骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽对骨髓间充质干细胞向软骨分化及功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2251

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (16): 2478-2484.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2251

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骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽对骨髓间充质干细胞向软骨分化及功能的影响

崔逸爽¹，赖振权²，胡中岭³，王茜¹，张辉⁴，郭宝文⁵，李琪佳¹

华北理工大学，¹医学实验研究中心，³临床医学院，河北省唐山市 063210；²华侨大学生物医学学院，福建省泉州市 362000；⁴唐山市第二医院关节一科，河北省唐山市 063000；⁵唐山工人医院普外科，河北省唐山市 063000

收稿日期:2019-07-24 修回日期:2019-07-26 接受日期:2019-09-16 出版日期:2020-06-08 发布日期:2020-03-24
通讯作者: 李琪佳，教授，主任医师，硕士生导师，华北理工大学医学实验研究中心，河北省唐山市 063000
作者简介:崔逸爽，女，1994年生，山东省济南市人，汉族，华北理工大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家科技部科技支撑课题资助项目(2012BAE06B03)；河北省科技支撑资助项目(16277776D)；河北省医学科学研究重点课题计划资助项目(20160225)；华北理工大学博士科研启动基金资助项目(28606299)；河北省卫计委资助课题(20180733)

Effect of bone morphogenetic protein-7 combined with porous tantalum on chondrogenic differentiation and function of bone marrow mesenchymal stem cells

Cui Yishuang¹, Lai Zhenquan², Hu Zhongling³, Wang Qian¹, Zhang Hui⁴, Guo Baowen⁵, Li Qijia¹

¹Medicine Experimental Center, North China University of Science and Technology; ²School of Biomedical Sciences, Huaqiao University; ³Clinical Medical College, North China University of Science and Technology; ⁴First Department of Joint, Second Hospital of Tangshan; ⁵Department of General Surgery, Workers Hospital of Tangshan

Received:2019-07-24 Revised:2019-07-26 Accepted:2019-09-16 Online:2020-06-08 Published:2020-03-24
Contact: Li Qijia, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Medicine Experimental Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, Hebei Province, China
About author:Cui Yishuang, Master candidate, Medicine Experimental Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, Hebei Province, China
Supported by:
a grant from the Ministry of Science and Technology of China, No. 2012BAE06B03; the Hebei Province Science and Technology Support Project, No. 16277776D; the Key Project of Hebei Provincial Medical Research Program, No. 20160225; a grant from the Foundation of Doctoral Research of North China University of Science and Technology, No. 28606299; a grant from the Hebei Provincial Health and Family Planning Commission, No. 20180733

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨形态发生蛋白7：又称成骨蛋白1，是骨形态发生蛋白家族中的一员，可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化；体外可促进软骨细胞增殖及软骨细胞标志因子分泌，体内可协同骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨损伤。

国产多孔钽：实验中应用的多孔钽具有自主知识产权，采用高温煅烧技术制备，具有立体三维空间结构，与人体骨组织的力学强度、弹性模量相似，有较好的生物相容性及骨传导能力。植入体内时可使其周围骨组织黏附并向孔隙内生长，正逐渐替代自体骨、同种异体骨、金属钛和不锈钢等传统医用生物材料，成为骨缺损修复的新型修复材料。

背景：结合物理因素与支架材料建立共培养体系并采用细胞因子诱导，成为骨髓间充质干细胞成软骨分化的热点。

目的：观察骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽对骨髓间充质干细胞软骨向分化的影响。

方法：分离培养SD大鼠(由北京华阜康生物提供)骨髓间充质干细胞，分组干预：①实验组加入多孔钽片，对照组不加多孔钽片，培养第5天，鬼笔环肽染色观察多孔钽片表面的细胞生长情况；培养1，3，5，7 d，CCK-8 法检测细胞增殖；②A组加入软骨细胞诱导液，B组加入软骨细胞诱导液与骨形态发生蛋白7，C组加入国产多孔钽材料与软骨细胞诱导液，D组加入国产多孔钽材料与软骨细胞诱导液和骨形态发生蛋白7，培养第 7，14，21天，采用 ELISA 法检测细胞分泌Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白、基质金属蛋白酶13的水平，Western-blot法检测细胞中Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白、基质金属蛋白酶13的表达。动物实验获得华北理工大学动物实验伦理委员会批准。

