血管内皮祖细胞对共植入缺血再灌注模型大鼠神经干细胞增殖、凋亡和血管重建的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
内皮祖细胞：是一种多能干细胞，在骨髓以及外周血中广泛存在。在损伤信号的诱导下，内皮祖细胞可以聚集到血管损伤部位，通过分化形成大量的成熟内皮细胞，积极参与到血管新生以及修复过程中。内皮祖细胞还具有旁分泌功能，可以有效改善神经干细胞移植后的生存条件，对促进神经干细胞增殖和存活等具有重要意义。
缺血再灌注损伤：是指对组织造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内的细胞造成的，这种损伤叫做“组织缺血再灌注损伤”，缺血所引的组织损伤是致死性疾病的主要原因，诸如冠状动脉硬化导致的心肌梗死、脑卒中等。

摘要
背景：神经干细胞移植在缺血性脑血管疾病治疗中的作用已经明确，但细胞不能在移植局部存活等问题限制了进一步的应用。
目的：探讨血管内皮祖细胞对共植入缺血再灌注模型大鼠神经干细胞增殖、凋亡和血管重建的影响。
方法：125只SD大鼠随机分为5组，假手术组、缺血对照组、神经干细胞组、神经干细胞+血管内皮祖细胞组、血管内皮祖细胞组，每组25只。线栓法制备缺血再灌注大鼠模型，并进行分组干预。移植后1，2，3，4，5周，检测各组神经干细胞增殖、凋亡以及缺血区血管新生情况。
结果与结论：①移植后不同时间点，血管内皮祖细胞组、缺血对照组、假手术组均未观察到BrdU阳性细胞。神经干细胞+血管内皮祖细胞组的BrdU阳性细胞数显著高于神经干细胞(P < 0.05)；②移植后不同时间点，神经干细胞+血管内皮祖细胞组和神经干细胞组可观察到BrdU⁺/Caspase-3⁺双标阳性细胞。神经干细胞+血管内皮祖细胞组的细胞凋亡率显著低于神经干细胞组(P < 0.05)；③移植后不同时间点，假手术组均未见新生血管，其他4组均出现新生血管。神经干细胞+血管内皮祖细胞组的血管新生数量显著多于其他各组(P < 0.05)；④结果表明，血管内皮祖细胞可以促进共植入缺血再灌注模型大鼠缺血半暗带的神经干细胞增殖，抑制细胞凋亡，并促进缺血区血管新生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8410-2535(杨纯生)

关键词: 干细胞, 移植, 缺血性脑病, 缺血再灌注, 血管内皮祖细胞, 神经干细胞, 干细胞移植, 细胞增殖, 细胞凋亡, 血管新生

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cell (NSC) transplantation is a common method for various ischemic
encephalopathies, but inability to survive in the transplantation region limits its further use in clinical practice.
OBJECTIVE: To explore the effect of vascular endothelial progenitor cells (VEPCs) on the proliferation and apoptosis of co-cultured NSCs as well as vascular remodeling in rats with ischemia reperfusion injury.
METHODS: 125 Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups, 25 rats in each group, including sham operation, ischemia, NSCs, co-culture, and VEPCs groups. Rat models of ischemia reperfusion injury were made in all groups except for the sham operation group, followed by corresponding interventions. The proliferation and apoptosis of neural stem cells were detected, and vascular remolding in the ischemic region was observed in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: At different time points after transplantation, BrdU positive cells were not observed in VEPCs, ischemia and sham operation groups; the number of BrdU positive cells in the co-culture group was significantly higher than that in the NSCs group (P < 0.05); BrdU+/Caspase-3+ cell were observed in both co-culture and NSCs groups, and the apoptosis rate of the co-culture group was significantly lower than that in the NSCs group (P < 0.05); there were new blood vessels in all the groups except for the sham operation group, and the number of new bone vessels was highest in the co-culture group. To conclude, our experimental results show that VEPCs promotes the proliferation of co-cultured NSCs, inhibits cell apoptosis and and promote angiogenesis in the ischemic penumbra of rats with ischemia reperfusion injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Reperfusion Injury, Neural Stem Cells, Cell Proliferation, Apoptosis, Neovascularization, Physiologic, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 血管内皮祖细胞培养结果 原代培养2 d，大部分细胞贴壁生长；培养7 d，细胞呈长梭形，并具有典型集落形态，第3代细胞变得细长，开始出现细杆状或条梭状 (图1)。

