2.1  材料保质期测试结果  为测试生物墨水保质期，首先验证了间歇式巴氏灭菌对海藻酸钠溶液的有效性，然后检测了混合生物墨水的生物相容性及丝素蛋白冻干粉的保存时间。海藻酸钠冷冻保存7 d后打印，培养24 h后无染菌现象，细胞活、死染色结果见图3A-C所示，计算细胞存活率为(86.7±3.4)%，表明间歇式巴氏灭菌对海藻酸钠溶液处理能达到细胞培养的要求。使用密封保存6个月后的丝素蛋白冻干粉制备混合生物墨水，在相同的条件下打印支架，培养24 h后细胞活、死染色见图3D-F所示，计算细胞存活率为(98.1±1.2)%，表明丝素蛋白冻干粉能密封保存至少6个月，且丝素蛋白的添加能提高细胞存活率，为细胞生长提供良好的体外环境。

原方法将10%海藻酸钠与10%丝素蛋白溶液1∶1共混制备生物墨水，在进行细胞打印时，海藻酸钠经巴氏灭菌、称量、紫外光照灭菌，丝素蛋白溶液制备经冻干粉称量、溶解、紫外灭菌，实验前准备工作复杂。常规方法制备的丝素蛋白冻干粉极易溶于水，在称量过程中剩余材料易受潮变质，常规条件下至多保存1周。同时，高浓度海藻酸钠溶液紫外光照灭菌不符合无菌操作规范，有潜在染菌风险。实验优化了材料制备流程，简化实验前准备工作，减少染菌风险，结果显示海藻酸钠经间歇式巴氏灭菌可达到细胞培养要求并冷冻保存，丝素蛋白在干燥通风处密封保存可达6个月。

2.2  生物墨的水机械性能  为测试丝素蛋白添加对混合生物墨水机械性能的影响，通过同轴打印系统制备环形试件，对比测试了材料弹性模量。如图4A所示，将环形试件固定在机械试验机上，记录材料应力应变曲线如图4B所示，计算纯海藻酸钠环形试件弹性模量为(1.80±0.11) MPa，混合材料环形试件弹性模量为(4.06±0.12) MPa，结果表明丝素蛋白的添加能显著提升材料的弹性模量，见图4C。

2.3  扫描电镜观察结果  图5所示为类血管支架脱水干燥后的扫描电镜图，其中图5A，D所示为中空纤维丝外壁材料形貌，材料呈无规则条状卷曲；图5B，E所示为中空纤维丝横断面内部形貌，存在微米级内部连通孔隙结构；图5C，F所示为中空纤维丝内壁材料形貌，较外壁具有更致密的孔隙结构。

2.4  光学相干层析成像结果  利用光学相干层析成像非侵入式检测的优点^[25]，逐层打印逐层扫描可得实验中的生物墨水最高可打印高度为9层，整体厚度约为4.4 mm，支架实物如图6A所示，对横截面光学相干层析成像扫描图像进行拼接处理可见图6B。实验结果表明，在打印过程中因中空纤维丝堆叠支架会发生一定程度的形变，通过光学相干层析成像横截面重建结果可以看出塌陷距离达一个层厚之前，支架塌陷对后续成型效果影响不大，仍能按预设路径打印中空纤维丝。实验所用的生物墨水可打印高度至少为4.4 mm，这与丝素蛋白和F127的添加有关。对应机械性能测试结果，丝素蛋白的添加能有效提高材料机械性能，且F127可以在打印过程中对通道结构进行支撑，并在去除后于通道内部形成微孔结构。

2.5  通道结构对细胞活性影响的结果  设计具有串、并联通道特征的支架，串联支架由一条连续的中空纤维丝堆叠而成，并联支架在串联支架的基础上剪去两侧1 mm区域，由多条纤维丝有序排列而成。使用Alamar Blue试剂在设定时间点测试细胞活性，吸光度较第1天归一化，结果见图7所示，并联通道结构支架对比串联结构具有更高的细胞活性。

