不同交联密度甲基丙烯酰酯明胶/脱细胞半月板细胞外基质复合水凝胶的性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2286

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (16): 2493-2499.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2286

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不同交联密度甲基丙烯酰酯明胶/脱细胞半月板细胞外基质复合水凝胶的性能

周建^1，2，田壮^1，2，田沁玉²，罗旭江²，彭礼庆²，李坤²，眭翔²，黄靖香²，刘舒云²，郝利波²，郭全义²，姚琦¹

¹首都医科大学附属北京世纪坛医院关节外科，北京市 100038；²中国人民解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2019-08-22 修回日期:2019-08-26 接受日期:2019-12-26 出版日期:2020-06-08 发布日期:2020-03-24
通讯作者: 姚琦，主任医师，教授，首都医科大学附属北京世纪坛医院关节外科，北京市 100038 郭全义，主任医师，教授，中国人民解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853
作者简介:周建，男，1993年生，河北省霸州市人，汉族，首都医科大学在读硕士，主要从事软骨组织工程、3D生物打印方面的研究。
基金资助:
国家重点研究和发展计划项目(2017YFC1103400)；北京市自然科学基金项目(7172203)

Properties of gelatin methacrylate/decellularized meniscus extracellular matrix composite hydrogel with different crosslinking densities

Zhou Jian^{1, 2}, Tian Zhuang^{1, 2}, Tian Qinyu², Luo Xujiang², Peng Liqing², Li Kun², Sui Xiang², Huang Jingxiang², Liu Shuyun², Guo Quanyi², Yao Qi¹

¹Department of Joint Surgery, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; ²Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Lab of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China

Received:2019-08-22 Revised:2019-08-26 Accepted:2019-12-26 Online:2020-06-08 Published:2020-03-24
Contact: Yao Qi, Chief physician, Professor, Department of Joint Surgery, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China Guo Quanyi, Chief physician, Professor, Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Lab of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Zhou Jian, Master candidate, Department of Joint Surgery, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Lab of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Key Research and Development Program of China, No. 2017YFC1103400; the Natural Science Foundation of Beijing, No. 7172203

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脱细胞半月板细胞外基质：由新鲜半月板组织通过湿法差速离心方法脱细胞制备而来，在去除了异体半月板的免疫原性的同时，仍保留了组织的大部分成分和组织本身的生物学性能，例如影响细胞的活性、调控细胞的增殖和分化、促进组织再生和修复等。

甲基丙烯酰酯明胶：是一种明胶的衍生物，由甲基丙烯酸酐与明胶合成而来。在加入光引发剂的基础上经紫外线照射，明胶链上的甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯侧基聚合形成聚合物链，聚合物链交错纵横，最终形成网状结构。

交联密度：通常用来表征交联聚合物里交联键的数量，主要受交联时间和交联光强度的影响，其可明显改变聚合物链的形成情况。

背景：交联后的聚合物链对水凝胶的基本性质和细胞相容性存在显著影响，而交联密度可明显改变聚合物链的形成情况，有关交联密度对水凝胶性能影响的针对性研究较少。

目的：制备一种细胞相容良好性的复合水凝胶，探究交联密度对该水凝胶性能的影响。

方法：配制甲基丙烯酰酯明胶溶液，然后加入脱细胞半月板细胞外基质溶液与LAP溶液，制备预凝胶溶液，采用蓝光对溶液进行交联，交联时间分别为10，30，60 s，检测3种水凝胶的压缩弹性模量、溶胀倍率与降解性能。将半月板纤维软骨细胞加入预凝胶溶液中，采用蓝光对溶液进行交联，交联时间分别为10，30，60 s，检测培养对应时间的细胞活性、形态与聚集。