结果与结论：①鬼笔环肽染色显示，骨髓间充质干细胞在多孔钽表面及周围生长及增殖良好；②实验组培养3，5 d的增殖慢于对照组(P < 0.05)，培养1，7 d的增殖与对照组无差异(P > 0.05)；③培养第 7，14，21天时，A-D组Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白质量浓度逐渐升高(P < 0.05)。培养第7天时，A-D组基质金属蛋白酶13质量浓度逐渐减少(P < 0.05)；培养第14天时，A组高于其余3组(P < 0.05)，B、C、D组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第21天时，4组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④Western-blot检测显示培养第 7，14，21天时，A-D组Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白表达逐渐升高(P < 0.05)。培养第7天时，A-D组基质金属蛋白酶13蛋白表达逐渐减少(P < 0.05)；培养第14天时，A组高于C、D组(P < 0.05)，B、C组高于D组(P < 0.05)；培养第21天时，A组高于其余3组(P < 0.05)，其余组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果表明，骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽可诱导骨髓间充质干细胞软骨向分化，可促进Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白的表达，抑制基质金属蛋白酶13的表达。

ORCID: 0000-0002-5869-6982(崔逸爽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨形态发生蛋白7, 国产多孔钽, 骨髓间充质干细胞, Ⅱ型胶原, SRY型高迁移率族蛋白, 基质金属蛋白酶13, 软骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: The establishment of coculture system combined with physical factors and scaffold materials and the induction of cytokines have become the focus of chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

OBJECTIVE: To observe the effect of bone morphogenetic protein 7 combined with porous tantalum on chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats (provided by Beijing Huafukang Biology) were isolated and cultured. Group intervention: (1) in the experimental group, porous tantalum tablet was added, while in the control group, porous tantalum tablet was not added. At 5 days after culture, cell growth on the surface of porous tantalum tablet was observed by phalloidin staining. At 1, 3, 5, and 7 days after culture, CCK-8 method was used to detect cell proliferation. (2) Group A was added with chondrocyte inducer; group B with chondrocyte inducer and bone morphogenetic protein 7; group C with domestic porous tantalum material and chondrocyte inducer; group D with domestic porous tantalum material and chondrocyte inducer and bone morphogenetic protein 7. At 7, 14 and 21 days after culture, the levels of type II collagen, SRY type high mobility group protein and matrix metalloproteinase-13 secreted by cells in each group was detected by ELISA. Western blot assay was used to detect the expression of type II collagen, SRY type high mobility group protein and matrix metalloproteinase-13. This study was approved by the Animal Experimental Ethics Committee of North China University of Science and Technology.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The phalloidin staining results showed that bone marrow mesenchymal stem cells grew well on and around the porous tantalum surface. (2) At 3 and 5 days after culture, the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells was slower in the experimental group than in the control group (P < 0.05). There was no statistical difference in cell proliferation between the two groups at 1 and 7 days (P > 0.05). (3) At 7, 14 and 21 days, the expression of type II collagen and SRY high mobility group protein increased gradually among groups A, B, C and D (P < 0.05). At 7 days, the expression of matrix metalloproteinase-13 decreased gradually among groups A, B, C and D (P < 0.05). At 14 days, matrix metalloproteinase-13 secretion of matrix in group A was highest compared with that in group B, group C and group D (P < 0.05), but there was no significant difference between groups B, C and D (P > 0.05). At 21 days, there was no significant difference among groups A, B, C and D (P > 0.05). (4) Western blot assay showed that at 7, 14 and 21 days after culture, the expression level of type II collagen and SRY high mobility group protein increased gradually in groups A, B, C and D (P < 0.05). At 7 days, the expression of matrix metalloproteinase-13 decreased gradually in groups A, B, C and D (P < 0.05). At 14 days, the expression of matrix metalloproteinase-13 was higher in group A than in groups C and D (P < 0.05), and higher in groups B and C than in group D (P < 0.05). At 21 days, the expression of matrix metalloproteinase-13 was higher in group A than in groups B, C and D (P < 0.05). No significant difference was found among groups B, C and D (P > 0.05). (5) The results showed that bone morphogenetic protein-7 combined with domestic porous tantalum could induce cartilage differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, facilitate the expression of type II collagen and SRY high mobility group protein, and inhibit the expression of matrix metalloproteinase-13.