组织工程是一门多领域高度综合的新兴学科，致力于体内外构建组织或器官，以进行器官替代为目标^[1]。近年来在皮肤^[2]、角膜^[3]、软骨^[4]、心脏等领域取得了很大的进展^[5]。细胞在体外培养条件下需保证营养物质的供给，由于营养物质和氧气扩散距离有限，有研究指出细胞无法在远离营养物质200 μm以上的区域内存活^[6]。为使体外构建的组织能保证充足的营养供给，构建血管网络是一个需要解决的重要问题^[7-10]。KOLESKY等^[11]通过打印牺牲材料的方式在体外构建了厚度超过1 cm的血管化模型，然而使用牺牲材料存在后处理工艺复杂、材料残留严重等问题^[12]。

同轴细胞打印是生物3D打印中一项新兴技术^[13]，使用双层或多层同轴针头，可以在同一纤维丝中复合多种材料或制备中空纤维丝^[14-16]，为体外构建具有连通网络的血管通道提供了一种新的方式。美国爱荷华大学ZHANG等^[13]首先提出一种制备囊状微流控通道的新方法，研究了流体通道的可制造性和稳定性，为同轴细胞打印的发展奠定了基础。

细胞通常被包裹在特定的聚合物水凝胶内组成生物墨水用于打印，作为包裹细胞的生物墨水应具有可打印性、良好的生物相容性、合适的机械性能等。由于海藻酸钠暴露在Ca²⁺中能快速交联，现已被广泛应用于同轴细胞打印领域^[17]，但海藻酸钠缺乏细胞结合的位点，不利于细胞的黏附与增殖^[18-19]，越来越多的研究者集中于混合生物墨水的研究。哈佛大学医学院COLOSI等^[20]使用低黏度海藻酸钠复合甲基丙烯酰化明胶材料，系统研究了复合材料对同轴细胞打印的适用性，通过离子交联和光交联两步结合成功制备了实心与中空结构。哈佛大学医学院JIA等^[21]报道了一种由甲基丙烯酰化明胶、海藻酸钠、四臂聚乙二醇四丙烯酸酯组成的混合生物墨水，调整了生物墨水的流变性能和机械性能，显示出良好的生物相容性，使用多层同轴3D打印系统成功制备了可灌注空心管。上述研究使用的材料制备过程都较为复杂，要使合适的生物墨水具有实际的应用价值，对于生物墨水制备工艺的优化也十分重要。

课题组前期报道了一种适用于同轴细胞打印的双网络生物墨水^[22]，使用海藻酸钠与丝素蛋白混合溶液作为外轴生物墨水，CaCl₂和Pluronic F-127(F127)作为内轴交联剂，结合生物3D打印和同轴挤出系统制备了高度有序排列的可灌注支架结构。此次实验使用相同的原料，优化生物墨水制备工艺，使其具有可重复性及易操作特点，进一步验证材料的机械性能和生物相容性。此外，通过同轴细胞打印制备了含有内皮细胞及不同结构特征的类血管支架，研究了通道结构的设计对细胞活性的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  对比实验，材料-细胞生物学实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年9月至2019年9月在杭州捷诺飞生物科技股份有限公司完成。

1.3  材料  生物墨水的主要材料为海藻酸钠和脱胶蚕丝，交联剂为CaCl₂和F127，材料信息见表1。溴化锂溶液(Aladdin，美国)；胎牛血清(WISENT INC.，加拿大)；青霉素-链霉素(天津灏洋，中国)；RPMI 1640培养基(天津灏洋，中国)；活、死细胞活力/毒性检测试剂盒(南京凯基，中国)；Alamar Blue细胞毒性检测试剂盒(南京凯基，中国)；3D打印机(Regenovo，中国)；一次性无菌注射器(BD，新加坡)；机械试验机(GOTECH，中国)；高速高分辨率扫频OCT系统(Thorlabs，美国)；扫描电子显微镜(JEOL，日本)。

