1.1 设计 细胞学实验观察。
1.2 时间及地点 实验于2018年7月至2019年4月在徐州医科大学脑病生物信息重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验材料 人胚胎干细胞系H9、pAdTrack-AKT1荧光质粒由作者所在实验室保存。
1.3.2 实验试剂 mTeSR1培养基、消化酶Accutase、Y-27632(STEMCELL公司);基质胶Matrigel(Corning
BioCoat公司);转染试剂Lipofectamine 3000、Opti-MEM 1减血清培养基、免疫荧光二抗(Invitrogen公司);反转录试剂及定量PCR试剂(Takara公司);SOX2、OCT4、AKT1抗体(Cell Signaling
Technology公司);定量PCR引物(上海生工合成)。
1.3.3 实验仪器 荧光显微镜(Olympus,日本);流式细胞仪(BD,美国);激光共聚焦荧光显微镜(Zeiss,德国);PCR扩增仪2720 Thermal
Cycler(Applied Biosystems,美国);稳压/稳流DNA电泳仪(Bio-Rad,美国);细胞培养箱(Thermo,美国);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司,中国)等。
1.4 实验方法
1.4.1 人胚胎干细胞的复苏、培养及鉴定 采用无饲养层培养条件,细胞培养皿表面均经Matrigel包被过夜。取出冻存于液氮中的人胚胎干细胞系H9,在37 ℃水浴中快速震荡溶解至有少许冰残留;吸取冻存液,逐滴加入人胚胎干细胞培养基mTeSR1,轻摇混匀,1 000 r/min离心5 min后弃上清,用mTeSR1重悬混匀,接种于包被好Matrigel的细胞培养皿表面,每天换液。细胞使用Accutase初步消化后,用枪头机械刮取细胞碎片,以1∶4的比例传代,约7 d传代1次。
1.4.2 人胚胎干细胞的传代
吸弃培养基,加入复温的Accutase消化酶,显微镜下观察克隆边缘的细胞皱缩,克隆内部有裂痕,吸弃Accutase,进行下一步处理:①小克隆传代法:立即终止消化,加入mTeSR1,用枪头轻轻吹打使细胞形成细小碎片,接种至6孔板;②单细胞传代法:将培养皿放入37 ℃恒温箱,等待约1 min后取出,细胞呈单个状态,加入含10 μmol/L Y-27632的mTeSR1轻轻吹打混匀,接种至6孔板,放置于37 ℃,体积分数为5%CO2培养箱培养。
1.4.3 人胚胎干细胞的转染及转染效率检测 当细胞汇合度达到30%-60%(传代48 h后)时进行转染。取2个无菌1.5 mL Eppendorf管,分别加入125 μL Opti-MEM 1减血清培养基,其中一管加入适量Lipofectamine
3000轻柔混匀;另一管加入pAdTrack-AKT1荧光质粒(10 660 bp),涡旋混匀后逐滴加入含Lipofectamine
3000的混合液中,室温孵育10-15 min,形成脂质体复合物。将脂质体复合物逐滴加入培养基,轻轻摇动细胞培养板,使复合物分散均匀。在37 ℃,体积分数为5%CO2培养箱内培养48 h,流式细胞仪检测转染效率。
1.4.4 细胞免疫荧光检测SOX2、OCT4的表达 人胚胎干细胞用37 ℃的PBS洗5遍,40 g/L多聚甲醛4 ℃固定 20 min,吸弃多聚甲醛,常温PBS洗后封闭。一抗稀释于含3% BSA和0.3% Triton-100的PBS(SOX2 1∶400稀释,OCT4 1∶800稀释),4 ℃避光过夜,次日室温30 min复温,常温PBS清洗后孵育二抗(1∶500稀释),避光2 h,DAPI染核5 min,常温PBS清洗后荧光显微镜观察。
1.4.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测AKT1的mRNA表达 Trizol法收集转染后人胚胎干细胞,按照试剂盒说明书进行实验,提取总RNA样本、反转录并进行RT-qPCR实验,检测AKT1的mRNA水平。RT-qPCR程序为预变性95 ℃ 30 s;变性95 ℃ 5 s,退火60 ℃ 30 s(40次循环);每个样本均设置3个重复。引物见
表1。
1.4.6 蛋白质印迹实验(Western blot)检测AKT1的蛋白表达 转染后的人胚胎干细胞加入匀浆液,细胞总蛋白质 (20 μg)于10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,100 V电压转膜70 min,室温下3% BSA封闭3 h,鼠抗人AKT1抗体(1∶2 000稀释) 4 ℃孵育过夜后,鼠二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h。内参蛋白抗体选用兔抗人GAPDH (1∶2 000稀释)。Quantity One图像分析软件对蛋白条带进行扫描分析,以GAPDH为参照,AKT1表达的相对含量以目的条带与内参条带灰度值的比值表示。
1.5 主要观察指标 ①荧光显微镜观察人胚胎干细胞转染AKT1质粒后的荧光表达;②流式细胞仪检测细胞转染效率;③RT-qPCR检测AKT1的mRNA表达;④Western blot检测AKT1的蛋白表达。
1.6 统计学分析 实验数据均以
x(_)±
s表示。组间均数比较采用独立样本
t 检验,
P < 0.05为差异有显著性意义。统计分析用SPSS 16.0软件,图表制作用GraphPad Prism 7.0软件。