结果与结论：①交联60 s水凝胶的压缩模明显高于交联10，30 s的水凝胶(P < 0.05)；②交联10 s水凝胶的溶胀倍率明显高于交联30，60 s的水凝胶(P < 0.05)，交联30，60 s的水凝胶的溶胀倍率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③随着交联时间的延长，水凝胶的降解时间延长，交联60 s的水凝胶需要80 min完全降解，交联10 s的水凝胶50 min就可以完全降解；④培养24 h后，3组水凝胶中的细胞活性均在95%以上，各组之间无差异(P > 0.05)；⑤培养1 d时，3组水凝胶中的细胞均呈球形且均匀分布；4 d时，3组细胞均开始伸展，交联10 s水凝胶中有较小的细胞团；7 d时，3组细胞树突状伸展更为明显，其中交联10 s水凝胶中形成了较为明显的细胞团；⑥培养1，7，14 d时，交联10 s水凝胶中的细胞活性均在85%以上。培养1 d时，交联10 s水凝胶中的细胞呈球形分布，且分布均匀；培养28 d时，细胞呈树突状伸展，并聚集形成网状结构；⑦结果表明，甲基丙烯酰酯明胶/脱细胞半月板细胞外基质复合水凝胶的性能可通过调整交联密度进行优化。

ORCID: 0000-0002-3606-1097(周建)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 水凝胶, 甲基丙烯酰酯明胶, 脱细胞外基质, 性能, 交联密度, 细胞相容性, 光交联, 半月板

Abstract:

BACKGROUND: Crosslinked polymer chains have a remarkable effect on the fundamental properties and cytocompatibility of hydrogels, and crosslinking density can significantly change the formation of polymer chains. There are few studies on the effect of the properties of hydrogels caused by crosslinking density.

OBJECTIVE: To prepare a composite hydrogel with a favorable cytocompatibility and to explore the effect of crosslinking density on the properties of the hydrogel.

METHODS: Gelatin methacrylate solution was prepared, and decellularized meniscus extracellular matrix and LAP solution were added to prepare the pre-gel solution, which was crosslinked by blue ray. The crosslinking time was 10, 30 and 60 seconds. The compression elastic modulus, swelling ratio and degradability of hydrogels were detected. Meniscus fibrochondrocytes were added into the pre-gel solution, and crosslinked by blue ray. The cell viability, morphology and gathering were detected at 10, 30 and 60 seconds of crosslinking.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The hydrogel with 60 seconds of cross-linking time had higher compression elastic modulus than that of the hydrogel with 10 and 30 seconds of cross-linking time (P < 0.05). (2) The swelling ratio of the hydrogel with 10 seconds of cross-linking time was significantly higher than that of the hydrogel with 30 and 60 seconds of cross-linking time (P < 0.05). The swelling ratio of the hydrogels with 30 versus 60 seconds of cross-linking time had no significant difference (P > 0.05). (3) With the crosslinking time increasing, the degradation time of hydrogels increased. The hydrogels with 60 seconds of cross-linking time degraded completely at 80 minutes, and hydrogels with 10 seconds of cross-linking time degraded completely at 50 minutes. (4) After 24 hours of culture, the cell viability in all groups was over 95% (P > 0.05). (5) At 1 day after culture, the cells were in sphere-shape and distributed evenly in all groups. On day 4, the cells in all groups began to extend, and there were small cell masses in the hydrogels with 10 seconds of cross-linking time. On day 7, the dendritic extension in all groups was obvious, and there were dominant cell masses in the hydrogels with 10 seconds of cross-linking time. (6) After 1, 7 and 14 days of culture, cell viability in all groups was over 85%. At 1 day after culture, the cells in the hydrogels with 10 seconds of cross-linking time were in sphere-shape and distributed evenly. On day 28, the cells extended in dendritic shape, and gathered in reticular formation. (7) In summary, the property of gelatin methacrylate/decellularized meniscus extracellular matrix composite hydrogel can be optimized by adjusting crosslinking density.

Key words: hydrogel, gelatin methacrylate, decellularized extracellular matrix, property, crosslinking density, cytobiocompatibility, photo-crosslinking, meniscus

中图分类号:

周建, 田壮, 田沁玉, 罗旭江, 彭礼庆, 李坤, 眭翔, 黄靖香, 刘舒云, 郝利波, 郭全义, 姚琦. 不同交联密度甲基丙烯酰酯明胶/脱细胞半月板细胞外基质复合水凝胶的性能[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(16): 2493-2499.