Key words: bone morphogenetic protein-7, domestic porous tantalum, bone marrow mesenchymal stem cells, collagen type II, SRY high mobility group protein, matrix metalloproteinase 13, chondrocyte

中图分类号:

崔逸爽, 赖振权, 胡中岭, 王茜, 张辉, 郭宝文, 李琪佳. 骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽对骨髓间充质干细胞向软骨分化及功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(16): 2478-2484.

Cui Yishuang, Lai Zhenquan, Hu Zhongling, Wang Qian, Zhang Hui, Guo Baowen, Li Qijia. Effect of bone morphogenetic protein-7 combined with porous tantalum on chondrogenic differentiation and function of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(16): 2478-2484.

图/表（结果） 8

2.1 扫描电镜观察国产多孔钽材料多孔钽材料质地坚硬无磁性呈深灰色，直径约为15 mm，厚度约为2 mm，表面凹凸不平有光泽，可见蜂窝状孔隙，见图1A；扫描电镜可见均匀分布的微孔结构，外部孔隙直径为400-600 μm，内部孔隙直径为20-50 μm，孔间相互联通与人体松质骨结构类似，见图1B，C。

2.2 骨髓间充质干细胞的形态观察刚接种的骨髓组织种类多样，培养液较浑浊，细胞不能分类，见图2A；48 h后全量换液，未贴壁的红细胞、骨髓间充质干细胞和造血干细胞等各类细胞被去除，贴壁的细胞散在分布，呈纺锤形、三角形、圆形和不规则形，死细胞较多，见图2B；培养至第7天贴壁细胞增加，形成大小不等的细胞集落，集落间相互连接融合，细胞呈长梭多角形，死细胞减少，见图2C；培养至第10天细胞呈漩涡状生长，长满80%-90%瓶底，死细胞明显减少，见图2D；传代后的细胞生长迅速，3 d即可传代一次，细胞均匀分布呈长梭形、漩涡状密集生长，可见少量死细胞，见图2E；实验组骨髓间充质干细胞在多孔钽表面及周围生长，见图2F；鬼笔环肽染色显示，实验组骨髓间充质干细胞在多孔钽表面生长，见图2G。

2.3 流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞细胞表面CD45表达为阴性，表达率为0.82%；CD29、CD90表达为阳性，阳性率分别为96.91%，93.55%，见图3，鉴定结果表明第3代细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞。

2.4 国产多孔钽支架材料对细胞增殖的影响实验组培养第3，5天的细胞增殖慢于对照组(P < 0.05)，两组培养第1，7天的细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.5 ELISA酶联免疫吸附法检测相关因子水平培养的第7，14，21天，A-D组Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白分泌量均逐渐增多(P < 0.05)。培养第7天，A-D组基质金属蛋白酶13分泌量逐渐减少(P < 0.05)；培养第14天，A组基质金属蛋白酶13分泌量最高，与B、C、D组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；培养第21天，各组基质金属蛋白酶13分泌量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3-5。

2.6 Western-blot法检测相关蛋白表达使用Image对各个图片进行分析，结果显示：培养的第7，14，21天，A-D组Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白表达量逐渐增多(P < 0.05)。培养第7天，A-D组基质金属蛋白酶13蛋白表达量逐渐减少(P < 0.05)。培养第14天，A组基质金属蛋白酶13蛋白表达量最高，与C、D组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；D组基质金属蛋白酶13蛋白表达量最低，与B、C组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。培养第21天，A组基质金属蛋白酶13蛋白表达量最高，与其余组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，B、C、D组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

