补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
破骨细胞分化：成熟的破骨细胞由骨髓单核细胞分化而来，骨髓细胞在巨噬细胞克隆刺激因子的诱导下形成骨髓单核细胞，在巨噬细胞克隆刺激因子和RANKL的诱导下，骨髓单核细胞逐渐分化，形成成熟破骨细胞，成熟破骨细胞TRAP染色呈阳性，F-actin是破骨细胞行使骨吸收功能的重要结构，帮助破骨细胞在体内行使骨吸收功能。
绝经后骨质疏松：是一种与衰老有关的常见病，主要发生在绝经后妇女，由于雌激素缺乏导致骨量减少及骨组织结构变化，使骨脆性增多，骨折风险显著上升，同时由骨折引起的疼痛、骨骼变形、出现合并症等严重地影响老年人的身体健康和生活质量。

摘要
背景：骨代谢平衡由破骨细胞介导的骨吸收作用和成骨细胞介导的骨形成作用共同完成。破骨细胞的过度激活可导致一系列的骨代谢疾病如风湿性关节炎、骨质疏松等。RANKL介导的NF-κB通路激活在破骨细胞分化中发挥重要作用。
目的：探究补骨脂异黄酮在RANKL介导的破骨细胞分化中的作用。
方法：以0，1，2，4，8，16，32，64，128 μmol/L补骨脂异黄酮孵育RAW264.7细胞，CCK-8分析补骨脂异黄酮的细胞毒性；RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化，分化过程中给予2，5，10 μmol/L补骨脂异黄酮，干预5 d后采用TRAP染色分析破骨细胞数量，F-actin染色分析破骨细胞形态及功能；干预2 d后骨吸收实验分析破骨细胞的骨吸收功能；干预0，15，30，60 min后western blot分析RANKL介导的NF-κB通路的激活情况；然后进行体内实验，卵巢切除小鼠每周接受10 mg/kg补骨脂异黄酮腹腔注射治疗2次，干预6周后取小鼠股骨进行形态学分析。
结果与结论：①在16 μmol/L浓度以下补骨脂异黄酮无细胞毒性；②补骨脂异黄酮可抑制RANKL介导的破骨细胞分化，抑制作用呈浓度依赖性；③补骨脂异黄酮可抑制破骨细胞F-actin形成和破骨细胞的骨吸收功能；④补骨脂异黄酮可抑制RANKL介导的NF-κB通路；⑤补骨脂异黄酮干预可缓解小鼠绝经后骨质疏松后的骨量丢失；⑥结果表明，补骨脂异黄酮通过抑制RANKL介导的NF-κB通路激活，进而调控破骨细胞分化并缓解绝经后骨质疏松。

https://orcid.org/0000-0001-9176-090X (李啸群)

关键词: 骨, 补骨脂异黄酮, 破骨细胞, 通路, 骨质疏松, 小鼠, 骨吸收, 骨形成

Abstract: BACKGROUND: The balance of bone homeostasis is mediated by the osteoclast-related bone resorption and osteoblast-related bone formation. Over-activation of osteoclasts results in a series of bone metabolic diseases including rheumatoid arthritis and osteoporosis. The activation of nuclear factor-κB pathway induced by receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) plays an important role in osteoclastogenesis.
OBJECTIVE: To explore the effect of corylin on RANKL-mediated osteoclastogenesis.
METHODS: RAW264.7 cells were incubated with 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 μmol/L corylin. The cytotoxicity of corylin was detected by cell counting kit-8 assay. RANKL induced the differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts, during which 2, 5, 10 μmol/L corylin was given. The number of osteoclasts was analyzed by TRAP staining after 5 days of intervention and the morphology and function of osteoclasts were analyzed by F-actin staining. Bone resorption assay was conducted after 2 days of intervention. The activation of NF-κB pathway was detected by western blot at 0, 15, 30, and 60 minutes of intervention. Then in vivo experiments were carried out, and the ovariectomized mice were intraperitoneally given 10 mg/kg twice a week. After 6 weeks of intervention, mouse femurs were taken for morphological analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no cytotoxicity of corylin below the concentration of 16 μmol/L. Corylin inhibited osteoclastogenesis in a dose-dependent manner. Corylin inhibited the formation of F-actin and resorption activity of osteoclasts. Corylin inhibited RANKL-mediated nuclear factor-κB pathway. Corylin treatment reduced the bone loss in postmenopausal osteoporosis mice. Overall, corylin inhibits osteoclastogenesis via blocking nuclear factor-κB pathway and attenuates postmenopausal osteoporosis.

