血小板源性生长因子B基因转染抑制缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (38): 6090-6098.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.005

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血小板源性生长因子B基因转染抑制缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡

陈邦党¹，陈小翠¹，马依彤^1，2，杨毅宁^1，2，马翔²，刘芬¹

1新疆医科大学第一附属医院及临床医学研究院，新疆心血管病研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；2新疆医科大学第一附属医院心脏中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2014-08-04 出版日期:2014-09-10 发布日期:2014-09-10
通讯作者: 马依彤，博士，主任医师，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院心脏中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:陈邦党，男，1980年生，云南省宣威市人，汉族，2007年新疆大学毕业，硕士，助理研究员。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211B34)；国家自然科学基金(81160026)；新疆医科大学第一附属医院青年基金(2011QN04)

Platelet-derived growth factor-B gene transfection reduces ischemia and hypoxia-induced myocardial apoptosis

Chen Bang-dang¹, Chen Xiao-cui¹, Ma Yi-tong^{1, 2}, Yang Yi-ning^{1, 2}, Ma Xiang², Liu Fen¹

1Xinjiang Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Clinical Medical Research Institute, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Heart Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2014-08-04 Online:2014-09-10 Published:2014-09-10
Contact: Ma Yi-tong, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Xinjiang Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Clinical Medical Research Institute, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Heart Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Chen Bang-dang, Master, Research assistant, Xinjiang Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Clinical Medical Research Institute, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211B34; the National Natural Science Foundation of China, No. 81160026; the Youth Foundation of First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 2011QN04

摘要/Abstract

摘要：

背景：血小板源性生长因子B(platelet-derived growth factor-B，PDGF-B)是一种有效的促血管生长因子，9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype，rAAV9)对心肌细胞具有良好的靶向亲和力，是目前缺血性心脏疾病基因治疗的理想载体。
目的：探索rAAV9介导PDGF-B基因(rAAV9-PDGF-B)体外转染乳鼠心肌细胞，抵抗缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用。
方法：分离培养原代乳鼠心肌细胞，分别将感染复数为1×105，1×106及1×107 MOI携带rAAV9-PDGF-B基因的重组9型腺相关病毒及空病毒(rAAV9-eGFP)转染乳鼠心肌细胞，逐日在荧光显微镜下观察eGFP的阳性表达，采用流式细胞仪测定rAAV9载体的转染效率，Western blot和免疫荧光鉴定PDGF-B蛋白表达情况；并于rAAV9-eGFP及rAAV9-PDGF-B(107感染复数)转染第5天时，建立体外心肌细胞缺血缺氧损伤模型，通过TUNEL法检测心肌细胞凋亡数目，Western Blot检测Bax及Caspase-3凋亡相关蛋白的表达，研究PDGF-B基因过表达抗心肌细胞凋亡的作用及可能机制。
结果与结论：rAAV9载体可有效转染乳鼠心肌细胞，eGFP和PDGF-B蛋白可在心肌细胞中高效正确表达，其表达强度随着转染时间和转染复数的增加而逐渐增强，第5天趋于稳定，此时各组转染率相比差异均有显著性意义(P < 0.01)。rAAV9-PDGF-B组心肌细胞凋亡率低于rAAV9-eGFP组(P < 0.05)，且rAAV9-PDGF-B组凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达与rAAV9-eGFP组比均显著下调(P < 0.05)。结果表明，PDGF-B基因过表达可有效减轻缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡，其机制通过抑制Bax和Caspase-3蛋白表达而发挥作用，为rAAV9-PDGF-B载体用于缺血性心脏疾病的基因治疗提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 血小板源性生长因子B, 9型腺相关病毒, 基因转染, 心肌细胞, 缺血缺氧, 细胞凋亡, 转染效率, 血管新生, BAX, Caspase-3, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-derived growth factor-B (PDGF-B) is an effective pro-angiogenic growth factor, and adeno-associated virus type 9 (rAAV9) has a strong cardiomyocyte targeting affinity, which is an ideal vehicle for ischemic heart disease gene therapy.
OBJECTIVE: To explore the PDGF-B gene transfection of in vitro neonatal rat myocardial cells mediated by rAAV9 against ischemia and hypoxia-induced cardiomyocytes apoptosis.
METHODS: Rat neonatal myocardial cells were isolated and cultured, and then transfected by rAAV9-PDGF-B and empty virus, rAAV9 with enhance green fluorescent protein (eGFP), under multiplicity of infection (MOI) of 105, 106 and 107, respectively. We observed the expression of eGFP under fluorescence microscopy every day, and used flow cytometry to measure transfection efficiency of vector rAAV9. Western blot and immunofluorescence were used to evaluate protein expression of PDGF-B. Myocardial ischemia and hypoxia injury model was established in vitro on the 5th day of transfection of rAAV9-eGFP and rAAV9-PDGF-B with 107 MOI. The number of myocardial apoptosis was measured by TUNEL assay. Western blot was employed to detect the protein expression of Bax and Caspase-3 which were related apoptosis, and the effect and its possible mechanism of PDGF-B gene overexpression against myocardial apoptosis were explored.
RESULTS AND CONCLUSION: rAAV9 vector can efficiently transfect neonatal rat myocardial cells. eGFP and PDGF-B protein expressed in myocardial cells correctly and efficiently, and the expression intensity increased gradually with the increasing of time course and MOI. The expression became stable on the 5th day, and the transfection efficiency showed significant difference among these groups (P < 0.01). Myocardial apoptosis rate was significantly reduced in the rAAV9-PDGF-B group than the rAAV9-eGFP group (P < 0.05), and protein levels of Bax and Caspase-3 in the rAAV9-PDGF-B group were significantly lower than those of the rAAV9-eGFP group (P < 0.05). These data indicate that overexpression of PDGF-B gene can effectively reduce ischemia and hypoxia-induced myocardial apoptosis, and the possible mechanism might be by inhibiting Bax and Caspase-3 protein expression, which can provide evidence of rAAV9-PDGF-B vector in the gene therapy of ischemic heart diseases.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: tissue engineering, adenoviridae, viruses, anoxia, apoptosis

