2.1  各组试件表征结果  打印试件为5 cm的正方形结构，表面粗糙，有少许凸起，内部有少许网状孔径。扫描电镜观低倍镜显示仿生肱骨由一层层的网格状结构构成，内壁黏附有部分聚乳酸颗粒呈半圆球突出表面，呈粗糙状态；高倍镜显示仿生肱骨表面光滑，半圆球直径大小不一，水凝胶组、纳米颗粒组试件表面形成了一层分布均匀且致密的涂层，水凝胶组可见少部分未覆盖的表面裂纹，纳米颗粒组涂层均匀，见图1。

2.2  各组细胞黏附计数结果  细胞接种后8 h，荧光显微镜显示成骨细胞在各组试件上呈单层黏附生长，见图2。纳米颗粒组细胞黏附数显著高于水凝胶组(P < 0.05)，水凝胶组细胞黏附数显著高于空白组(P < 0.05)，定量统计分析显示纳米颗粒组细胞黏附数为水凝胶组的1.1倍，水凝胶组为空白组的1.2倍。

2.3  各组细胞增殖能力测定结果  细胞接种在试件上后培养2，4，6，8 d后，纳米颗粒组、水凝胶组的细胞增殖能力显著高于空白组(P < 0.05)，纳米颗粒组与水凝胶组的细胞增殖能力的细胞增殖能力比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4  各组护骨素和细胞黏附斑蛋白表达水平  纳米颗粒组护骨素及细胞黏附斑蛋白mRNA和蛋白水平均显著高于空白组、水凝胶组(P < 0.05或P < 0.01)，水凝胶组高于空白组(P < 0.05)，见图4。

2.5  抗菌因子分泌及NF-κB信号通路激活情况  培养细胞8 d后，纳米颗粒组白细胞介素6分泌量显著高于水凝胶组、空白组(P < 0.05)，可见复合生物涂层促进细胞分泌抗炎症因子提高抗菌能力；同时细胞中NF-κB信号通路激活检测结果显示纳米颗粒组p-p65蛋白表达水平高于水凝胶组、空白组(P < 0.05)，温敏水凝胶组高于空白组(P < 0.05)，见图5。NF-κB信号通路的激活会导致细胞分泌抗炎因子，提高细胞免疫抵抗能力，该结果和白细胞介素6分泌结果一致。

2.6  各组碱性磷酸酶测定结果  培养细胞8 d后，纳米颗粒组碱性磷酸酶活性显著高于水凝胶组、空白组(P < 0.05，P < 0.01)，水凝胶组显著高于空白组(P < 0.05)，见图6。

2.7  抗金黄色葡萄球菌能力检测结果  纳米颗粒组抗菌能力显著高于水凝胶组、空白组(P < 0.01，P < 0.001)，水凝胶组显著高于空白组(P < 0.01)，见图7。可见聚乳酸结合复合生物涂层以后能显著提高抗菌能力，这也符合前面白细胞介素6的检测结果，聚乳酸复合生物涂层后促进细胞的黏附、增殖，间接促进细胞的抗菌能力。

2.8  抗肠沙门氏菌能力检测结果  纳米颗粒组抗沙门氏菌能力显著高于水凝胶组、空白组(P < 0.05，P < 0.01)，水凝胶组显著高于空白组(P < 0.01)，见图8。可见聚乳酸结合复合生物涂层以后能显著提高细胞的抗肠沙门氏菌能力。

聚乳酸具有很好的自然降解性和生物组织相容性，被广泛应用于生物医学领域，如3D打印骨科材料、体内特殊药物运输与释放、人体组织工程及人体组织培养等^[1-3]。但是，聚乳酸本身的一些生物惰性限制了其植入体内与周围组织的快速及稳定骨结合，制约了其在生物医学领域的广泛应用^[4]。植入早期骨结合是决定植入成功的关键性因素，而细胞在种植体表面黏附、增殖是种植体和周围组织相互作用的关键步骤，影响细胞黏附、增殖、分化、抗菌等多方面功能，并最终影响与组织骨结合^[5-7]。探讨如何对聚乳酸进行表面改性来促进成骨细胞的黏附、增殖，缩短种植体和组织骨的结合时间，增强结合强度，已成为国内外种植材料应用于骨科治疗中的热点问题。