2.2 神经干细胞培养结果 原代培养7 d，形成质地紧密的细胞球，且可观察到少量细胞碎片和死亡细胞，第3代细胞呈球形，表面绒毛状突起明显，细胞生长状态良好，见图2。

2.3 血管内皮祖细胞与神经干细胞共建体形态 经免疫荧光染色观察，可见共移植体细胞团不规则，绿色神经干细胞被红色血管内皮祖细胞包绕或相互粘贴，见图3。

2.4 移植后不同时间点神经干细胞增殖情况 移植后不同时间点，内皮祖细胞组和缺血对照组以及假手术组均未观察到BrdU阳性细胞。内皮祖细胞+神经干细胞组和神经干细胞组可观察到BrdU阳性细胞。细胞增殖随时间推移出现一定的变化，移植后2周BrdU阳性细胞数最多，之后逐渐下降(图4)。移植后不同时间点内皮祖细胞+神经干细胞组的BrdU阳性细胞数均显著高于神经干细胞组(P < 0.05)，见表1。

2.5 移植后不同时间点神经干细胞凋亡情况 移植后不同时间点，假手术组均未见阳性细胞，内皮祖细胞组和缺血对照组可观察到大量的Caspase-3单标阳性细胞，内皮祖细胞+神经干细胞组和神经干细胞组则可观察到双标阳性细胞。随着移植时间的推移，内皮祖细胞+神经干细胞组和神经干细胞组的细胞凋亡率逐渐下降(图5)。移植后不同时间点内皮祖细胞+神经干细胞组的细胞凋亡率均显著低于神经干细胞组(P < 0.05)，见表2。

2.6 移植后不同时间点各组新生血管数量 移植后不同时间点，假手术组均未见新生血管，缺血对照组、内皮祖细胞组、神经干细胞组、内皮祖细胞+神经干细胞组均出现新生血管。内皮祖细胞+神经干细胞组移植后3周达到最大值，其他3组在移植后2周达最大值，之后数量逐渐下降(图6)。移植后不同时间点内皮祖细胞+神经干细胞组的血管新生数量均显著大于其他各组(P < 0.05)，其他各组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

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引言

缺血性脑血管病的发病率逐年增高，已成为目前世界上致死、致残率较高的疾病之一，其脑内神经细胞在损伤后的自我修复能力有限，常规治疗大多无法获得理想的效果^[1]。神经干细胞是来源于中枢神经系统的多能干细胞，终身具有自我更新能力，可以说神经干细胞是神经系统形成和发育的源泉^[2]，其参与神经系统损伤的修复或正常细胞凋亡的更新。将神经干细胞以组织工程技术移植入受损的中枢神经系统，利用其自身的增殖和分化潜能使受损神经组织的结构和功能得到修复，替代丢失、坏死的神经细胞，分泌神经营养因子，重新构建神经通路，从而达到治疗疾病的目的^[3]。但是神经干细胞移植后成活率和神经元转化率较低严重制约了临床上的应用，主要因为神经干细胞分泌神经因子的能力较弱，导致细胞间微信号调节中断以及营养供应不足等，发生细胞凋亡^[4]。1997 年， Asahara学者首次提出“内皮祖细胞”这一概念。内皮祖细胞是一种多能干细胞，广泛存在于骨髓以及外周血中。在损伤信号的诱导下，内皮祖细胞可以聚集到血管损伤部位，通过分化形成大量的成熟内皮细胞，并积极参与血管的新生以及修复^[5]。内皮祖细胞还具有旁分泌功能，可以有效改善神经干细胞移植后的生存条件，对促进神经干细胞增殖和成活等具有十分重要的意义^[6]。实验通过构建血管内皮祖细胞+神经干细胞复合体，然后移植到缺血再灌注大鼠缺血半暗带，观察神经干细胞增殖、凋亡以及缺血半暗区血管形成情况。

材料方法

1.1 设计 体外细胞培养与随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年8至12月在新乡医学院第三附属医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 纳入雄性SD大鼠125只，12周龄，体质量250-350 g；新生24 h内SD大鼠20只用于分离培养神经干细胞；雄性SD大鼠10只用于分离培养内皮祖细胞，体质量350 g左右，均饲养于新乡医学院第三附属医院动物中心SPF环境。研究方案符合相关伦理学要求。

