2.1  传统脱细胞脂肪组织的制作方案  一般来说，希望在不破坏细胞外基质的结构和功能成分的情况下使用尽可能温和的方法生成脱细胞支架。目前典型的脱细胞化方案包括物理方法(如冻融循环、均质化)、化学方法(如SDS、Triton x-100和EDTA)、生物方法(如胰蛋白酶、核酸酶)。然而，仅使用其中的任何一种都不能做到完全脱细胞化，而这些方法的组合已经被证明可以提高脱细胞效率和脂肪组织结构的完整性^[30]。

FLYNN^[35]是首次使用综合方案制作脱细胞脂肪组织的研究者。具体方案：①将脂肪组织与脱细胞液混合并在搅拌机中搅拌；②在低渗Tris溶液中进行3次冻融(-80-37 ℃)循环，每次循环历时1 h致使细胞膜破坏的同时促使细胞成分和脂质释放，促进后续过程的细胞成分和脂质的去除；③0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA溶液过夜孵化16 h致使裂解精氨酸和赖氨酸的碳侧肽键而除去细胞碎片^[31]；④使用99.9%的异丙醇极性萃取48 h，除去脂质成分；⑤继续使用0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA溶液孵化6 h使得细胞成分完全去除；⑥接下来使用核酸酶(DNase、RNase)和脂肪酶过夜孵化16 h裂解核酸序列和脂质以除去核酸和剩余的脂质；⑦99.9%异丙醇极性萃取8 h以做到完全去除脂质。该方案可使质量为25 g的大块脂肪组织完全脱细胞同时也保留了脱细胞脂肪组织中大量的Ⅳ型胶原(CIV)和层粘连蛋白。该方案损失的细胞外基质蛋白较少，最后获得的水合脱细胞脂肪组织体积与原脂肪组织块体积相近，质量占原脂肪组织块的30%-45%。

CHOI等^[30]利用高速离心和SDS等化学试剂进行脱细胞化。SDS是一种阴离子型洗涤剂，对去除组织中的细胞成分非常有效，但SDS对脂肪组织细胞外基质的结构破坏和蛋白丢失影响较大，特别是层粘连蛋白和糖胺聚糖丢失十分严重。因此尽管该方案去除了细胞成分，但层粘连蛋白和糖胺聚糖含量却丢失严重。

YOUNG等^[36]采用SDS和酶相结合的方案制作脱细胞脂肪组织。该方案成功的保留了Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白。但不足的是DNA去除不足，导致宿主小鼠对脱细胞脂肪组织发生了较严重的免疫排异反应。

BROWN等^[37]用了非离子洗涤剂Triton X-100和异丙醇相结合的方案制备脱细胞脂肪组织。Triton X-100破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质之间的相互作用，但对蛋白质-蛋白质的相互作用没有太大的影响，因此使得细胞外基质蛋白和结构得到了较好的保留^[32]。最后再加入异丙醇去除脂质。该方案处理时间较短，脱细胞脂肪组织的天然胶原结构无较大破坏，同时可以检测到血管内皮生长因子F和糖胺聚糖， 但该方案完全去除了天然脂肪细胞外基质的关键成分-层粘连蛋白。

WANG等^[38]方案是从他们先前肌筋膜脱细胞方法修改而来^[33]。该方案与FLYNN等^[35]的方案十分相似，如极性溶剂萃取。他们将Flynn中的胰蛋白酶改为使用Triton X-100溶液孵化。该方案保留了胶原蛋白和糖胺聚糖和血管内皮生长因子，同时在脱细胞化方面非常成功。但不足的是，处理时间非常长，同时导致层粘连蛋白完全丢失。