对聚乳酸种植材料进行表面改性包含物理、化学及生物化学改性，其中生物化学改性是当今的研究热点^[8-9]，其通过在种植体材料表面涂层生物复合材料，提高种植体各方面性能。有研究表明在种植体表面添加各种仿生生物活性成分，可促进种植体的成骨活性，同时促进种植体上的细胞抵抗细菌感染^[10-11]。比如Ⅰ型胶原作为细胞外基质的主要成分，来源广泛、免疫原性低，具有良好的生物相容性和生物降解性，因此常被用来对生物医药材料进行改性，提高生物医药的应用价值^[12-14]。有报道称壳聚糖同样具有良好的生物组织相容性，并能促进细胞增殖、分化；此外，壳聚糖还具有促进凝血作用，而凝血反应过程的激活是种植体与生物材料表面、体积微环境之间相互作用的首要步骤，因此壳聚糖在促进种植体表面成骨细胞黏附和骨结合方面发挥了重要作用^[15-18]。

虽然生物活性涂层在钛表面改性方面取得了进展，比如纯钛表面结合纳米管颗粒改性可促进体外成骨细胞的黏附、增殖及分化^[19-21]。聚乳酸也是生物医学常用的新型材料，具有诸多良好性能，关于聚乳酸负载生物复合活性材料促进细胞黏附、增殖、分化，促进抗菌能力的研究较少。因此，实验分析聚乳酸树脂结合壳聚糖-α-β-GP温敏水凝胶及壳聚糖纳米颗粒生物复合涂层后对成骨细胞黏附、增殖、分化的影响，从分子水平探索改性后材料表面对细胞黏附影响的作用机制，同时分析其抗菌能力，从另一个层面探索聚乳酸表面改性提高种植体的性能，拓展其应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外观察实验。

1.2  时间及地点  材料制备于2018年1至2月在承德医学院附属医院骨科实验室完成，材料表征于2019年7至8月在承德医学院附属医院骨科实验室完成，细胞实验于2018年9至10月在承德医学院完成。

1.3  材料  3D打印聚乳酸仿生肱骨试件(承德医学院附属医院骨科实验室提供)；壳聚糖(表1)、α-β-GP温敏水凝胶(国药集团)；MC3T3-E1细胞(国家实验细胞资源共享平台)；革兰阳性菌金黄色葡萄球菌(北京中科质检生物科技有限公司)；革兰阴性菌肠沙门氏菌(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC，1.8721，1.10603)。

实验用主要试剂：三聚磷酸钠、抗坏血酸粉末(国药集团)；α-MEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Sigma公司)；CCK-8试剂盒、白细胞介素6 ELISA检测试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒、4×loading 蛋白上样缓冲液、NP40裂解液(碧云天，上海)；SYBR Premix Ex tagII(诺唯赞生物，南京)；Prestained protein Ladder (Thermo Fisher)；GAPDH兔多抗、护骨素蛋白抗体(Prtoteintech公司)；细胞黏附斑蛋白抗体(Protein公司)；p65抗体和p-p65抗体(Cell Signaling Technology)；辣根过氧酶标记的羊抗兔和羊抗鼠(KPL公司，美国)。

实验用主要设备：3D打印机(华森公司)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)、细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)、Mini电泳仪(Biorad，美国)；化学发光显色仪(GE healthcare，美国)；Mimics 14.01软件(Materialise公司，比利时)。

1.4  方法

1.4.1  3D打印聚乳酸肱骨试件的制备  利用国内西门子四维螺旋双源CT对患者肱骨近端进行扫描，扫描电流35-64 mAs，扫描电压为80-120 kV不等，扫描螺距     0.6 mm，所得数据已DICOM格式保留，输入Mimics 14.01软件，经3D计算建立肱骨近端三维数字化模型，利用3D打印机制作肱骨近端聚乳酸实物模型，利用激光切割机裁剪实物模型保留长为5 cm厚、约0.5 cm的肱骨试件作为实验材料。患者对实验知情同意。

1.4.2  壳聚糖-α-β-GP温敏水凝胶的制备  称取壳聚糖粉末0.2 g，缓慢加入到8 mL 0.1 mol/L乙酸溶液中，使之充分溶解，0.45 μm滤器过滤后静置1 h，高压蒸汽灭菌置于4 ℃备用；称α-β-GP粉末0.56 g，溶解于2 mL双蒸水中，0.22 μm滤器过滤置于4 ℃备用；将上述两种溶液冰浴静置15 min，按照体积比2∶8将α-β-GP溶液逐渐加入到壳聚糖溶液中，最后获得壳聚糖质量浓度为20 g/L、α-β-GP质量浓度为50 g/L的凝胶溶液；将凝胶置于37 ℃金属浴中直至变为凝胶状态，即制备成壳聚糖-α-β-GP温敏水凝胶。