1.4  实验方法

1.4.1  人脐静脉内皮细胞的培养  采用人脐静脉内皮细胞进行生物学实验，细胞购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。在RPMI 1640培养基中添加最终体积分数为10%胎牛血清和1%的青霉素-链霉素，制备完全培养基进行细胞培养，密度达80%进行传代，选择第4代细胞用于实验。

1.4.2  无菌丝素蛋白冻干粉的预制^[23]  使用20 mL的溴化锂溶液(9.3 mol/L)在60 ℃下加热溶解5 g脱胶蚕丝，约4 h。使用截留分子质量为3 500 Da的透析袋，在流动水下透析溶解液48 h，可得大分子丝素蛋白溶液。离心去除不溶物，测量浓度，约2 h，该丝素蛋白溶液质量浓度一般在70-90 g/L之间。使用去离子水将丝素蛋白溶液稀释为40 g/L，然后用PBS按体积比1∶1与之均匀混合，高温高压灭菌0.5 h。上述处理过程与以往方法相同，以往方法后续直接进行冷冻干燥处理，得到的丝素蛋白冻干粉在常温环境下统一保存。此次实验采用了优化方法，将上述灭完菌的溶液在超净台内分装至无菌容器内，每管15 mL，使用无菌刀纸包裹试管口，-80 ℃下彻底冷冻后，置于冷冻干燥机内抽真空48 h以上使冰升华，即得0.3 g/管的无菌丝素蛋白冻干粉。在超净台内去除刀纸，加盖密封，置于阴凉通风处保存。整个过程大约持续5 d。该制备流程如图1A所示。

1.4.3  海藻酸钠溶液的预制  使用15 mL去离子水溶解0.75 g的海藻酸钠粉末，经70 ℃烘箱30 min，4 ℃冰箱30 min，反复两次制备50 g/L的无菌海藻酸钠溶液，-20 ℃冷冻保存，流程示意如图1B所示。

1.4.4  生物墨水及交联剂的配制  双网络生物墨水制备流程如图1C所示。37 ℃溶解冷冻的海藻酸钠溶液，无菌环境下在1管丝素蛋白冻干粉内加入6 mL海藻酸钠溶液，静置   5 min待丝素蛋白溶解，略微搅拌即可后续使用。当配置含细胞生物墨水时，选择第4代细胞消化计数，取6×10⁶个细胞离心，用200 μL培养基以高浓度分散细胞，加入1管生物墨水内，缓慢搅拌，制备最终浓度为1×10⁹ L^-1的混合生物墨水。

在一定质量的去离子水中溶解相应质量的CaCl₂和F127，配制终浓度为5%CaCl₂和13% F127的交联剂溶液，0.22 μm过滤灭菌，4 ℃冰箱保存。

1.4.5  同轴打印准备  使用一次性无菌注射器分别装载生物墨水和交联剂备用。将双层同轴针头固定在生物3D打印机上，外轴连接生物墨水，内轴连接交联剂。导入打印路径，打印类血管支架，打印参数：室温，同轴外针19 G-内针26 G，内轴流速5 μL/s，外轴流速7 μL/s，打印速度14 mm/s，层厚0.55 mm，间距1.6 mm。含细胞的类血管支架打印后，使用2%CaCl₂静置交联2 min，然后转移至RPMI 1640完全培养基，在含有体积分数5%CO₂的37 ℃恒温培养箱中进行后续培养，每2 d更换一次培养基。

1.5  主要观察指标

生物墨水保质期：海藻酸钠溶液冷冻保存7 d后溶解，混合人脐静脉内皮细胞制备细胞浓度为1×10⁹ L^-1的纯海藻酸钠生物墨水，同轴打印制备支架；使用密封保存6个月的丝素蛋白冻干粉混合人脐静脉内皮细胞及冷冻保存7 d的海藻酸钠制备细胞浓度为1×10⁹ L^-1的混合生物墨水同轴打印支架，在相同培养条件下培养24 h后，使用活、死细胞活力/毒性检测试剂盒对支架进行染色并计算存活率。