中图分类号:

R318

陈邦党，陈小翠，马依彤，杨毅宁，马翔，刘芬 . 血小板源性生长因子B基因转染抑制缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6090-6098.

Chen Bang-dang, Chen Xiao-cui, Ma Yi-tong, Yang Yi-ning, Ma Xiang, Liu Fen.

Platelet-derived growth factor-B gene transfection reduces ischemia and hypoxia-induced myocardial apoptosis

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6090-6098.

图/表（结果） 3

2.1 心肌细胞的培养及纯度鉴定取培养2 d的细胞，用心肌特异性肌钙蛋白T进行免疫荧光鉴定，于荧光倒置显微镜下观察计数，红色荧光标记的是心肌细胞,蓝色荧光标记视野下所有的细胞核，计数后，心肌细胞的纯度可达到98%以上(图1A)，400倍荧光显微镜下可以清晰看到心肌细胞的肌丝结构(图1B)，说明采用胰蛋白酶结合胶原酶消化心肌组织、二次差速贴壁及添加BrdU的分离培养方法可获得高纯度心肌细胞，有效抑制非心肌细胞污染。

2.2 rAAV9-eGFP载体转染效率用感染复数为1×10⁵、1×10⁶和1×10⁷ MOI转染心肌细胞后，倒置荧光显微镜下观察发现eGFP的表达随着感染复数的增加和转染时间的延长而逐渐增强(图2)。在病毒转染1 d后可见少量心肌细胞表达，转染两三天表达eGFP阳性的细胞逐渐增加，随着时间的延长，eGFP阳性的细胞逐渐增加，转染五六天荧光表达的细胞数及强度趋于稳定，转染第9天仍有表达，但随着细胞的衰老表达强度略有减弱。

收集1×10⁵、1×10⁶和1×10⁷ MOI的rAAV9-eGFP转染第5天的心肌细胞，流式细胞仪测定其转染效率分别为(8.23±0.49)%、(19.60±0.65)%、(60.90±1.13)%，见图3，各组相比差异有显著性意义(P < 0.01)，表明rAAV9-eGFP载体对心肌细胞有较高的亲和力，可高效转染乳鼠心肌细胞。

2.3 Western Blot检测PDGF-B蛋白表达结果分别收集1×10⁵、1×10⁶和1×10⁷ MOI的rAAV9-PDGF-B转染第5天时的心肌细胞，提取细胞总蛋白，Western Blot检测发现PDGF-B蛋白的表达随着感染复数的增加而逐渐增强(图4A，B)，与内参GAPDH蛋白相比，其表达分别为(31.51±4.80)%，(54.86±5.22)%，(86.51±5.56)%，各组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。