1.4.3  壳聚糖纳米颗粒的制备  称取壳聚糖粉末0.1 g，用0.1 mol/L乙酸定容至100 mL，充分溶解，得到1 g/L的壳聚糖溶液；称取三聚磷酸钠粉末0.1 g，双蒸水溶解并定容至100 mL，得到1 g/L的三聚磷酸钠溶液；将壳聚糖溶液与三聚磷酸钠溶液按照体积比10∶1混合，静置15 min，0.22 μm滤器过滤，得到无菌质量浓度为9 g/L的壳聚糖纳米颗粒分散液。

1.4.4  复合涂层3D打印仿生肱骨试件的制备  试件分3组，第1组为聚乳酸树脂对照组(空白组)，第2组为水凝胶组；第3组为纳米颗粒组。将第2，3组试件分别浸泡在壳聚糖- α-β-GP温敏水凝胶和壳聚糖纳米颗粒溶液中10 min，取出后在37 ℃恒温干燥箱中干燥，为了得到密度均匀的生物符合涂层，可反复浸泡-干燥，试件均经紫外线消毒1 h后备用。

1.4.5  3D打印仿生肱骨试件的表征  先在各组件表面溅射镀膜，在试件表面形成一层薄薄的近钯膜15 s后进行扫描电镜观察。

1.4.6  成骨细胞的培养  取小鼠来源前成骨细胞MC3T3-E1，用含体积分数10%胎牛血清、3%青链霉素双抗的α-MEM培养基培养，置于恒温37 ℃、含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，传代至第4代时进行细胞实验。将MC3T3-E1细胞按照2×10⁸的细胞计数分别接种于各试件上，并浸泡在玻璃培养皿中进行培养。细胞接种后每  3 d换一次培养基。

黏附细胞计数：培养8 h后，用PBS漂洗去除未黏附的细胞，进行DAPI细胞核染色，利用倒置荧光显微镜观察统计黏附细胞数目。

细胞增殖能力测定：培养2，4，6，8 d后，用移液器弃掉旧培养基，PBS冲洗2遍细胞，利用CCK-8试剂盒测定细胞增殖能力。

白细胞介素6测定：培养8 d后收集细胞上清，利用 ELISA试剂盒进行白细胞介素6测定。

黏附斑蛋白和细胞护骨素基因表达的测定：培养6 d后，用胰酶消化并收集各组件培养的细胞，抽提总RNA，反转录为cDNA，总RNA抽提采用Trizol法抽提，反转录方法参见Thermo厂家说明书，使用SYBR Premix Ex tagII试剂通过7500 Fast实时荧光定量PCR仪分析黏附斑蛋白和护骨素及内参基因GAPDH的转录水平，各基因NCBI登录号、引物序列及PCR扩增长度见表2。目的基因的mRNA水平值均通过内参基因GAPDH进行标准处理后再做比较，PCR反应条件如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，扩增40个循环，采用2^-∆∆Ct计算基因拷贝数倍数变化。

黏附斑蛋白和细胞护骨素蛋白表达的测定：培养6 d后，用胰酶消化并收集各组件培养的细胞，台式离心机离心后，加入100 μL NP40 4 ℃裂解20 min，高速离心取上清，加入40 μL 4×loading蛋白上样缓冲液沸水浴10 min，制成蛋白样品，每组上样蛋白为10 μL进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶室温封闭30 min，PBST清洗膜3次后，分别加入细胞黏附斑蛋白、护骨素及GAPDH兔多抗(1∶1 000)，4 ℃过夜孵育，洗膜后采用辣根过氧化酶标记的羊抗兔(1∶10 000)常温孵育1 h，洗膜后进行ECL曝光，采用AIM600多功能成像仪收集信号，在采用Image J软件进行灰度分析。

NF-κB信号通路蛋白检测：培养8 d后，用胰酶消化并收集各组件培养的细胞，提取总蛋白，检测p65、p-p65蛋白的表达，方法同上。

抗菌因子白细胞介素6的测定：培养8 d后，各取等量细胞上清，用ELISA试剂盒测定白细胞介素6分泌含量。

1.4.7  成骨细胞的分化

成骨诱导液的配制：称取176.12 mg抗坏血酸粉末，用100 mL PBS充分溶解，0.22 μm滤器过滤后分装备用；称取β-甘油磷酸钠粉末30.611 g，溶解于91 mL PBS中，0.22 μm滤器过滤后分装备用。