Zhou Jian, Tian Zhuang, Tian Qinyu, Luo Xujiang, Peng Liqing, Li Kun, Sui Xiang, Huang Jingxiang, Liu Shuyun, Guo Quanyi, Yao Qi. Properties of gelatin methacrylate/decellularized meniscus extracellular matrix composite hydrogel with different crosslinking densities[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(16): 2493-2499.

图/表（结果） 7

2.1 水凝胶的制备 dMECM浆液是由猪半月板通过湿法差速离心方法制备，见图1A，经课题组成员前期测试显示，dMECM保留了大部分的胶原和糖胺多糖，细胞成分绝大部分被去除^[27-28]。半月板纤维软骨细胞取自1月龄新西兰白兔，通过重复多次Ⅱ型胶原酶消化的方法能够取得大量的原代细胞，细胞汇合度达到80%-90%进行传代，所有实验均取用P2-P5代细胞，该区间的细胞具有很好的形态(长梭形)和增殖能力，见图1B。GelMA并不能迅速且完全溶于PBS中，反复冻融及长时间置于60 ℃水浴锅溶解，有利于消除GelMA溶液中的泡沫及不溶成分。GelMA/dMECM预凝胶溶液具有一定的温敏性，其在37 ℃时呈液体状态，见图1C，在经过短暂的蓝光交联后能够形成稳定的胶体状态，见图1D。

2.2 水凝胶的力学强度由图2A可以看出3组之间力学性能差异明显，交联60 s水凝胶的压缩模量为(7.35±0.19) kPa，明显高于交联10，30 s的水凝胶(P < 0.05)，并且交联30 s水凝胶的压缩模量高于交联10 s的水凝胶(P < 0.05)。证明随着交联时间的延长，水凝胶的压缩模量随之增高。

2.3 水凝胶的溶胀倍率通过充分溶胀然后冻干方式对水凝胶的溶胀倍率进行测试，结果显示交联10 s水凝胶的溶胀倍率为16.81±0.31，明显高于交联30，60 s的水凝胶(P < 0.05)，由此可见水凝胶的交联密度和溶胀性紧密相关；但是交联30，60 s水凝胶的溶胀倍率差异不大，说明30 s后的交联时间延长对溶胀的性能影响相对较小，见图2B。

2.4 水凝胶的降解性测试评估水凝胶的降解有很多种方法，例如在PBS中、在胶原酶或者透明质酸酶中或者直接植入体内等^[29-31]。实验利用0.1%的Ⅰ型胶原酶对水凝胶进行降解性评估，结果显示交联60 s水凝胶需要80 min完全降解，交联10 s水凝胶50 min就可以完全降解，见图3。由此可以看出，水凝胶的交联密度越大降解时间越长。

2.5 水凝胶交联时间对细胞活性的影响各组之间细胞活性没有明显差异，均达到95%以上，见图4。因此，在该光照时间范围内蓝光对细胞并无明显损伤。

2.6 交联密度对细胞形态和聚集的影响如图5所示，培养1 d时，各组别细胞均呈球形且均匀分布；4 d时，各组细胞均开始伸展(黑色箭头)，交联10 s水凝胶组有较小的细胞团(红色箭头)；7 d时，各组细胞树突状伸展更为明显(黑色箭头)，其中交联10 s水凝胶组形成了较为明显的细胞团(红色箭头)。

2.7 水凝胶中细胞相容性的观察通过以上实验综合评估水凝胶的各项性能，发现交联10 s的水凝胶可能更利于细胞的培养，因此选用该组水凝胶进行为期14 d的培养，观察细胞活性的变化。实验发现，培养1，7，14 d后的细胞活性均在85%以上，见图6。

对1，28 d的水凝胶进行鬼比环肽/DAPI染色，结果显示，培养1 d时细胞在水凝胶中呈球形，分布均匀；培养28 d时，细胞呈树突状伸展，并聚集形成三维网状结构，见图7。