1.3.2 主要试剂与仪器 DMEM/F12培养基(北京百奥森泰生物技术有限公司)；表皮生长因子(上海北诺生物科技有限公司)；B27(上海拜力生物科技有限公司)；5-BrdU单克隆抗体(北京杰辉生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(广州市安杰生物技术有限公司)；胰蛋白酶(上海源培生物科技股份有限公司)；微量注射器(北京三博远志生物技术有限责任公司)；二氧化碳培养箱(上海慧颖生物科技有限公司)；无菌工作台(维森特生物技术(南京)有限公司)；离心机(上海博耀生物科技有限公司)；立体定位仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 将125只SD大鼠随机分为5组，每组25只，分别为假手术组、缺血对照组、神经干细胞组、内皮祖细胞组、内皮祖细胞+神经干细胞组。

1.4.2 神经干细胞培养^[7] 麻醉后获取新生24 h内SD大鼠海马组织，眼科剪剪碎后进行机械吹打，过滤、离心，去掉上清液，添加完全神经干细胞培养液(DMEM/F12培养基，表皮生长因子、B27)，吹打制备细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹后接种于培养瓶中，置于CO₂培养箱进行培养，每隔2 d换液1次，连续培养7 d后进行传代，收集第3代细胞进行后续实验。采用免疫组织化学法Nestin染色鉴定神经干细胞。

1.4.3 血管内皮祖细胞培养^[8] 采集10 mL SD大鼠动脉血，离心后吸取第2层单核细胞，PBS洗涤，制备细胞悬液，以3×10⁵的细胞密度接种在塑料培养皿中，添加DMEM/F12培养基，置于CO₂培养箱进行培养，每隔4 d换液1次，连续培养7 d后进行传代，收集第3代细胞进行后续实验。

1.4.4 建立血管内皮祖细胞与神经干细胞共建体^[9] 收集第3代血管内皮祖细胞，用胰蛋白酶消化后获得单细胞，以细胞浓度为6×10⁸ L^-¹接种在培养瓶中，观察细胞生长情况，待细胞贴壁后吸出培养液，涂一层细胞外基质后接种神经干细胞(细胞浓度为6×10⁸ L^-¹)，加入完全神经干细胞培养液，连续培养3-6 h，观察神经干细胞全部贴壁后吸出培养液，涂一薄层细胞外基质，再接种于上述相同浓度的内皮祖细胞，加入完全神经干细胞培养液，共培养12-24 h，观察到接种的内皮祖细胞贴壁，变为椭圆形或不规则形，用细胞刮刀将细胞从瓶壁上依次刮起，吹打成含有1-3个内皮祖细胞团与5-18个神经干细胞相互包绕的细胞团，筛网过滤，取筛网上细胞团即为共移植复合体，保存备用。

1.4.5 缺血再灌注大鼠模型制备 采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型^[10]，模型制备完毕后，待动物清醒，对其进行神经缺损评分，大鼠在行走过程中出现身体向偏瘫侧转圈的现象，则视为模型制备成功。假手术组只做颈部切口，随即缝合，不作其他处理。

1.4.6 分组干预 模型制备成功后6 h，神经干细胞组、内皮祖细胞组、内皮祖细胞+神经干细胞组分别移植3种细胞悬液10 μL。移植前神经干细胞、内皮祖细胞、内皮祖细胞+神经干细胞共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中，调整细胞的总浓度为2×10¹⁰ L^-¹。在立体定位仪下，使用微量注射器从缺血侧缺血半暗带区进针，进针后5 min缓慢注射细胞悬液，留针10 min后缓慢拔出针头。

1.4.7 神经干细胞增殖、凋亡检测 移植后1，2，3，4，5周，分别取各组大鼠5只，麻醉后处死，获得缺血区组织，制备切片，进行BrdU阳性细胞免疫组化检测和BrdU/Caspase-3免疫荧光双标染色。BrdU阳性细胞免疫组化检测：切片常规脱蜡至水，微波修复后添加小鼠抗大鼠BrdU一抗，4 ℃过夜，PBS洗涤，加入生物素化山羊抗小鼠IgG，25 ℃孵育，PBS洗涤，DAB显色，复染后置于镜下计数BrdU阳性细胞。免疫荧光双标染色：石蜡切片常规下行入水，加入BrdU抗体和caspase-3抗体，4 ℃过夜，用含0.1% TritonX-100的PBS洗涤3次，加入Cy3和FITC的二抗，37 ℃孵育，磷酸缓冲液甘油封固。荧光显微镜下拍照，计数阳性细胞。