SANO等^[34]分别将纯物理方案(冻融)、洗涤剂和酶相结合的方案与Flynn方案进行对比，并对每种方案进行了相应的修改，以确定最佳方法。其中反复冻融的方案是最不成功的，即使将冻融次数增加至18次，细胞成分仍存在。只有延长Flynn方案处理时间才能实现完全脱细胞化，同时能检测到Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白的存在。最终获得的脱细胞脂肪组织体积与原脂肪块体积相近，质量占原脂肪块质量的30%-40%，这与Flynn所报道的相似。同时，SANO等发现即使延长Flynn方案的处理时间，也仅对质量小于0.8 g的脂肪组织才能实现脱细胞化。但他们认为该方案兼顾了脱细胞和保留细胞外基质蛋白，是经典的脱细胞脂肪组织制作方案。

2.2  改良脱细胞脂肪组织制作方案  从表2方案可以总结出，这些方案存在脱细胞时间过长和/或使用了Triton x-100和SDS等洗涤剂。对于洗涤剂，REN等^[41]认为其对细胞外基质蛋白和结构损坏比较大。CEBOTARI等^[42]也认为即使是低浓度的洗涤剂残留也存在细胞毒性，同时会抑制脱细胞脂肪组织功能。同时通过实验发现，即使是薄的组织，如阀瓣叶，也需要多次(超过6次)搅拌洗涤，才能完全去除洗涤剂^[42]。因此残留化学试剂的清除也是一大难题。由于以上原因，WANG等^[39]使用了超临界值二氧化碳设备(Supercritical carbon dioxide，SC-CO₂)。该装备自20世纪70年代以来，一直用于提取海鱼中的鱼油和微藻中的脂质，且食品和药物管理局(the Food and Drug Administration，FDA)认为该装备是安全的。该装备大概示意图2^[39]。大概步骤是将脂肪组织放入反应容器内，然后通过压力泵将CO₂压力调节至18 000 kPa处理3 h。该装备可缩短脱细胞的时间，且除乙醇之外没有加入其他化学物质，因此，该方法可减少化学物质对细胞外基质蛋白的破坏以及制作过程中化学物质引入难以去除的问题^[40]。同时 HE等^[40]在FLYNN^[35]的研究基础上使用了一种新的机械处理方案。该方案是将离心过的脂肪组织与等量的PBS混合后，用双接头接管连接两个内径为1.4 mm的10 mL注射器，将脂肪组织通过该装备以恒定速率10 mL/s转换1 min进行机械乳化。该方案除了降低了脱细胞过程脂质的去除时间，从而缩短了异丙醇的萃取的时间，减少了异丙醇对细胞外基质蛋白和结构的损坏。同时还得到了一种特殊的脂肪组织液体提取物，经过酶联免疫吸附试验证明该提取液中含有高浓度的血管生成因子。体内外实验表明将该提取液与脱细胞脂肪组织相结合后，其再细胞化能力比Flynn制作的脱细胞脂肪组织更高。

2.3  脂肪来源的干细胞辅助脱细胞脂肪组织移植  在FLYNN等^[35]的研究中，与没有接种脂肪干细胞的脱细胞脂肪组织相比，接种脂肪干细胞的脱细胞脂肪组织过氧化物酶体增殖活化受体γ和CCAAT增强结合蛋白α表达增加。CERQUEIRA等^[43]为脂肪干细胞通过旁分泌细胞因子调控宿主体内的内皮细胞，从而促进新生血管的形成。2013年POON等^[44]在首次在小鼠脱细胞脂肪组织移植模型中播种了同种异体脂肪干细胞，通过8周的观察发现，单独移植脱细胞脂肪组织的组，只剩下原脱细胞脂肪组织体积的30%，而接种脂肪干细胞的脱细胞脂肪组织组，体积剩余原体积的48%，但遗憾的是没有与传统的脂肪移植进行对比。2014年，ADAM YOUNG团队^[45]发现，脂肪细胞外基质水凝胶联合人脂肪干细胞在无胸腺小鼠模型中可刺激血管生成和脂肪生成。在2015年，HAN团队^[46]在免疫能力强大的大鼠脱细胞脂肪组织移植模型中加入了异体脂肪干细胞，发现脱细胞脂肪组织在体内成脂和成血管能力加强的原因可能与异体脂肪干细胞介导了炎症反应，促进了成脂能力强的CD163+的M2型巨噬细胞生成，从而促进了脂肪和血管的生成。然而，由于脂肪干细胞可能存在致瘤的风险，导致该方案的临床应用存在巨大的安全问题^[47]。