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引言

半月板是位于股骨髁和胫骨平台之间由纤维软骨构成的新月形楔形物，在膝关节中发挥着至关重要的作用^[1-2]。半月板损伤是临床常见的运动损伤，但由于半月板的血液循环较匮乏^[3]，所以损伤后很难自我修复^[4]。组织工程的再生治疗是目前最具应用前景的治疗策略，应用于组织工程支架的材料主要包括合成高分子类、水凝胶类、细胞外基质类和组织衍生类材料等^[5]。由于水凝胶能够很好地模拟体内细胞生长的微环境^[6-9]，因此其被广泛应用于生物医学研究的各领域之中。

水凝胶是一种能够在水中充分溶胀并保持大量水分而又不会溶解的交联聚合物。目前应用于组织工程的水凝胶主要是由一些天然聚合物构成，包括：海藻酸钠、明胶、胶原、壳聚糖、纤维素、透明质酸、细胞外基质等^[10-15]。其中，由于细胞外基质在去除了细胞免疫原性的基础上又保留了组织的大部分成分，可以很好地促进细胞的增殖和分化^[16-18]，因此是一种比较理想的生物材料。甲基丙烯酰酯明胶(Gelatin methacryloyl，GelMA)是一种明胶衍生物，在加入光引发剂的基础上经紫外线照射，明胶链上的甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯侧基聚合形成聚合物链，聚合物链交错纵横，最终形成网状结构。由于其良好的细胞相容性及可灵活调节的机械性能而广受研究者的青睐^[19-22]。因此，实验选用了脱细胞半月板细胞外基质(decellularized meniscus extracellular matrix，dMECM)，借助GelMA，通过按一定比例浓度混合方式制备了一种机械性能灵活可调且细胞相容性良好的复合水凝胶。

良好的细胞相容性对水凝胶在组织工程领域的应用具有重要意义，而交联后的聚合物链对水凝胶的基本性质和细胞相容性存在显著影响^[23]。但目前相关的研究主要是通过调整GelMA浓度、光引发剂的浓度和类型、细胞外基质浓度等调整水凝胶的结构和性能^[24-26]。交联密度通常用来表征交联聚合物里交联键的数量，主要受交联时间和交联光强度的影响，其可明显改变聚合物链形成情况，但其对水凝胶的性能有何影响，以上的研究虽然有所涉及，但相关的针对性研究较匮乏。因此，实验通过改变交联时间方式单纯的调整水凝胶交联密度，探讨其对水凝胶力学性能、降解性、溶胀性能、细胞形态和聚集的影响，进一步优化水凝胶的细胞相容性，为后续其在半月板组织工程领域的应用提供一定的科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年8月期间在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料 GelMA由上普博源(北京)生物科技有限公司提供，见表1；dMECM由课题组制备。

实验动物：1月龄新西兰白兔由解放军总医院实验动物中心，雌雄各1只，实验方案经解放军总医院动物护理和使用委员会批准。

实验用主要试剂和设备：TCS SP8共聚焦显微镜(德国Leica公司)；BH-2型倒置显微镜(日本Olympus公司)；ElectroForce 3320力学分析仪(美国BOSE公司)；IX 70型荧光显微镜(日本Olympus公司)；罗丹明鬼比环肽(美国Cytoskeleton公司)；细胞死活荧光染色试剂(美国Biovision公司)；Ⅱ型胶原酶(sigma，美国)；胎牛血清(北京元亨圣马)；DMEM培养液(Corning，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 dMECM的制备利用湿法差速离心方法制备dMECM。在北京市岳各庄批发市场购买一批新鲜猪半月板，剪去多余的滑膜组织，并将其剪成体积小于1 mm× 1 mm×1 mm的组织碎块。然后将组织碎块装入无菌容器，使用双氧水漂洗3次，每次5 min；再用无菌PBS溶液漂洗3次，每次5 min；然后随机选取少量组织块送细菌培养。经证实无菌后方可进行后续步骤。将无菌半月板碎块用匀浆机制成悬浮浆料，低温高速离心机1 500 r/min离心5 min，取上清液体继续2 000 r/min离心15 min，然后取上清液体 6 000 r/min离心20 min，最后将上清液体10 000 r/min离心30 min，收集半月板匀浆沉淀。将沉淀以无菌PBS溶液混匀，10 000 r/min离心30 min，重复3次，最终制备成30 g/L的dMECM混悬液，4 ℃保存。