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引言

多孔钽具有良好的生物相容性，孔隙率、摩擦系数高，耐酸性强，与人体松质骨的弹性模量相近，被称为小梁金属^[1-2]。实验采用重庆润泽医药公司生产的国产多孔钽，已于2019-01-17获得国家药监局批准上市，是国内首个也是唯一获批上市的骨科创新支架材料，区别于美国Zimmer公司采用气相沉积法制作的多孔钽材料^[3]，该材料采用高温煅烧技术制备，孔径400-600 μm、孔隙率75%-85%，弹性模量2.0-4.0 GPa，介于皮质骨(12-18 GPa)和松质骨(0.10-0.53 GPa)之间，抗压强度为100-170 MPa，具备良好的力学性能，可满足软骨修复力学的强度要求^[4-6]。

目前软骨损伤是临床骨科常见病，多采用关节手术治疗，但关节置换的成本及风险较高。间充质干细胞是软骨细胞的祖细胞，具有多向分化潜能，可作为软骨损伤修复的种子细胞^[7-8]，术后注射骨髓间充质干细胞可显著提高软骨再生率^[9]，但骨髓内骨髓间充质干细胞的含量低，诱导成软骨细胞难度较大。结合物理因素与支架材料建立共培养体系并采用细胞因子诱导，成为骨髓间充质干细胞成软骨分化的热点。

骨形态发生蛋白7称成骨蛋白1，是骨形态发生蛋白家族中的一员^[10-11]，可促进软骨和骨形成，体外可促进软骨细胞增殖及软骨细胞标志因子分泌^[12-14]，体内可协同骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨损伤^[15-16]。实验将骨形态发生蛋白7与国产多孔钽复合，国产多孔钽作为骨形态发生蛋白7的载体材料具有良好的生物相容性，可提供三维空间结构及力学支撑，利于细胞的黏附生长。骨形态发生蛋白7可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化、增殖，可促进软骨细胞Ⅱ型胶原的合成。基质金属蛋白酶广泛存在于各种结缔组织中，在细胞外基质降解过程中发挥重要作用。基质金属蛋白酶13调节软骨破坏的关键酶，可不可逆的降解Ⅱ型胶原^[17]。SRY型高迁移率族蛋白是促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的主要调节因子，可使基质金属蛋白酶13、X型胶原表达减少而抑制软骨细胞肥大^[18-19]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年9至12月在华北理工大学医学实验研究中心、华北理工大学基础医学院、河北省慢性疾病重点实验室、唐山市慢性病临床基础研究重点实验室完成。

1.3 材料直径1.5 cm、厚度0.2 cm的片状国产多孔钽材料(重庆润泽医疗器械有限公司)，见表1。

实验动物：3周龄雄性SD大鼠，体质量130-150 g，由北京华阜康生物提供，动物实验获得华北理工大学动物实验伦理委员会批准。

实验用主要试剂与仪器：骨形态发生蛋白7(Pepro Tech，美国)；转化生长因子β1(Gbico，美国)；丙酮酸钠溶液(BI，美国)；地塞米松、维生素C(梯希爱上海化成工业发展有限公司)；DMEM培养液(北京中生奥邦生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；胎牛血清(Gemini，美国)；鼠抗CD45-FITC、鼠抗CD29-FITC、鼠抗CD90-FITC(BD Biosciences，美国)；CCK-8试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；大鼠Ⅱ型胶原酶联免疫分析试剂盒、大鼠基质金属蛋白酶13酶联免疫分析试剂盒及大鼠SRY型高迁移率族蛋白酶联免疫分析试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)；兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体(Abcam，美国)；兔抗大鼠基质金属蛋白酶13抗体(Affinity Biosciences，美国)；大鼠SRY型高迁移率族蛋白抗体(Abclonal，中国)；山羊抗兔二抗(北京中杉金桥有限公司)；预染蛋白Marker、超敏ExPlus ECL化学发光检测试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；二氧化碳培养箱(Esco，美国)；低温高速离心机(Sigma-SK，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；超净化工作台(上海一恒科学仪器有限公司)；0.22 μm无菌过滤器(广州洁特生物过滤股份有限公司)；酶标仪(BI，美国)；流式细胞仪(BD Biosciences，美国)；免疫印迹电泳槽、免疫印迹电泳仪(北京六一仪器厂)；S-4800扫描电镜(日立，日本)；鬼笔环肽(元生生物，上海)；DAPI、Tritionx-100(索莱宝，北京)。