1×10⁷ MOI的rAAV9-PDGF-B转染1-5 d的心肌细胞，PDGF-B蛋白的表达水平随着转染时间的延长而逐渐增强(图4C，D)，与内参GAPDH相比，其表达分别为(28.45±2.88)%，(46.25±2.84)%，(57.79±2.93)%，(71.92± 2.25)%，(86.51± 5.56)%，各组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，表明rAAV9-PDGF-B载体转染心肌细胞后可高效正确表达PDGF-B蛋白。

2.4 免疫荧光鉴定PDGF-B蛋白表达结果取转染后第5天的心肌细胞进行检测，在倒置荧光显微镜下观察，红色荧光为表达PDGF-B的心肌细胞，用DAPI(蓝色)复染细胞核，经计算约55%的心肌细胞表达PDGF-B蛋白(图5)。

2.5 心肌细胞凋亡检测结果取缺血缺氧培养24 h的心肌细胞，用TUNEL染色检测细胞凋亡数目，其中红色标记凋亡的细胞核，蓝色标记所有的细胞核，红色与蓝色可叠加为粉红色的计数为凋亡的细胞(图6)，计数后，rAAV9- PDGF-B组心肌细胞凋亡率为(20.10±2.50)%，而rAAV9-eGFP组为(30.00±3.40)%，PDGF-B的过表达可使心肌细胞凋亡率减少33%，两组相比差异有显著性意义 (P < 0.05)，说明PDGF-B蛋白表达可有效抵抗缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用。

2.6 细胞凋亡蛋白检测结果 Western blot检测各组细胞Bax表达，经分析正常对照组Bax表达为(9.54±1.01)%，eGFP组为(20.90±2.67)%、PDGF-B组为(12.10±2.08)%。与正常对照相比，PDGF-B组Bax水平无明显差异，与eGFP组相比Bax水平显著下调(P < 0.05)。

Caspase-3表达变化趋势与Bax基本一致，其表达对照组为(7.85±0.66)%，eGFP组为(12.99±1.92)%，而PDGF-B组为(8.82±0.67)%，与eGFP组相比Caspase-3的表达明显下调(P < 0.05)(图7)。结果表明，PDGF-B蛋白表达可有效抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达。

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引言

缺血性心脏病是严重危害人类健康的心血管疾病，目前尚无任何根治缺血性心肌坏死的药物和疗法^[1-2]，而血管新生疗法有望成为治疗缺血性心脏病的新途径。

使用生长因子或基因载体实施治疗性促血管新生及再生是近年来的研究热点^[3-4]，其中血小板源性生长因子B(platelet-derived growth factor-B，PDGF-B)具有促血管新生及动脉新生的双重作用，同时具有抑制心肌细胞凋亡、减少心梗面积、改善心功能的作用，被认为是治疗性血管新生的理想候选基因^[5-6]，但是目前的研究往往集中在心肌内注射PDGF-B重组蛋白或基因载体^[7-8]，重组蛋白价格昂贵、体内半衰期短、易降解等缺点，因此基因治疗才是最佳选择。

高效靶向的将目的基因传递至心肌组织是成功开展心脏疾病基因治疗的关键^[9]，9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype 9，AAV9)因其对心肌具备高效、靶向、长期稳定表达及安全的特点而成为目前心脏疾病基因治疗的最佳载体^[10-11]。但既往有关AAV9的研究主要侧重于体内实验，体外细胞学研究相对缺乏，尤其在缺血缺氧条件下，PDGF-B基因转染对原代培养的心肌细胞是否具有保护作用未见报道。

实验以原代乳鼠心肌细胞为研究对象，选用AAV9载体分别携带增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein，eGFP)报告基因和PDGF-B基因进行转染，测定重组AAV9载体的体外转染效率及表达情况，获得其高效转染心肌细胞的感染复数值。此外，利用心肌细胞缺血缺氧模型，探讨PDGF-B基因过表达抑制缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用及可能机制，为缺血性心脏疾病的基因治疗提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：2014年1至7月在新疆医科大学第一附属医院新疆心血管病研究重点实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级新生1-3 d的SD大鼠30只，雌雄不限，购自新疆医科大学实验动物中心。实验动物许可证号：SYXK(新)2010-0003，动物饲养环境良好。

实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[15]。

方法：

原代乳鼠心肌细胞分离培养：采用胰酶结合胶原酶消化分离法^[16]，取大鼠30只，体积分数75%乙醇消毒后开胸迅速取出心脏，置于0-4 ℃ D-Hank’s液中，并轻轻挤压心脏去除血污，用眼科剪剪去整个心脏的1/3-1/2，留心间部的左室心肌，并沿纵横方向将剪切成花瓣状(心间部相