2.4  生长因子辅助脱细胞脂肪组织移植  CHOI等^[48]、 TURNER等^[49]研究表明脱细胞脂肪组织无论是体外或体内实验，其诱导成脂能力并不令人满意。2014年TING   等^[50]认为导致这种情况的原因可能与血管生成不足有关，因此，其将碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子BB“绑定”至脱细胞脂肪组织上，发现脂肪组织的体积有显著增加。但直接将生长因子“绑定”至脱细胞脂肪组织上可导致生长因子快速耗尽。而组织移植早期快速建立血供需要稳定而持久的生长因子刺激。LU等^[51-52]为了弥补以上的不足，通过研究发现肝素可以增加碱性成纤维细胞生长因子的“绑定”数量，并控制碱性成纤维细胞生长因子的释放。结果表明，与肝素交联后的脱细胞脂肪组织再与碱性成纤维细胞生长因子“绑定”后，此种脱细胞脂肪组织的成脂能力和抗降解能力有明显上升。但ZENG等^[53]、BERNARDES等^[54]认为在多种肿瘤发生和发展过程中，生长因子(如碱性成纤维细胞生长因子)起着关键性的作用，如肺癌等，因此细胞因子的安全性仍受到不少学者的质疑。

2.5  添加脱细胞生物支架制备过程中损耗的细胞外基质蛋白  ZHOU等^[55]通过对比髓核组织脱细胞前后细胞外基质蛋白的差异发现髓核脱细胞后糖胺聚糖与胶原蛋白的比值有所下降，其查阅文献发现主要是由于糖胺聚糖含量下降所引起。因此他们将糖胺聚糖蛋白加入至髓核脱细胞组织中，观察到脱细胞髓核支架(decellularized nucleus pulposus，dNP)的刚度与新鲜髓核组织的相似，且脂肪干细胞向髓核组织分化能力也有所增高。其可能机制可能是由于糖胺聚糖的生物学作用：①有很大的黏滞性，具有润滑和保护作用；②具有促进新生血管生成、组织再生的作用。但在这类方案在脱细胞脂肪组织移植中尚未见报道，若能对比脂肪组织脱细胞前后细胞外基质蛋白的差异，从而加强宿主细胞募集或调整脱细胞脂肪组织刚度的角度添加层粘连蛋白或糖胺聚糖等，可能对脱细胞脂肪组织移植后的血管及脂肪再生有一定的促进作用。

2.6  脱细胞脂肪组织水凝胶的制作方案  脱细胞脂肪组织支架在机体内的降解原因与基质金属蛋白酶或分解细胞外基质蛋白相关的细菌、酶渗入至脱细胞脂肪组织有关^[51-52]。化学交联剂可通过增加脱细胞脂肪组织中的蛋白质含量而提高了脱细胞脂肪组织的抗降解能力^[56]。WU等^[56]通过在水凝胶中加入了1-乙基3-(3-二甲基胺丙基)盐酸二亚胺，体外实验表明，该水凝胶支持脂肪干细胞的生长和分化。大鼠模型表明，交联剂增加水凝胶对酶降解的抗性，且促进宿主细胞迁移、脂肪组织发育和血管形成。通过长期的动物实验发现，该水凝胶形成了高度血管化的脂肪组织。LI等^[57]首先通过将脱细胞脂肪组织与硫醇-丙烯酸脂通过迈克尔加成反应聚合成水凝胶，然后再与聚乙二醇交联。结果表明该水凝胶提高了脂肪干细胞的增殖速度和向脂肪分化的能力。