1.4 实验方法

1.4.1 多孔钽材料的准备将多孔钽材料浸入无水乙醇中脱脂12 h，超声波清洗器纯水清洗3次，每次30 min，每次更换纯水；再将多孔钽材料浸入无水乙醇中脱脂12 h，超声波清洗器纯水清洗30 min，高压蒸汽法高压灭菌后干燥箱烘干备用。

1.4.2 扫描电镜观察多孔钽将钽片在2.5%戊二醛溶液中固定4 h，梯度乙醇逐级脱水各10 min，干燥箱内干燥12 h，最后离子溅射装置喷金使图像更清晰，扫描电镜观察多孔钽表面形态结构。

1.4.3 溶液的制备

成软骨诱导培养液：称量4 mg地塞米松先溶于2 mL乙醇，再加入8 mL灭菌纯水混匀，使用无菌过滤器过滤液体除菌，取10 µL放入另一离心管配平至10 mL混匀，浓度为10^-5 mol/L存于-20 ℃备用；称量37.5 mg维生素C溶于10 mL灭菌PBS混匀，使用无菌过滤器过滤液体除菌，质量浓度为3.75 g/L存于-20 ℃备用；5 µg转化生长因子β1溶于5 mL灭菌纯水混匀，质量浓度为1 mg/L存于-20 ℃备用；丙酮酸钠溶液质量浓度为11 g/L直接使用，储存于-20 ℃；在50 mL无菌离心管中加入双抗和上述前4种药物各400 µL，使其各成分体积分数为1%，其余用DMEM补齐至40 mL混匀后为诱导液，存于4 ℃保存备用。

生长因子溶液：将10 µg骨形态发生蛋白7溶于10 mL灭菌纯水混匀，质量浓度为1 mg/L存于-20 ℃备用。

1.4.4 骨髓间充质干细胞的提取与鉴定

骨髓间充质干细胞的提取：颈椎脱臼法处死SD雄性大鼠，用体积分数75%乙醇完全浸泡大鼠10 min，在超净台无菌提取双侧股骨，剔除表面软组织，在10%双抗生理盐水中浸泡双侧股骨15 s，剪除骨两端的干骺端，注射器吸取DMEM冲洗骨髓腔于15 mL离心管中，直至髓腔变白，放至离心机内1 500 r/min离心5 min，弃上清加入5 mL完全培养基混匀，制成细胞悬液放入25 cm²培养瓶中，在37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养，培养2 d后首次全量换液，以后每天换液1次，每次加3 mL培养液。

骨髓间充质干细胞的鉴定：用75 cm²培养瓶培养骨髓间充质干细胞至第3代，胰酶消化2 min，显微镜下观察消化完全后再加入5 mL完全培养基混匀，吸入15 mL离心管800 r/min离心5 min，弃去培养液加入1 mL PBS溶液混匀，1 000 r/min离心5 min，重复离心3次，再加入0.4 mL PBS混匀制成细胞悬液，平均分装至4个流式管中每管100 µL分为4组，第一组为空白组不加抗体，其余每组依次加入2 µL CD29-FITC、CD90-FITC、CD45-FITC抗体混匀，4 ℃下避光孵育30 min，最后向各流式管中加入200 µL PBS混匀后上机检测，重复上述实验3次。

1.4.5 细胞分组培养

实验分组1：将第3代骨髓间充质干细胞制成细胞悬液并计数，按每孔20×10⁴个细胞接种于6孔板中，分为2组，对照组不加入钽片，实验组加入钽片。

实验分组2：取生长至95%左右融合的第3代骨髓间充质干细胞，用生理盐水冲洗3遍，0.2 mL胰酶消化2 min，加入2 mL完全培养基混匀，用细胞计数板计数，按每孔20×10⁴个细胞接种于6孔板中，分为4组：A、B组只有细胞，C、D组先用完全培养基浸润钽片2 h再加入细胞，培养24 h后，A、C组加入软骨诱导诱导液，B、D组加入软骨诱导诱导液与骨形态发生蛋白7溶液。