9型腺相关病毒介导PDGF-B基因体外转染乳鼠心肌细胞相关仪器及试剂：
仪器及试剂	来源
倒置荧光显微镜	德国Leica-DMI 6000B
流式细胞仪	Beckman Coulter EP ICS
rAAV9-CMV-eGFP (rAAV9-eGFP)， rAAV9-CMV-PDGF-B (rAAV9-PDGF-B)	Virovek，Inc，USA
小牛血清、胰蛋白酶、胶原酶	Gibco
DMEM高糖培养液	HyClone
兔抗大鼠TroponinT抗体	Abcam
兔抗大鼠PDGF-B抗体	Santa Cluz
荧光二抗为山羊抗兔IgG-Dylight 594	Earthox
细胞凋亡检测试剂盒	Roche
GAPDH单克隆抗体	Cell Signaling Technology

连)。放入含30 mL体积分数为0.1%的胰蛋白酶中，置于 4 ℃冰箱缓慢震荡消化过夜。次日加入30 mL DMEM培养液，置37 ℃水浴箱以往复80次/min的速度震荡10 min后终止消化，弃上清。加入7.5 mL浓度为0.08%的Ⅱ型胶原酶置37 ℃水浴箱以80次/min的速度震荡10 min，收集上清，并加入等体积培养液中和后放置CO₂培养箱中。此步骤重复四五次，直到心肌组织基本消化完毕，将每次消化的液体用200目滤网进行过滤，收集滤液后1 500 r/min离心5 min，弃上清，用DMEM培养液制成单细胞悬液，接种于100 cm培养皿中。置于37 ℃ CO₂培养箱中孵育 50 min，吸出尚未贴壁的细胞悬液经二次差速贴壁培养 45 min，吸出细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，并于每10 mL中细胞悬液中加入100 μL BrdU(质量浓度为 3 g/L)以抑制非心肌细胞增殖，心肌细胞悬液接种培养 48 h后用于后续实验。

心肌细胞的纯度鉴定：将心肌细胞按照1×10⁵/孔接种于24孔培养板，培养48 h后用抗心肌肌钙蛋白T(cTnT)抗体作免疫荧光，进行心肌细胞纯度鉴定^[17]。心肌细胞培养 48 h后，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，再用体积分数0.25%TritonX-100透化10 min，驴血清室温封闭30 min，加入兔抗cTnT抗体(1∶100)室温孵育1 h。加入羊抗兔IgG(1∶50；Dylight 594)荧光二抗，避光室温孵育1 h。避光加入1 mg/L的DAPI 1 min。

倒置荧光显微镜(×200)下随机拍照10个视野，记录，分别计数红色荧光(心肌细胞)和蓝色荧光(细胞核)标记的细胞数，两者相比计算得到心肌细胞的纯度。

重组AAV9载体转染心肌细胞：按照2×10⁵/孔及1×10⁶/孔的细胞密度接种24孔培养板和6孔培养板，分别用于eGFP蛋白的荧光观察和转染效率检测。待心肌细胞贴壁培养48 h后吸弃培养上清液，用37 ℃预热PBS清洗2 遍，rAAV9-eGFP病毒载体按感染复数(multiple of infection，MOI)为1×10⁵，1×10⁶和1×10⁷ viral genomes/cell，即病毒颗粒数与细胞的比值进行转染^[18-19]，每组设3个复孔，置 37 ℃的CO₂培养箱孵育3 h，期间每隔30 min晃动培养板，以保证病毒颗粒均匀分布在细胞表面，3 h后补加FCS至浓度10%，逐日(1-9 d)在倒置荧光显微镜(×200)下拍照记录eGFP的荧光表达情况，并于rAAV9-eGFP载体转染第5 d利用流式细胞仪检测其转染效率。

Western Blot检测PDGF-B蛋白表达：将心肌细胞按2×10⁶个接种60 mm培养皿，按1×10⁵、1×10⁶和1×10⁷ MOI的rAAV9-PDGF-B转染心肌细胞，收集各MOI组第5天及1×10⁷ MOI转染1-5 d的心肌细胞，经RIPA裂解液裂解和超声破碎后提取各组细胞总蛋白，用BCA蛋白定量分析试剂盒定量后行SDS-PAGE电泳，每孔上样40 μg总蛋白。以100 V恒压电泳30 min，待样品跑过浓缩胶后，再以120 V恒压电泳1 h，并以80 mA恒流2 h转至PVDF膜。经5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，分别与PDGF-B及GAPDH一抗(稀释度1∶1 000)4 ℃孵育过夜。