成骨诱导：移液器吸取抗坏血酸溶液50 μL和β-甘油磷酸钠溶液100 μL，溶解于10 mLα-MEM培养基中备用。将MC3T3-E1细胞按照2×10⁸的细胞计数分别接种于3种试件上，待细胞接种密度大于80%时，弃掉旧培养液及未贴壁细胞，加入配好的成骨诱导液，每3 d换液一次，连续成骨诱导15 d。

碱性磷酸酶活性测定：按照试剂盒说明书配制显色底物溶液、标准品工作也并准备样品，参考说明书使用96孔板设置空白对照、标准样品及检测样品孔，将96孔板放入摇床上晃动混匀，37 ℃孵育10 min，每孔加入100 μL反应终止液终止反应，用酶标仪在450 nm处测定各孔吸光度值，取6孔平均值，并对数据进行统计学分析。

1.4.8  抗菌能力检测

琼脂培养基的配制：称取胰蛋白胨1.5 g、大豆蛋白胨0.5 g、琼脂1.5 g、酵母提取物0.5 g、L-半胱氨酸0.04 g，溶解于100 mL蒸馏水中，调节pH值至7.4，高压灭菌备用。灭菌后在无菌生物安全柜中加入5%无菌脱纤维羊血、无菌氯化血红素0.005 g和无菌维生素K0.01 g，混匀后倒入直径90 mm无菌平皿，紫外照射下晾干30 min，待培养皿中的液体完全凝固后密封，置于4 ℃保存备用。

细菌的培养：金黄色葡萄球菌和肠沙门氏菌均为冻干粉，各挑取一小粒冻干粉溶解于无菌生理盐水中，用无菌环挑取分区划线接种于培养板中，在厌氧袋形成的封闭环境(体积分数80%N₂、20%CO₂)中37 ℃孵育72 h，同时将厌氧指示条放在厌氧袋中。

试件的细菌黏附：选择状态良好的单克隆菌落，用接种环挂取培养基平板上的菌落；将菌落充分分散于液体培养基中，用麦氏比浊法稀释成浓度为15×10⁸ CFU/mL的实验用菌液(相当于0.5个麦氏浓度)；将3组试件分别放在上述两种菌液里37 ℃孵育2 h；PBS冲洗试件3次后放入EP管中，加入1 mL PBS用振荡器震荡5 min，再稀释10倍；用移液器吸取10 μL菌液接种再培养基上，用接种环划线的方法将其均匀的花在培养皿上，置于37 ℃厌氧培养箱中培养24 h，大体观察统计菌落数。

1.5  主要观察指标  3组试件表面的细胞黏附、增殖与分化，细胞黏附斑、护骨素的基因与蛋白表达，p65、p-p65蛋白表达水平，白细胞介素6分泌量，以及细菌黏附情况。

1.6  统计学分析  使用SPSS 12.0软件包和Graphpad Prism 5.01软件分析数据，数据采用x(_)±s表示，每次实验为3次独立重复实验得到，采用t 检验比较组差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

聚乳酸具有良好的生物韧性和较佳的生物相容性，但生物惰性限制了聚乳酸树脂种植体与周围组织的相互作用，限制了其生物医学领域的广泛应用^[1，22-24]。因此，提高聚乳酸树脂的生物活性、改善骨结合性能的研究逐渐成为生物材料的热点问题。目前常用的改性方法包括物理、化学和生物化学改性3大类^[9，25-26]。课题组研究发现，壳聚糖纳米颗粒改性后可在聚乳酸表面获得致密均匀的涂层，因而具有促进成骨细胞黏附、增殖和分化的性能。壳聚糖取材便捷且价格低廉，对生物活性物质无毒副作用，自然环境易降解并具有良好的生物相容性，是一种来源广泛的生物材料，其不但能促进骨细胞的生长，还可以抑制细菌增殖。已有研究表明，其他改性材料如Ⅰ型胶原具有促进细胞增殖、分化的作用^[27-30]。扫描电镜观察证实，聚乳酸表面壳聚糖颗粒涂层有利于细胞的增殖、黏附。

