骨干外侧。采用线锯于股骨干中部截骨，截取约10 mm长骨缺损区。

(3)除外空白组，其余各组将自体骨骨粒植入骨缺损区，Bio-Gide 胶原膜植入骨缺损区，包绕至完全覆盖，见图1，强生4-0 Vicryl可吸收缝线仔细缝合，生理盐水冲洗术区，用4-0号丝线缝线依次缝合深筋膜、浅筋膜，1-0丝线缝合皮肤。空白组截骨后仅固定。

(4)术后每只大鼠术后连续3 d肌注青霉素5×10⁴ U/d预防感染。术后完全负重活动，单笼饲养至皮肤切口愈合。

1.4.3  给药  空白组截骨后仅用微钢板固定，术后每日予

等量生理盐水灌胃；引导骨再生组行引导骨再生治疗后，术后每日予等量生理盐水灌胃；补肾各剂量组于引导骨再生术后第1天开始分别予0.216，0.108，0.054 g/(kg•d)的强骨胶囊灌胃治疗，持续8周；骨肽片组术后给予引导骨再生组同等治疗，并于术后第1天开始予以0.58 mg/(kg•d)骨肽片灌胃治疗，持续8周。

1.4.4  X射线影像学检查  术后第12周予3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，X射线检查观察成骨情况。按Lane-Sandhu X射线评分标准从骨形成、骨连接、骨塑形3个方面评估骨重建情况^[21-22]，见表3。

1.4.5  组织切片苏木精-伊红染色及Masson染色  在术后第12周解剖、游离手术侧股标本，尽量保留骨膜，将股骨标本置于40 g/L多聚甲醛溶液固定48 h，3%硝酸溶液脱钙1-4周，至能容易地插入5号注射器针头为止。纵向石蜡包埋，4 μm连续切片，经苏木精-伊红染色及Masson染色后制作病理切片观察骨缺损部位的病理组织愈合和骨重建相关情况，按Huddleston组织学评分标准从纤维组织、软骨组织、编织骨组织、成熟骨组织等组织形态方面综合评估骨重建水平^[23]，见表4。

     引导骨再生技术是目前研究最多、应用最广泛的骨缺损修复方法之一^[24]。Bio-Gide胶原膜是目前运用极为广泛的一种膜屏障，是一种接近人类胶原结构的猪胶原膜的天然双层胶原，与细胞有良好的生物相容性，在起到机械屏障作用、防止周围结缔组织细胞长入新骨的同时，细胞可在Bio-Gide胶原膜上黏附、迁移、增殖^[25]，为成骨细胞提供一个三维支架，血管化的天然胶原结构允许快速均一的血管形成，有利于最佳的组织整合和缺损愈合。相关研究表明，引导性骨再生中可促进骨形成和缺损修复，有利于10周以上的骨形成并防止软组织从周围向内生长^[11，26]，与单独使用骨移植相比较，使用骨移植联合生物膜往往可取得更佳的保存效果^[27]。此次研究建立大鼠股骨骨缺损模型，

将引导骨再生技术运用于长骨骨干骨缺损中，采用引导骨再生技术置入Bio-Gide胶原膜，联合自体骨植入治疗，旨在探究引导骨再生技术对大鼠股骨骨缺损修复的影响。

祖国医学认为，“肾藏精，精生髓，髓养骨”“肾之合骨也”，故“肾在体为骨，主骨生髓”，骨骼的生成、发育和强健均与肾的功能有着密切联系^[28]，“肾主骨”理论在中医骨伤临床实践发挥了重要的指导作用^[17-18]。此次研究主要通过中药补肾法与引导骨再生技术联用，探究补肾中药对骨缺损大鼠骨形成和缺损修复的影响, 并进一步分析作用机制。

此次研究构建股大鼠股骨骨缺损模型，采用引导骨再生技术，通过置入Bio-Gide胶原膜联合自体骨植入，结合补肾中药灌胃治疗。结果表明，引导骨再生技术能有效改善大鼠股骨骨缺损修复，且该技术与补肾中药联用更能显著促进大鼠股骨骨缺损修复、减少骨组织吸收，其成骨效能明显优于单纯使用引导骨再生技术。其作用机制可能是利用生物膜屏障创造出骨组织优势生长的环境，使具有骨组织修复能力的骨细胞优先进入骨缺损腔，结合Bio-Gide胶原膜促进组织整合和缺损愈合，并在此基础上加用补肾中药，进一步上调相关成骨因子及血管生成因子的表达，从而促进成骨细胞生成及血管新生，新生的骨组织和丰富的血供有利于促进缺损修复、改善成骨效能，这为引导骨再生技术结合补肾法运用于长骨骨缺损提供了一定的实验依据。

     综上所述，引导骨再生技术结合中药补肾法治疗能明显促进大鼠股骨骨缺损修复、减少骨组织吸收并改善成骨效能，其作用机制可能是在膜屏障创造出骨组织优势生长的环境中，通过上调相关成骨因子及血管生成因子的表达，从而促进骨组织新生及血管形成。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：

引导骨再生技术：是指通过生物膜屏障创造出骨组织优势生长的环境，使具有骨组织修复能力的骨细胞优先进入骨缺损腔，为骨缺损的修复、骨折愈合提供新方法。

补肾法：是指中医辨证理论指导下，运用补肾中药以固秘肾气、滋养肾精及充养骨髓，从而坚固骨骼，“补肾法”思想在中医骨伤临床实践发挥了重要的指导作用。

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