1.4.2 半月板纤维软骨细胞的原代培养耳缘静脉空气栓塞法处死新西兰白兔，常规膝关节备皮，碘伏乙醇消毒，铺单，膝关节内侧入路切开皮肤并游离皮下组织，打开关节囊，将髌骨外翻，切取半月板并放入加有双抗的PBS溶液内。将装有新鲜半月板组织的培养皿置于超净台内，然后转移入青霉素小瓶，PBS反复清洗3次。用眼科剪将半月板尽量剪碎，最终剪成体积小于1 mm×1 mm×1 mm的组织碎块。加入10倍于半月板体积的0.2%Ⅱ型胶原酶。然后将混悬液置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内，每隔3 h收集一次酶解的混悬液，再重新加入新的Ⅱ型胶原酶，重复4次；将收集的混悬液用含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液终止胶原酶消化。离心并以0.75×10⁶的密度将原代细胞种植于75 cm²的培养瓶内，待细胞长至80%-90%融合用0.25%的胰酶消化传代。选用P2-P5代进行后续实验。

1.4.3 不同交联密度水凝胶的制备

无细胞预凝胶溶液的制备：将GelMA干粉用PBS溶解，配置成200 g/L的质量浓度，60 ℃水浴锅溶解2 h，置于4 ℃冰箱5 min，然后再次放入60 ℃水浴锅溶解2 h，保证GelMA完全溶解。之后加入30 g/L的dMECM，25 g/L的LAP配置成终浓度为100 g/L GelMA+5 g/L dMECM+ 2.5 g/L LAP的预凝胶溶液。

含细胞预凝胶溶液的制备：将半月板纤维软骨细胞以胰酶消化后计数，1 200 r/min离心5 min，然后用无细胞预凝胶溶液重悬细胞，配置成终浓度为100 g/L GelMA+5 g/L dMECM+2.5 g/L LAP+半月板纤维软骨细胞的预凝胶溶液(细胞数为1×10⁶)。

用蓝光(波长为405 nm)对该两种预凝胶溶液进行交联，光强度为90 mW/cm²，通过改变交联时间(10，30，60 s)制备不同交联密度的水凝胶。

1.4.4 水凝胶力学性能的测试取无细胞的3组水凝胶，每组3个样本。将水凝胶转移至培养皿，加入适量PBS，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内24 h，充分溶胀，制备成横截面直径为22 mm、高度6 mm的圆柱体。利用ElectroForce 3320力学分析仪进行压缩性能测试。进行压缩实验前首先压缩5%，压缩速率为0.01 mm/s，预压缩20个循环后开始正式实验，最大压缩率为33%，压缩速率为0.01 mm/s，利用origin9.0软件对应力-应变曲线进行线性拟合，计算出压缩弹性模量。

1.4.5 水凝胶溶胀倍率测试取无细胞的3组水凝胶，每组3个样本。加入适量PBS，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内24 h，充分溶胀，之后对标本进行称质量，记录为m₁。然后将标本冷冻干燥，称质量记录为m₀。溶胀倍率=(m₁-m₀)/m₀。

1.4.6 水凝胶降解性测试取无细胞的3组水凝胶，每组3个样本。将水凝胶转移至培养皿，加入足量PBS，放置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内24 h，充分溶胀。对各组水凝胶进行质量称量，标记为m₀，然后加入0.1%Ⅰ型胶原酶，置于培养箱，每10 min称一次质量，依次记录为m₁，m₂，m₃…利用grafpad8.0画出降解曲线。

1.4.7 交联时间对细胞活性的影响取含细胞的3组水凝胶，每组3个样品。之后将水凝胶培养24 h，死活染色试剂浸染30 min，PBS清洗3遍，进行共聚焦显微镜拍照，使用imageJ 1.52a计算细胞活性。