实验发现3D打印的聚乳酸树脂肱骨表面结合壳聚糖- α-β-GP温敏水凝胶和壳聚糖纳米颗粒涂层后，可显著促成骨进细胞的黏附、增殖及分化能力。目前研究认为，种植体和周围组织之间形成纤维组织结构的早期骨整合是种植体成功的关键点，而骨整合的成功与否依赖于成骨细胞在内的骨形成细胞与种植体表面之间产生稳定的初始黏附^[31-35]。因此检测黏附斑蛋白和护骨素基因表达情况，可从分子水平层面探索改性后表面细胞黏附影响的作用机制。实验发现聚乳酸树脂肱骨试件改性后，显著促进了细胞黏附斑蛋白和护骨素的转录和表达。黏附斑蛋白与其他黏着蛋白和细胞骨架存在相互作用，调节细胞的黏附、迁移和增殖等过程^[36-39]。护骨素作为肿瘤坏死因子家族成员，与NF-kB受体活化因子配体相结合抑制破骨细胞成熟分化，报护骨吸收^[40-42]。因实验中水凝胶组和纳米颗粒组骨细胞中黏附斑蛋白和护骨素基因同时大量表达，提示聚乳酸改性后可以显著促进骨细胞的黏附活性和成骨分化，为促进骨组织结合提供了基础。此外，改性后两组试件的碱性磷酸酶水平均显著高于未改性的聚乳酸树脂，因此实验提示聚乳酸改性可显著促进成骨细的胞黏附活性和成骨分化能力。

种植体与周围组织相容后的抗菌能力是另一个评价种植体性能的重要指标。以往大量研究报道发现壳聚糖纳米颗粒有较强的抑菌功能。实验结果发现聚乳酸树脂结合生物复合涂层后，能显著降低金黄色葡萄球菌和肠沙门氏菌的菌落数，同时提高细胞白细胞介素6分泌量，可见聚乳酸树脂表面改性后通过促进细胞分泌抗菌因子进而提高其抗菌能力。同时，NF-κB信号通路的激活可以促进白细胞介素6的产生，实验结果表明壳聚糖颗粒及温敏水凝胶可以显著促进NF-κB的激活，两组细胞p-p65水平高于空白组。骨细胞的抗菌能力强弱离不开细胞的增殖能力，正常细胞及组织的抗菌能力与细胞增殖能力呈现一定的正相关性，因为细胞在增殖、分化的同时大量分泌抗菌因子，以提高细胞免疫抵抗能力，促进其抑菌功能^[43-45]。

综上所述，与纯聚乳酸树脂相比，聚乳酸树脂结合生物复合涂层后能显著提高细胞的黏附、增殖及分化能力，同时能促进细胞抵抗革兰阳性及革兰阴性菌的能力，同时促进抗菌因子分泌，显著改善聚乳酸树脂3D打印肱骨的应用性能，为生物医学领域拓展应用提供研究依据，具有良好的应用前景。但是研究也存在一些局限性：只停留在细胞水平，还未进行种植体动物植入实验，以证明改性材料的临床应用价值；聚乳酸结合壳聚糖纳米颗粒改性材料制作过程较为复杂且略微粗糙，在应用之前其制作工艺应制定相应的标准，以上问题有待进一步解决优化，提高聚乳酸改性材料的应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

聚乳酸：是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，生产过程无污染，其产品也可以再生，在自然界中可以循环使用，是理想的绿色高分子材料，近年来被充分应用于医疗器械中，特别是在3D打印人体骨骼中得到广泛应用。

壳聚糖：又名脱乙酰甲壳素，由自然界广泛存在的几丁质经脱乙酰得到，属于天然高分子，该天然高分子具有良好的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性，作为生物复合材料被广泛应用于医药、食品、化工等领域。

α-β-GP温敏水凝胶：是一种N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇的共聚物，在低温下为液态并随温度变化可逆，具备聚合材料的多种特征，被广泛用于医药生命科学领域。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚乳酸具有良好的生物韧性和生物相容性，但生物惰性限制了聚乳酸树脂种植体植入体内后与周围组织的相互作用。以聚乳酸树脂为原料3D打印的肱骨试件，与纯聚乳酸树脂相比，聚乳酸树脂结合生物复合涂层后能显著提高细胞黏附能力、增殖及分化能力，同时能促进细胞抵抗金黄色葡萄球菌及革兰阴性菌能力，同促进抗菌因子分泌，综合显著改善聚乳酸树脂3D打印肱骨应用性能，为生物医学领域拓展应用提供研究依据，具有良好的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程