丝素蛋白由于具有良好的生物相容性、在机体降解速度缓慢、炎症反应小和机械能力好等优点，在组织工程中得到了越来越多的应用。2007年，MAUNEY等^[58]通过将丝素蛋白、胶原蛋白、聚乳酸3种支架做对比，检测三者的成脂和抗降解能力发现，3种支架在体外诱导成脂能力没有太多差距，但经过4周的体内实验发现，丝素蛋白支架仍然存在，而胶原蛋白和聚乳酸支架在植入后降解迅速。2009年，KANG等^[59]也认为丝素支架由于降解速度缓慢，使得软组织持续生长成为可能。2017年，KAYABOLEN等^[60]将脱细胞脂肪组织与丝素通过涡旋作用聚合成水凝胶提高脱细胞脂肪组织的刚度并增强其早期的血管再生能力，和远期成脂效率。然而，大多数交联剂存在成本高和有细胞毒性的缺点，因此受到大多数学者的质疑。

YOUNG等^[36]、ZHAO等^[61]在不添加交联剂的前提下，制作出脱细胞脂肪组织水凝胶。其水凝胶的制作大概分为两个部分：脂肪组织脱细胞化、凝胶化。①脂肪组织脱细胞化：YOUNG等使用的脱细胞方案是将洗涤剂(SDS、脱氧胆酸钠)和酶相结合；ZHAO等使用的脱细胞方案与BROWN等^[37]相似；②凝胶化：使用的方法是将脱细胞脂肪组织冻干并碾磨成粉，再用胃蛋白酶和盐酸溶液溶解，最后用氢氧化钠中和。该凝胶在4 ℃时为流动的液体状，在37 ℃下60 min凝胶化。但POON等^[44]认为在水凝胶的制备方案中加盐酸，可能会对细胞外基质蛋白造成破坏，因此他们制作了不需添加交联剂的水凝胶时改用较为温和的醋酸来参与蛋白的溶解与凝胶化。该水凝胶的制作大概分为3个部分：脱细胞化、蛋白萃取、凝胶化。主要思路为：①去除细胞成分降低免疫反应；②使用尿素缓冲液和胍-盐酸缓冲液将细胞外基质中的蛋白提取出来；③使用胃蛋白酶和醋酸将蛋白质溶解，加入NaOH将溶液调至中性并使其凝胶化。该水凝胶在4 ℃为液体状，在37 ℃温度下放置15 min左右即可成凝胶状。此方案避免了交联剂和酸性物质对细胞外基质蛋白的破坏，但此制作方案由于需要3次透析因而增加了成本，同时该方案制备也较繁琐。

组织工程是目前最有前途的人体组织和器官重建的方法。传统的组织工程主要通过两种方法来实现组织和器官的再生：①通过种子细胞和支架材料结合在体外构建新生组织并植入体内；②通过体内植入支架材料募集宿主细胞，诱导原位组织新生。通过以上方法，科学家和外科医生在修复人体各种组织，包括骨^[1]、膀胱^[2]、鼻软骨^[3-4]、血管和阴道方面取得了重要突破^[5-6]。1973年，组织去细胞化技术首次报道用于为烧伤患者^[7]。1989年，脱细胞材料支架在小肠黏膜下层血管应用的研究中^[8]，表明组织去细胞化以成为组织工程的热点。同时从真皮^[9]、心血    管^[10-13]、肌肉骨骼^[14]、肝脏^[15]、小肠黏膜下层和心脏瓣膜等中提取的脱细胞细胞外基质已被探索出并部分已在临床上使用^[16-22]，且已被证明有助于组织的整合和修复。