材料拉伸测试：使用不含细胞的海藻酸钠溶液和丝素蛋白/海藻酸钠双网络生物墨水，通过同轴打印系统分别制备环形试件，打印后使用2%CaCl₂静置交联2 min，转移至去离子水中37 ℃温浴过夜，达到溶胀平衡。室温条件下将环形试件固定在机械试验机上，设置拉伸速率为5 mm/min进行测试直至断裂，记录拉伸长度(mm)和载荷值(kgf)，确定弹性模量为应力应变曲线0%-3%线性区间的斜率。

光学相干层析成像扫描^[24]：采用高速高分辨率扫频光学相干层析成像系统测试优化后双网络生物墨水最高可打印层数。在打印过程中，一层打印完成时对选定截面进行扫描成像，记录扫描位置，下一层扫描时抬高Z轴探头高度为一个层厚的距离。当成像模糊，支架塌陷厚度达一个层厚距离(0.55 mm)时停止打印。

扫描电镜观察：使用2.5%戊二醛固定打印后的样品，4 ℃过夜，乙醇浓度梯度脱水(70%，80%，90%，95%，100%，100%)每次30 min，室温干燥，表面喷碳，采用扫描电子显微镜观察支架内外壁材料孔隙结构。

类血管通道设计对细胞活性的影响：根据图2模型制备类血管支架，对串联支架左右两边减去约1 mm的结构，处理得到并联支架，其他培养条件相同。使用Alamar Blue细胞毒性检测试剂在培养1，3，7，10，14 d时对支架增殖情况进行检测。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有数据以x(_)±s表示，以P < 0.05为差异有显著性意义。

同轴细胞打印通过选择合适的生物墨水及堆叠中空纤维丝，可以快速直接制备具有类血管通道的组织工程支    架^[26-27]。课题组前期研究提出了一种具有双交联网络的生物墨水^[22]，由海藻酸钠与Ca²⁺离子交联组成第一重网络，保证打印过程的稳定；F127能极大加速丝素蛋白β折叠进程^[28-29]，形成第二重交联网络，保证后续培养过程的稳定。实验规范了这种双网络生物墨水制备工艺及流程。当丝素蛋白以溶液形式存在时一直处于热力学不稳定状态，会自发进行结构转化形成热力学稳定的β折叠结构^[30]。丝素蛋白冻干粉为固态，保证了材料在溶于水前维持α卷曲及无规则卷曲二级结构，有利于长时间稳定保存。此外，丝素蛋白冻干粉可根据实际需要调整浓度，不存在复杂处理工艺。由于传统高温高压灭菌会极大改变海藻酸钠溶液黏度，使材料在打印过程中性质不稳定，因此实验采用间歇式巴氏灭菌对海藻酸钠进行灭活处理，根据实验结果可以看出，巴氏灭菌能够达到细胞培养的要求，且能通过冷冻保存方式在实验前融化使用，简化实验前期准备工作。采用实验中的方法制备双网络生物墨水，降低了双网络生物墨水制备难度，减少了细胞打印过程的染菌风险，增加了实验的可操作性和过程可重复性。通过细胞存活率计算可以看出，双网络生物墨水对比纯海藻酸钠具有更好的生物相容性，细胞存活率达98%，可作为一种理想的生物墨水用于体外构建人体组织模型。

在实际使用中生物墨水的力学特性需要与其生理力学环境相适应，因此对材料力学性能的研究非常重要。实验使用的双网络生物墨水存在两种交联结构，海藻酸钠与Ca²⁺形成的离子交联结构能保证短时间内的结构稳定，并承受一定压力，但是在轴向拉伸模式下其离子交联结构极易被破坏。丝素蛋白富含疏水性β片层结构，能自组装形成坚固而有韧性的材料^[31-32]。实验结果表明丝素蛋白的添加能显著提高生物墨水的弹性模量。此次实验进一步证明了海藻酸钠与丝素蛋白共混能成功结合两者优点，制备具有良好机械性能的生物墨水，为后续研究使用做好准备。