参照试剂盒说明书，Wash Buffer洗膜3次，每次 5 min，二抗孵育2 h后，依次经过Wash Buffer洗膜、BCIP/NBT显影后Bio-Rad成像系统拍照，Image Lab 4.0软件测定条带的吸光度值，以目的蛋白条带与内参GAPDH平均吸光度的比值表示目的蛋白表达水平。

免疫荧光鉴定PDGF-B蛋白表达：将心肌细胞按照1×10⁵/孔接种24孔培养板，待rAAV9- PDGF-B病毒转染后第5天，通过免疫荧光法鉴定PDGF-B蛋白表达。一抗为兔抗PDGF-B多克隆抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜，二抗为羊抗兔IgG(1∶50)(Dylight 594)。

在倒置荧光显微镜下观察，红色荧光为表达PDGF-B的细胞，用DAPI(蓝色)复染细胞核，显微镜(×200)下随机拍照10个视野，分别计数红色荧光和蓝色荧光标记的细胞数，两者相比计算得到表达PDGF-B的心肌细胞比例。

缺血缺氧模型的建立及心肌细胞凋亡检测：将以上相同密度的心肌细胞分别接种24孔和6孔培养板，贴壁培养48 h后，按1×10⁷ MOI进行转染，设定空白组、rAAV9-eGFP和rAAV9-PDGF-B转染组，每组各设3个复孔，待转染5 d后，经PBS清洗培养板2次后，换用无血清培养基，并将培养板放入3气培养箱(体积分数94%N₂、5%CO₂、1%O₂)中培养24 h，模拟体内心肌梗死时缺血缺氧的条件。

利用TUNEL凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡指数，并用Western blot检测凋亡相关蛋白Bax及Caspase-3蛋白表达，研究PDGF-B基因过表达抑制心肌细胞凋亡的作用。

主要观察指标：通过cTnT免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度；流式细胞仪测定rAAV9载体对心肌细胞的转染效率；Western Blot检测PDGF-B、Bax及Caspase-3蛋白的表达水平；TUNEL试剂盒检测心肌细胞凋亡指数。

统计学分析：采用Graphad Prism 6.0软件进行作图分析。采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理，计量资料以x(_)±s表示，两组均数间比较采用独立样本t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数差异的两两比较采用SNK-q 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

获得高存活率和高纯度的心肌细胞是体外研究心脏相关疾病的前提和基础，提高心肌细胞的产量、活性与纯度是心肌细胞培养成功的关键^[20]。不同于既往单一胰酶或胰酶和胶原酶同时联合运用消化心肌组织的方法^[21-22]，实验采用胰蛋白酶结合胶原酶消化心肌组织、两次差速贴壁及添加BrdU的分离培养方法，通过心肌细胞的特异性标记物心肌肌钙蛋白T进行鉴定，获得活性及纯度达到98%的心肌细胞，建立了一种理想的原代心肌细胞分离培养方法。

实验按先胰酶后胶原酶的顺序消化心肌组织，可有效保证心肌细胞的数量和活力，并且完整的保持心肌细胞的结构和功能。作者认为胰酶4 ℃过夜消化可避免胰酶对细胞膜的破坏，同时有效的分解心肌组织间质的蛋白质成分，使得心肌组织变松散而利于下一步胶原酶的消化。

胶原酶能特异性地水解细胞间质中的胶原纤维以释放心肌细胞，作用较缓和，对细胞损伤较小，此步骤应多次重复消化，直到心肌组织呈半透明状态时停止消化。通过两次差速贴壁法可有效去除成纤维细胞的污染，培养液中添加BrdU可抑制成纤维细胞的增殖而纯化心肌细胞^[23]。另外，胎牛血清含有较多的促细胞有丝分裂因子，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长，故应选用小牛血清培养以进一步提高心肌细胞的纯度。