1.4.6 检测指标

鬼笔环肽染色：培养至第5天，用37 ℃预热的1×PBS清洗实验组与对照组细胞2次，在40 g/L多聚甲醛溶液中固定10 min，1×PBS清洗2次，在0.5%Tritionx-100溶液中透化处理10 min，1×PBS清洗2次，按鬼笔环肽∶甲醇=1∶200的比例配置FITC标记的鬼笔环肽工作液，室温避光孵育 30 min，1×PBS清洗2次，用DAPI溶液染核1 min，1×PBS清洗2次，晾干后荧光显微镜观察采图。

CCK-8法检测细胞增殖：培养第1，3，5，7天，CCK-8法检测实验组与对照组细胞增殖，每天4孔。首先弃去每组待测样品孔中完全培养液，每孔再加入1 600 µL培养液和160 µL CCK-8试剂混匀，培养箱培养2 h后，依次取待测样品孔上清液100 µL，加入无菌96孔板各孔内，最后用酶标仪在490 nm波长处测A值并绘制增殖曲线，两组其余各孔每48 h换液一次。

ELISA酶联免疫吸附法检测相关因子分泌：培养第7，14，21天，收集A-D组细胞培养上清液于EP管中，3 000 r/min离心20 min。按说明书步骤操作，分别检测各组Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白、基质金属蛋白酶13的A值，制作标准曲线并计算出相应浓度。

Western-blot法检测相关蛋白表达：培养第7，14，21天，提取A-D组蛋白并定量，按4∶1的比例将蛋白与5×蛋白上样缓冲液混匀，100 ℃变性5 min，根据蛋白分子量制胶按定量上样，电泳后将蛋白凝胶转移至PVDF膜上，转膜后根据蛋白分子量裁膜，10%脱脂奶粉封闭30 min，1×TBST清洗3次，每次10 min，一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，再用1×TBST清洗3次每次10 min，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，1×TBST清洗3次每次10 min，按说明书配制显色液进行显色，采用Image J图像分析软件进行分析。

1.5 主要观察指标骨髓间充质干细胞在多孔钽片表面的生长与增殖情况；A-D组细胞Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白、基质金属蛋白酶13的分泌与蛋白表达水平。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件分析实验数据，计量资料数据以x(_)±s表示，采用单因素方差分析检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

软骨组织修复是临床工作的难点，软骨损伤修复困难。适宜的支架材料、种子细胞是软骨缺损修复的关键，细胞因子的选择也是软骨组织构建的重要因素，而骨髓间充质干细胞软骨分化在软骨修复中也发挥了重要作用。

前期工作已证明国产多孔钽支架材料具备良好的生物相容性，利于软骨细胞的黏附生长^[20]，但其促骨髓间充质干细胞软骨向分化的作用尚不明确。实验选取的第3代骨髓间充质干细胞流式细胞仪鉴定成功^[21-25]。CCK-8检测发现培养前3 d，两组细胞增殖较缓，第3-7天两细胞呈对数生长，对照组细胞生长在初期(3，5 d)优于实验组，后期(7 d)两组细胞增殖无明显差异，提示国产多孔钽支架材料与髓间充质干细胞的细胞相容性良好，与相关研究结果一致^[26]。