使用优化后双网络生物墨水能顺利制备类血管支架，支架脱水干燥后扫电镜结果表明中空纤维丝不同部位材料孔隙结构有所不同，由于交联剂由内而外存在一定的扩散速率和浓度差异，形成了内密外疏的孔隙结构，F127的析出形成微孔结构，有利于内外营养物质和代谢废物的交换，为细胞生长提供了更多的空间^[33-34]。利用同轴打印可以通过设置不同模型及填充方式获得不同结构的体外组织，在不考虑模型厚度和实际应用的情况下，使用双网络生物墨水最多可堆叠9层中空纤维丝，厚度约为4.4 mm，利用光学相干层析成像对选定截面扫描成像，拼接结果表明截面整体结构清晰，展示了一个互通的管腔结构，无明显崩坍。当海藻酸钠单独使用时可制备高度通常在1.0-2.0 mm内，当高度增加时海藻酸钠难以承受中空纤维丝质量，容易造成结构坍塌，精度降低。JIA等^[21]使用海藻酸钠、甲基丙烯酰化明胶、四臂聚乙二醇四丙烯酸酯打印了10层结构，文献描述高度约为7 mm，但是根据三维重建图可以看到几乎每一层中空纤维丝都发生坍塌，结构发生较大变化。相较之下，可以认为此次实验使用的生物墨水具有更好的成型效果，在后续研究中可继续调整生物墨水组成与浓度，以满足不同需求。

在人体组织内为保证营养物质和氧气的运输，存在错综复杂的血管网络^[35]。要使体外构建的组织更接近天然结构，对血管结构设计研究也十分重要^[7，36]。实验初步设计了具有串、并联通道的类血管支架，使用Alamar Blue对支架内细胞活性进行检测，结果表明并联类血管支架内细胞具有更高的活性，这是由于并联类血管支架相较于串联类血管支架具有更高的灌注效率。该结果对于仿生血管网络的设计具有借鉴意义，在模型设计时应根据不同组织结构和需求设计类血管通道，接近天然组织结构及功能。

结论：实验优化了双网络生物墨水制备流程，对材料性质研究的结果表明，该双网络生物墨水具有良好的生物相容性及合适的机械性能，经同轴细胞打印制备的类血管支架具有细胞生长所需的空间。实验初步实验表明细胞活性与类血管通道设计有关，在后续研究中可进一步探究类血管通道设计与细胞活性及功能之间的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

双网络生物墨水：生物墨水是指可以用于生物3D打印机的材料，具有类似细胞外基质的理化性质，可用于制造与人体器官相似的组织。双网络生物墨水内部具有两种交联网络，能使体外构建的组织具有良好的机械性能，适用于不同的应用场景。

同轴细胞打印：生物3D打印也叫细胞打印，是指操控细胞生物墨水体外构建活性组织的过程。同轴细胞打印是生物3D打印的延伸和发展，通过结合多层同轴针头可以直接快速制备含有内部连通网络的组织工程支架。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

研究优化了双网络水凝胶制备方法。水凝胶主要成分为海藻酸钠和丝素蛋白，研究通过制备丝素蛋白冻干粉和无菌海藻酸钠溶液，改变两者共混方式，简化实验前期准备工作，使生物墨水制备具有可重复性及易操作特点。研究优化后的生物墨水具有良好的生物相容性和机械性能。利用同轴细胞打印制备的支架内部具有微观孔隙结构，为细胞生长提供空间，人脐静脉内皮细胞在支架内表达高细胞活性，且初步证明细胞活性与类血管通道结构设计有关。研究优化的双网络生物墨水具有制备大规模血管化组织的潜能，对复杂组织和器官再生具有借鉴意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程