Key words: bone, corylin, osteoclast, pathway, osteoporosis, mouse, bone resorption, bone formation

中图分类号:

李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(在线): 4-.

Li Xiaoqun, Xu Kaihang, Ji Fang. Corylin inhibits osteoclastogenesis and attenuates postmenopausal osteoporosis in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(在线): 4-.

图/表（结果） 10

.1 人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定结果荧光显微镜观察人脐带间充质干细胞呈漩涡状贴壁生长状态，生长良好，见图1。流式细胞仪检测分离获得的人脐带间充质干细胞高表达间充质干细胞标记物CD90、CD73、CD44，阳性表达率均大于95%，不表达造血干细胞标志物CD45和CD34(阳性表达率≤5%)及主要组织相容性复合体标记物HLA-DR(阳性表达率≤5%)，见图2，说明研究所用的人脐带间充质干细胞符合间充质干细胞的基本特征，且具备低免疫原性。

.2 参与者数量分析 8例患者均进入结果分析，无脱落。
2.3 两组患者一般资料比较治疗前记录两组患者性别、年龄、心率、收缩压及舒张压、吸烟史、糖尿病、高脂血症及用药情况，并进行统计学分析，结果均显示差异无显著性意义，见表1，具有可比性。
2.4 试验流程图见图3。

2.5 心脏功能相应指标比较两组患者治疗前心功能各项指标对比差异无显著性意义，因此对两组患者治疗后心功能及治疗前后心功能指标差值进行比较，治疗前两组间数据经t 检验及秩和检验提示各指标之间差异无显著性意义(P > 0.05)，遂可直接比较治疗后相应指标及差值以进行说明。干细胞移植组经人脐带间充质干细胞移植治疗后左室射血分数(55.75±10.69)%较治疗前(49.25±13.62)%呈现升高趋势；左室短轴缩短率治疗后(30.00±6.78)%较治疗前(25.75±8.18)%呈升高趋势；而左房内径、左室收缩末期前后径和舒张末期前后径、主动脉内径、左室舒张末厚度、主肺动脉内径、右房横径、右室横径改善趋势不明显，即差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4和表2。两组患者治疗前后心功能指标变化值比较：干细胞移植组患者治疗前后射血分数变化值(6.50±3.42)%与对照组射血分数变化值(-2.25±4.57)%以及干细胞移植组患者治疗前后左室短轴缩短率变化值(4.25±2.22)%与对照组左室短轴缩短率变化值(-1.50±2.87)%相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5和表3。

2.6 心功能分级比较治疗前及治疗后均进行NYHA心功能分级评估，对照组及干细胞移植组患者治疗后较治疗前无明显改善。两组患者治疗前后各级心功能的患者数量见表4。

2.7 生化指标评价比较两组患者术后3年的生化指标及术前与术后差值情况。因两组患者治疗前血脂有关指标(高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂蛋白a、三酰甘油、胆固醇)对比差异有显著性意义，故只比较两组患者治疗前后差值，见表5和表6。