重组腺相关病毒载体被公认为是最安全的病毒载体，本身具有不致病、低免疫原性、宿主范围广、能够感染分裂与非分裂的细胞、且AAV载体能整合到宿主基因组或以染色体外串联体DNA的形式长期稳定表达等特点，在心脏疾病的基因治疗研究中被广泛应用^[24-25]。
目前常用的AAV有9种血清型，即AAV1-9，它们的主要区别在衣壳蛋白的不同，并因此导致各种血清型AAV对不同组织和细胞有不同的感染效率。研究表明，AAV9对心肌的亲和力最高，对心肌具有高效、靶向、长期稳定表达的优点，被认为是目前心脏疾病基因治疗的最佳载体。但目前有关AAV9的研究主要侧重于体内实验，而细胞学的研究相对较少，尤其是在原代培养细胞方面。
原代培养的乳鼠心肌细胞可保存其结构和功能上的诸多特点，具有自发性搏动，且不受神经、体液因素的干扰，可进行生理、病理及药理等多方面研究^[26-28]，在揭示心脏病的发病及防治机制方面起着不可替代的作用。

实验以rAAV9-eGFP为载体转染乳鼠心肌细胞，通过观察eGFP的表达情况及测定体外转染效率来研究AAV9载体转染心肌细胞的可行性及有效性。实验通过1×10⁵，1×10⁶和1×10⁷ MOI不同感染复数的rAAV9-eGFP转染细胞，病毒感染后连续观察至9 d，结果表明，AAV9载体的转染效率随着感染复数的增加和转染时间的延长而逐渐增强。荧光显微镜下观察发现在病毒转染1 d后可见少量心肌细胞开始表达，转染两三天表达eGFP阳性的细胞逐渐增加，转染五六天荧光表达的细胞数量达高峰，荧光强度较强，随后细胞一直表达绿色荧光至第9天，但随着细胞的衰老表达强度略有减弱，提示重组AAV9载体可在心肌细胞内长期稳定表达。流式细胞仪检测发现1×10⁷ MOI转染5 d时约有60%的乳鼠心肌细胞被转染，与高霞等^[29]报道rAAV9-eGFP载体转染H9C2细胞株的结果相符，证实rAAV9-eGFP载体可高效转染乳鼠心肌细胞，是一种理想的基因传递载体。

PDGF是一种具有多种生物学功能的细胞因子，因其强大的促血管新生作用被认为是治疗性血管新生的理想候选基因。既往研究表明PDGF-B具有促进血管新生、抗细胞凋亡、抑制心梗面积、改善心功能的作用，这有利于梗死区侧支血液循环的重建和缺血心肌的保护。

实验结果显示rAAV9-PDGF-B载体转染心肌细胞后，Western Blot 和免疫荧光检测表明PDGF-B蛋白可在心肌细胞内高效正确表达，其表达情况与报告基因eGFP一致，亦随着感染复数的增加和转染时间的延长而逐渐增强。建立体外心肌细胞缺血缺氧模型发现，PDGF-B的过表达可使心肌细胞凋亡率显著减少33%，并通过抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达而发挥作用，提示过表达PDGF-B的心肌细胞具有抗凋亡的功能。与课题组前期报道PDGF-B在H9C2心肌细胞中过表达后，可抵抗H₂O₂诱导其凋亡的结论一致^[30-36]，这为今后利用rAAV9-PDGF-B载体开展缺血性心脏病的基因治疗奠定基础。Bax是Bcl-2家族中最主要的促凋亡蛋白，缺血缺氧刺激下Bax蛋白表达增高并转运到线粒体膜上，导致线粒体膜电位的丢失，促使线粒体中细胞色素C的大量释放^[37]，最终激活Caspase-3途径，引起细胞凋亡^[38]。

综上所述，实验探索建立了一种理想的原代乳鼠心肌细胞分离培养方法；rAAV9-eGFP和rAAV9-PDGF-B载体可有效转染乳鼠心肌细胞，eGFP和PDGF-B蛋白可在心肌细胞中正确稳定表达，其表达强度均随着转染时间和转染复数的增加而逐渐增强，转染第5天左右达到高峰；过表达PDGF-B的心肌细胞在缺血缺氧条件下具有抗凋亡的功能，其机制通过抑制Bax和Caspase-3蛋白的表达而发挥作用。

实验在体外细胞水平证实rAAV9-PDGF-B载体转染对心肌细胞的保护作用，未开展体内基因治疗研究，具有一定的局限性。下一步课题组将利用小鼠心肌梗死模型，通过尾静脉将rAAV9-PDGF-B载体靶向转导小鼠心肌，期望PDGF-B基因在梗死心肌内靶向、高效的持续分泌表达，进而发挥其促进血管新生、抑制心肌细胞凋亡的作用，探索PDGF-B基因治疗恢复血运重建、治疗心肌梗死的可行性及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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血小板源性生长因子B基因转染抑制缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡

Platelet-derived growth factor-B gene transfection reduces ischemia and hypoxia-induced myocardial apoptosis

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