Ⅱ型胶原是软骨细胞的特征性蛋白，SRY型高迁移率族蛋白与软骨的合成密切相关，其基因转录可明显促进软骨合成^[27-28]。有学者以腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染猪骨髓间充质干细胞，随着时间的延长，软骨细胞内SRY型高迁移率族蛋白和Ⅱ型胶原基因表达逐渐增加，较不转染组诱导的软骨细胞基因表达更强^[29]。实验发现，骨形态发生蛋白7诱导组SRY型高迁移率族蛋白和Ⅱ型胶原分泌量明显多于无因子诱导组，国产多孔钽支架组明显多于无支架组，骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽组分泌量最多，提示骨形态发生蛋白7可协同国产多孔钽利于SD大鼠髓间充质干细胞向软骨细胞诱导。国产多孔钽的高孔隙率、低弹性模量、类似骨松质的微孔样结构，为骨髓间充质干细胞软骨向诱导及软骨细胞的增殖提供力学支撑，其三维空间结构利于营养物质的传输，利于细胞增殖生长。骨形态发生蛋白7可在体外促进间充质细胞向软骨细胞分化，促进软骨细胞增殖及细胞外基质合成^[30]。实验发现单纯诱导组髓间充质干细胞可分化为软骨细胞，诱导液加骨形态发生蛋白7因子组效果明显好于单纯诱导组，与其他研究结果一致^[31]。在其他研究中采用的是细胞转染技术^[30]，此次实验采用的是因子与材料复合培养，在后续实验中可尝试基因转染实验，探究基因转染组是否比诱导液加因子组复合国产多孔钽对软骨诱导更有利。

基质金属蛋白酶在各种结缔组织中广泛存在，对细胞生理和病理性降解过程十分重要。多项研究证明，基质金属蛋白酶活性增加可导致软骨细胞功能降低^[32-33]，如与未转染组相比，转染胰岛素样生长因子1基因后的骨髓间充质干细胞基质金属蛋白酶1，2，3 mRNA表达降低^[22]。基质金属蛋白酶1和13同属于胶原酶，基质金属蛋白酶1可直接降解Ⅱ型胶原，也能介导其他基质金属蛋白酶降解Ⅱ型胶原^[34]。多数实验未进行体外长期诱导骨髓间充质干细胞软骨向分化基质金属蛋白酶家族蛋白表达的检测。此次实验发现第7天时，A-D组基质金属蛋白酶13分泌量逐渐减少， 14 d时单纯诱导液组分泌量最高(P < 0.05)，21 d时4组间差异不明显。Western-blot检测结果与ELISA结果基本一致：14 d时，单纯诱导液组金属基质蛋白酶13蛋白表达量明显高于骨形态发生蛋白7诱导组与骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽组(P < 0.05)；21 d时，单纯诱导液组金属基质蛋白酶13蛋白表达量明显高于其余3组(P < 0.05)。实验结果表明，SD大鼠髓间充质干细胞软骨向诱导前期软骨细胞表达越多，基质金属蛋白酶13表达量越少，提示骨形态发生蛋白7可减少基质金属蛋白酶13的生成，从而保持软骨细胞胶原纤维的稳定性，抑制软骨细胞肥大及胞内钙化^[35-37]。基质金属蛋白酶13活性降低有利于软骨细胞功能的表达。国产多孔钽支架材料为髓间充质干细胞软骨向诱导提供三维空间，利于细胞分化增殖，降低诱导过程中的去分化现象；诱导中期，骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽诱导组基质金属蛋白酶13表达低于其余3组，提示骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽可降低基质金属蛋白酶13的生成，保证髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的稳定性；诱导后期除单纯诱导液组外，其余3组间基质金属蛋白酶13表达无明显差异，提示骨形态发生蛋白7利于髓间充质干细胞软骨向诱导，降低金属基质蛋白酶13的生成，而国产多孔钽对金属基质蛋白酶13的生成影响不大。

综上所述，骨髓间充质干细胞与国产多孔钽体外复合培养后可正常生长增殖，证实国产多孔钽具有良好的生物相容性；Ⅱ型胶原、SRY型高迁移率族蛋白与基质金属蛋白酶13检测结果提示，骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽不仅能够协同促进骨髓间充质干细胞的软骨向分化，对软骨细胞的功能和稳定性也有一定的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

骨形态发生蛋白7复合国产多孔钽对骨髓间充质干细胞向软骨分化及功能的影响

Effect of bone morphogenetic protein-7 combined with porous tantalum on chondrogenic differentiation and function of bone marrow mesenchymal stem cells

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