2.8 两组患者心电图Ⅱ、Ⅲ、aVF、V3、V4、V5导联ST段治疗前后变化治疗前后Ⅱ/Ⅲ导联对照组与干细胞移植组相比ST段下降变化更为显著，而治疗前后V4导联干细胞移植组ST段呈下降趋势而对照组ST段变化呈上升趋势，见图6，可见人脐带间充质干细胞治疗对心电图的影响尚未明确。分析两组患者下壁各导联(Ⅱ、Ⅲ、aVF)及前壁各导联(V3、V4、V5)变化趋势差异很大，人脐带间充质干细胞对心电图的影响有待于进一步研究。
2.9 安全性评价干细胞治疗组患者经静脉输注移植人脐带间充质干细胞未见不适。术后24 h内未见血压异常波动、心率增快或减慢及恶性心律失常发生。

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引言

骨代谢的平衡由破骨细胞介导的骨吸收作用和成骨细胞介导的骨形成作用共同完成[1]。破骨细胞过度激活可能导致一系列的骨骼代谢疾病如风湿性关节炎、骨质疏松症等[2]。研究表明，抑制破骨细胞的分化及功能，减轻破骨细胞的过度激活，是治疗骨丢失疾病的有效方法[3]。骨质疏松症是一种常见的以骨量丢失、骨微结构改变和骨脆性增加为特点的骨骼代谢疾病，骨质疏松症患者发生骨折的风险显著增加[4]。目前，全世界有超过2亿骨质疏松患者[5]。流行病学数据显示，骨质疏松发病率与年龄和性别相关，而绝经后骨质疏松是骨质疏松症的最常见形式[6]。抑制骨吸收的药物如双膦酸盐等，是目前临床治疗骨质疏松的主要药物[7]，但是其在抑制破骨细胞骨吸收功能的同时，也对成骨细胞的骨形成功能产生了抑制，干扰了骨骼的正常重建，在长期用药过程中，还会产生一系列严重的并发症，如下颌骨坏死、非典型性骨折等[8]。寻找更好的药物治疗骨质疏松在临床工作中具有重要意义。破骨细胞来源于单核巨噬细胞系，参与一系列的骨骼代谢疾病的病理过程[9]。破骨细胞的分化过程需要一系列细胞因子的参与和通路的激活，其中巨噬细胞克隆刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)和核因子κB受体激活配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)在其中发挥重要作用[10-12]。巨噬细胞克隆刺激因子可促进破骨前体细胞增殖和RANK的表达[11]，随后RANK与RANKL结合，TRAF家族细胞因子被募集，下游NF-κB、PI3K/AKT和MAPK通路被激活，破骨细胞分化相关细胞因子如NFATc1、MMP-9、CTR等表达，共同调控破骨细胞分化过程[13-14]。补骨脂异黄酮是传统强骨中药补骨脂的提取物[15]。研究表明，补骨脂异黄酮可减轻脂多糖介导的炎症反应，增加肝癌细胞对化疗的敏感性，抑制肿瘤细胞生长[16]。在骨代谢方面，补骨脂异黄酮可促进成骨细胞分化，调控成骨细胞功能[17]。但是，补骨脂异黄酮对破骨细胞的影响尚无报道，其在骨丢失疾病中的作用仍不清楚。该研究对补骨脂异黄酮在破骨细胞分化中的作用及分子通路进行了探索，为临床骨质疏松症的药物治疗提供了参考依据。

材料方法

讨论

骨质疏松症是一种年龄相关的慢性骨骼代谢疾病，主要以骨量减少、骨微结构改变和骨脆性增加为特点[21]，主要发病原因为成骨细胞介导的骨形成作用和破骨细胞介导的骨吸收作用的失衡[13]。研究表明，雌激素缺失导致炎症因子大量表达，同时RANKL介导的信号通路过度激活，从而使破骨细胞功能失调，是绝经后骨质疏松的重要病因[14]。因此，抑制体内过度激活的破骨细胞功能是治疗绝经后骨质疏松的重要方法[22]。