1.4.8 新生血管检测 移植后1，2，3，4，5周，分别取上述各组5只大鼠缺血区组织，制备切片，利用血管内皮生长因子免疫组织化学法检测新生血管数量。

1.5 主要观察指标 ①血管内皮祖细胞与神经干细胞培养结果；②移植后不同时间点各组神经干细胞增殖数量；③移植后不同时间点各组神经干细胞凋亡率；④移植后不同时间点各组缺血区新生血管数量。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0进行t 检验统计学处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响，细胞移植后存活情况不佳等问题影响到实际的治疗效果^[11-15]。神经干细胞植入缺血区域之后，无法分泌足够的神经因子使细胞营养供应不足以及细胞间的微信号调节发生中断，引发细胞凋亡基因表达^[16-19]。为此，需要为神经干细胞提供良好的生长环境，促进细胞增殖，以提高神经干细胞的移植效果^[20]。内皮祖细胞在一定条件下可分化为成熟的内皮细胞，参与到血管再生等过程^[21-22]。内皮祖细胞还可以通过自身的分泌功能分泌出大量细胞因子，包括粒巨细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子以及血管内皮生长因子等^[23-26]。在内皮祖细胞发生分化成熟之后，也可以继续分泌一些可溶性的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子以及胰岛素样生长因子等^[27-28]。众多细胞因子对神经干细胞的增殖和凋亡等产生极大的影响，其中血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子等能有效促进神经干细胞的增殖，并抑制细胞凋亡^[29-30]。孙剑瑞等^[31]从孕15 d鼠胚胎脑室下区组织分离神经干细胞，培养于DMEM/F12+B27细胞基础培养液中，加入碱性成纤维细胞生长因子作为阳性对照组，实验组分别加入10，20，50μg/L的神经生长因子，无添加成分作为阴性对照组。结果表明，合适浓度神经生长因子能促进神经干细胞的增殖，随神经生长因子浓度的增高，促神经分化作用增强，随着神经生长因子浓度的增加，其促神经干细胞凋亡作用增强。以往刘建民等^[32]报道，神经干细胞与血管内皮祖细胞能向脑卒中损害区域趋化，局部微环境诱导两者启动神经新生与血管新生修复损伤，并且血管新生与神经新生能相互促进，从而为有效解决缺血性脑卒中后神经元缺失与血管闭塞这两个病理损害提供了一种新的途径。

实验结果显示，移植后不同时间点，内皮祖细胞组和缺血对照组以及假手术组均未观察到BrdU阳性细胞。移植后不同时间点内皮祖细胞+神经干细胞组的BrdU阳性细胞数均显著高于神经干细胞组(P < 0.05)。移植后不同时间点，内皮祖细胞+神经干细胞组和神经干细胞组则可观察到BrdU⁺/Caspase-3⁺双标阳性细胞。杜公文等^[33]探讨体外共培养下血管内皮祖细胞对神经干细胞增殖及分化的影响，以单纯的神经干细胞培养为对照，共培养的神经干细胞球数目实验组明显多于对照组，直径也呈现出大于对照组的趋势；共培养的神经干细胞神经元分化率明显高于对照组，说明血管内皮祖细胞在体外能促进神经干细胞增殖并诱导其向神经元分化。

实验结果还显示，随着移植时间的推移，内皮祖细胞+神经干细胞组和神经干细胞组的细胞凋亡率逐渐下降。移植后不同时间点内皮祖细胞+神经干细胞组的细胞凋亡率均显著低于神经干细胞组。分析出现这一结果的原因，可能是内皮祖细胞通过旁分泌机制，为神经干细胞的增殖提供了所需的生长因子，有效改善了细胞的生存条件，为细胞生长提供了良好的微环境^[34]。神经干细胞移植到缺血区之后，可以通过分化增殖，促进血管新生和神经再生，达到治疗疾病的目的^[35]。血管新生和神经再生是通过相同的因子进行调控协同和信号的相互联系，例如转化生长因子和血管内皮生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子等^[36-38]，有效保护神经干细胞，促进新生血管形成。移植后不同时间点，缺血对照组、内皮祖细胞组和神经干细胞组、内皮祖细胞+神经干细胞组均出现新生血管。内皮祖细胞+神经干细胞组的血管新生数量均显著大于其他各组(P < 0.05)，表明血管内皮祖细胞与神经干细胞共建体植入缺血半暗带后血管新生数量明显高于单纯内皮祖细胞移植，这也说明血管新生和神经发生具有协同作用。

综上所述，血管内皮祖细胞与神经干细胞共建体植入脑缺血半暗带，血管内皮祖细胞所分泌的因子可以促进新生血管形成，也为移植神经干细胞的生存提供了良好的微环境，从而实现血管再生与神经发生的协同一致，更好地发挥出修复神经缺损以及神经替代作用。