1.4.8 交联时间对细胞形态和聚集的影响取含细胞的3组水凝胶，将水凝胶培养1，4，7 d，倒置显微镜下观察细胞形态和分布变化。

1.4.9 水凝胶的细胞相容性取含细胞交联10 s的水凝胶，培养1，7，14 d，然后通过死活染色的方式评估细胞活性。另外，将该水凝胶培养28 d，进行鬼比环肽/DAPI染色(染色方法见说明书)，共聚焦显微镜观察细胞形态。

1.5 主要观察指标不同交联密度水凝胶的压缩弹性模量、溶胀倍率与降解性能，以及细胞相容性。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，所有数据以x(_)±s表示，组间数据比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

组织工程的发展包括3要素：种子细胞、活性因子和支架。理想的支架应尽可能模拟组织，胶原、透明质酸、海藻酸钠等生物材料一般都是模拟组织的单一成分^[32-36]。dMECM在去除异体半月板免疫原性的同时，仍保留了组织的大部分成分和组织本身的生物学性能，例如影响细胞的活性、调控细胞的增殖和分化、促进组织再生和修复等^[37-38]。但在其去除细胞的过程中也完全破坏了其结构，使组织本身的物理性能如连接、保水、支持等作用也全部破坏。GelMA水凝胶可以通过调整合成过程或添加各种生物材料来满足大多数组织工程应用的生物功能和机械可调性要求^[39]。因此，实验借助GelMA充分改善了dMECM物理性能较差的缺点，制备出一种机械性能和细胞相容性兼顾的复合水凝胶。

交联密度是水凝胶性能的重要影响因素。随着水凝胶交联密度的增加，形成的聚合物链越来越密集，水凝胶网络孔径变小，当三维聚合网络的空间小于几十微米时，细胞增殖、分化和ECM分泌等功能将会受到明显的抑制^[40]。本研究通过改变交联时间，调整交联密度，探究其对Gelma/dMECM水凝胶性能的影响。

力学性能对组织工程的支架至关重要，同时还会影响细胞的形态、增殖、迁移等^[41]。实验初步检测了GelMA/dMECM水凝胶的压缩模量，发现随着交联时间的延长其压缩模量增高，从侧面反映了聚合物链的形成越来越密集，不过仍与正常半月板的生物力学有较大差距^[42]，而且过于密集的聚合物网络可能会限制细胞的活动，甚至影响细胞氧气和营养物质的运输^[43]。此外，结果显示交联密度大水凝胶的溶胀率降低，这样其保有组织液内细胞因子等营养物质的能力也会有所下降，可能影响再生修复效果。

良好的细胞相容性是水凝胶在组织工程领域应用的前提。实验选用聚合速率及细胞相容更好的光引发剂LAP和蓝光(波长405 nm)对GelMA/dMECM复合水凝胶进行交联^[25]，结果表明其对细胞活性无明显影响。细胞的聚集有利于细胞的增殖、分化和细胞外基质的沉积^[44]。因此，实验继续探讨了交联密度对细胞形态和聚集的影响，经过7 d的培养发现，交联密度对细胞形态影响的差异不大，可能是由于培养时间不够长，而较小的交联密度对细胞移动的限制更小，有利于细胞的聚集。为了进一步明确细胞在该水凝胶里的生存状态，对交联10 s的水凝胶进行了长时间培养，结果发现培养14 d时的细胞活性达85%，28 d时细胞呈树突状伸展，并且形成了三维网状结构，证明了该水凝胶具有良好的细胞相容性。

实验制备了GelMA/dMECM复合水凝胶并初步探究了交联密度对该水凝胶力学性能、溶胀性、降解性、细胞相容性等性能的影响，总体来说交联10 s的水凝胶性能更为优越。不过该研究仅仅探究了该水凝胶部分基本的性能，其对细胞增殖、分化、细胞外基质的分泌等影响及体内应用的效果仍有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

不同交联密度甲基丙烯酰酯明胶/脱细胞半月板细胞外基质复合水凝胶的性能

Properties of gelatin methacrylate/decellularized meniscus extracellular matrix composite hydrogel with different crosslinking densities

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