当前脂肪移植是软组织填充的首要方案，但自体脂肪转移技术有一些局限性：①不适用于填充量较大同时又存在自身脂肪组织容量有限的患者(如：恶病质患者接受乳腺癌根治术后进行乳房再造)；②脂肪移植后的保留率不稳定，持久性不长。有研究表明，在进行脂肪移植后6个月内，脂肪组织由于在吸收，其总体积可以减少10%-90%不等^[23]，因此通常需要进行多次手术以维持所需效果。近年来，透明质酸、类人胶原蛋白等可注射型填充剂在美容手术中得到了广泛的应用^[24]。然而，这些物质不能与周围组织结合并诱导组织再生，因此在体内被迅速吸收。为了保持长期效果，这些材料需要反复注射，但同时会增加栓塞、过敏等不良反应的风险^[25]。因此需要一种更安全、更具有生物相容性且生存更加持久的软组织填充材料。

通过脱细胞脂肪组织(decellularizad adipose tissue，DAT)构建无种子细胞的组织工程脂肪为当前软组织填充的研究热点。在此，首先需要了解脂肪组织中的非细胞成分，主要成分包括细胞外基质蛋白和细胞因子^[26]。细胞外基质蛋白主要含有Ⅰ胶原蛋白、Ⅵ型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖^[27]。研究表明，细胞外基质蛋白可以影响脂肪干细胞的迁移、生长及分化，这为脱细胞脂肪组织在脂肪组织工程中的应用奠定了基础^[28]。同时，大量的脂肪组织在腹部成形术、抽脂术、体轮廓术和乳房缩小术中作为医疗废物被丢弃^[26]。由于细胞外基质蛋白的低免疫原性，使异种脱细胞脂肪组织在软组织修复及美容填充中应用成为可能^[29]。以上充分说明脱细胞脂肪组织具有强大的临床应用前景。

传统的脱细胞脂肪组织制备方案是将物理方法、化学试剂以及生物试剂相结合达到去除脂肪组织中含有抗原成分的细胞和脂质成分而保留细胞外基质蛋白和三维结构。但当前脱细胞脂肪组织临床应用的限制在于：①未研究出完美的去细胞方案-完全去除具有抗原性能的细胞和脂质成分，同时保留细胞外基质蛋白和三维结构；②脱细胞脂肪组织植入体内后，缺乏充足的血供和稳定的成脂诱导因素。文章综述总结了从2010至2018年所有的脱细胞脂肪组织制备方案^[30-34]，为后续学者研究脱细胞脂肪组织带来便利。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  资料来源  检索1971年1月至2018年12月 PubMed数据、Elseveir数据库相关文献，英文检索词为“adipose tissue engineering；adipose tissue extracellular matrix；soft tissue repair；angiogenesis；adipogenic induction”。

1.2  检索方法

纳入标准：①与脱细胞脂肪组织制备方法相关的文献；②与交联细胞因子和生物材料相关的文献。

排除标准：重复性文献和与此次研究目的不密切的文献。

质量评估：经过对检索词进行分别或组合检索到的200余篇文献，通过阅读文题及摘要，最终选择62篇文献进行讨论分析。文献检索流程图见图1。

1.3  脱细胞脂肪组织相关内容介绍  传统脱细胞脂肪组织制备方案见表1；改良脱细胞脂肪组织制备方案见表2。

3.1  脱细胞脂肪组织的临床应用前景  从临床需求出发，研发可异体注射并具有募集宿主细胞，原位诱导血管和脂肪新生能力的生物支架是非常有临床意义的。脱细胞脂肪组织是近年发展起来的一种新型生物支架材料，在脂肪组织工程中的应用前景十分广阔。与合成或生物聚合物的支架相比，脱细胞脂肪组织的主要优点是其天然的成脂诱导特性，可以诱导脂肪干细胞向脂肪组织定向分化。脱细胞脂肪组织当前的临床应用优势有：①脱细胞脂肪组织通过去除有免疫能力的细胞和脂质成分而保留细胞外基质的主要成分和结构为细胞的生长和分化提供了合适的条件；②去除具有免疫能力的细胞和脂质成分是自体、异体甚至异种脂肪组织工程应用的基础；③脂肪组织来源丰富，易于获取，使得脱细胞脂肪组织在临床中可以大量的制备；④成本低、不需反复注射。