该研究首次报道了补骨脂异黄酮对破骨细胞分化和功能具有抑制作用，同时对其分子机制进行了探讨，发现其可抑制RANKL介导的NF-κB通路激活，进而影响破骨细胞的分化。通过体内实验对补骨脂异黄酮的功能进行了验证，发现其可减轻小鼠卵巢切除手术后的骨质疏松症状，对骨质疏松症具有良好的治疗效果。

骨骼代谢的平衡由成骨细胞介导的骨形成作用和破骨细胞介导的骨吸收作用共同完成[23]。当破骨细胞被过度激活时，会导致一系列的疾病，如风湿性关节炎、骨质疏松症等[24-25]。研究表明，中药提取物在肿瘤治疗、抗炎、抗氧化等方面都具有重要作用[26]。补骨脂异黄酮来源于传统健骨中药补骨脂，其可抑制肿瘤细胞生长，同时具有抗炎、抗氧化的作用[17, 27-29]。在骨代谢方面，补骨脂异黄酮可促进成骨细胞分化，促进骨形成功能[17]。然而，其在破骨细胞中发挥的作用尚不明确。成骨细胞和破骨细胞之间平衡的失调常由于免疫系统平衡的打破。因此，作者推测补骨脂异黄酮在骨质疏松症的治疗中可能发挥重要作用。

为了排除补骨脂异黄酮本身细胞毒性的影响，首先进行了CCK-8实验，并确定了2，5，10 μmol/L无毒剂量来对细胞进行干预，发现补骨脂异黄酮可显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，并具有浓度依赖效应。RANK与RANKL结合后，TRAF细胞因子家族被募集，同时下游分子通路如NF-κB、MAPK和PI3K/AKT通路被激活。既往研究表明，补骨脂异黄酮可抑制NF-κB通路，抑制炎症反应和肿瘤转移[27，29]。为探究补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化的分子通路机制，Western blot实验检测了IκB，p65，p50磷酸化水平，结果发现补骨脂黄酮干预可显著抑制NF-κB通路的激活。因此，补骨脂异黄酮可通过阻断NF-κB通路的激活来抑制破骨细胞的分化。

F-actin参与成熟破骨细胞内封闭环的形成，是破骨细胞行使骨吸收功能的单位[20，30]。为了进一步探究补骨脂异黄酮对破骨细胞功能的影响，进行了F-actin染色和骨吸收实验，结果发现补骨脂异黄酮对成熟破骨细胞的功能也具有明显的抑制作用。

目前，抑制破骨细胞骨吸收功能的药物如双膦酸盐，是目前临床上治疗骨质疏松的主要药物[31]，但双膦酸盐抑制骨吸收作用的同时会干扰骨重建的过程，抑制成骨细胞的骨形成功能[32]。研究发现，长期应用双膦酸盐药物会导致下颌骨坏死和非典型性骨折[33]。特立帕肽是一种重组甲状旁腺激素，也是目前临床上应用的唯一一种生物制剂[34]，同时抗小鼠硬化蛋白抗体也是近年来用来促进骨形成的重要药物，其安全性也正在接受临床评估[35]。生物制剂治疗病理性骨量丢失越来越受到研究者的重视。

实验进一步通过卵巢切除小鼠模型来模拟临床中绝经后骨质疏松状况[36]，并进行了补骨脂异黄酮干预体内实验。在补骨脂异黄酮治疗6周后，采用苏木精-伊红染色方法对小鼠股骨进行了组织形态学分析，结果发现小鼠骨量丢失状况得到了明显的缓解，表明补骨脂异黄酮在体内具有非常好的治疗绝经后骨质疏松的效应。

该研究通过体内及体外实验探究了补骨脂异黄酮对破骨细胞分化和功能的抑制作用，并对相关分子通路进行了探索，证明补骨脂异黄酮在骨质疏松疾病治疗中具有非常重要的价值，但是其抑制破骨细胞分化的具体机制仍需进一步实验说明。