3.2  需克服的障碍  与其他已被应用到临床的脱细胞组织相比，当前脱细胞脂肪组织的制作方案仍不成熟，其局限主要表现在：①化学试剂和酶的生物安全性：目前脱细胞脂肪组织制备多需要化学试剂(如SDS、Triton x-100、异丙醇)和酶(如胰蛋白酶、核酸酶)的参与，这些化学试剂的联合使用，尽管可以提高脂肪组织脱细胞的效率，但对脱细胞脂肪组织的结构和成分产生不利影响。尤其是洗涤剂，其使得细胞外基质蛋白中层粘连蛋白严重丢失，导致脱细胞脂肪组织诱导间充质干细胞脂肪分化下降^[62]。同时，残留的化学试剂和酶存在细胞毒性。在没有找到新方案脱细胞化之前，开发一种可以检测脱细胞脂肪组织中残留化学试剂和酶的方案也是必须的。②免疫排斥反应：一方面，现有的脱细胞方案，对小质量的脂肪组织能完全脱细胞化。而对于大质量的脂肪组织会出现脱细胞化不彻底，使得脱细胞脂肪组织存在潜在的免疫排斥风险-脱细胞脂肪组织植入体内未完全重塑就被吸收。另一方面，基于伦理考虑，评估脱细胞脂肪组织支架在体内的转归多以大鼠或灵长类动物为模型，由于物种间的差异性，大鼠和灵长类动物对脱细胞脂肪组织材料的免疫应答不同于人体。③制作方法复杂，成本较高且产量低：脱细胞脂肪组织的制备涉及多个步骤、多种试剂，且耗时长。产量低是另一问题，Flynn使用的无洗涤剂萃取方案-对细胞外基质蛋白破坏较小-脱细胞脂肪组织质量占原脂肪质量的30%-45%。而通过机械或者洗涤剂处理获得的脱细胞脂肪组织，细胞外基质蛋白破坏更加严重，其脱细胞脂肪组织质量剩余更加少。④生物学效能差：目前制备出的脱细胞脂肪组织促进宿主细胞迁移增殖能力较差，需要联合细胞因子和/或交联剂增加脱细胞脂肪组织的生物学效能，但细胞因子和交联剂的安全性仍受到质疑，如细胞因子容易不可控导致肿瘤以及交联剂对细胞的毒性作用。

因此未来仍需开发出一种避免使用化学试剂和酶的脱细胞方案，同时该方案既完整保留细胞外基质蛋白和结构又完全去除细胞和脂质成分。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
细胞外基质(extracellular matrix，ECM)：是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质是动物组织的一部分，不属于任何细胞，它决定结缔组织的特性，对于一些动物组织的细胞具有重要作用。
脱细胞脂肪组织：脂肪组织移植已成为整形外科及修复重建领域重要的手段，广泛用于软组织缺损的修复和以美容为目的的软组织填充。来源于脂肪组织由细胞外基质组成的脱细胞基质已成为脂肪医学一个新的发展方向，展示出良好的应用前景。脂肪组织脱细胞基质的产生原因可以分为物理性、化学性、酶学以及多种方法的联合，不同的方法对脂肪组织清除细胞的效果不同，对细胞外基质的影响也不同，最终会使宿主对移植的脱细胞材料产生的反应不同，进而影响脱细胞产品的安全性和有效性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

从临床需求出发，研发可异体注射并具有募集宿主细胞，原位诱导血管和脂肪新生能力的生物支架是非常有临床意义的。脱细胞脂肪组织是近年发展起来的一种新型生物支架材料，在脂肪组织工程中的应用前景十分广阔。与合成或生物聚合物的支架相比，脱细胞脂肪组织的主要优点是其天然的成脂诱导特性，可以诱导脂肪干细胞向脂肪组织定向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程