设计：以细胞为研究对象，随机分组。
时间及地点：于2012年9月2013年9月在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。
材料：
细胞培养：人单核细胞系THP-1按美国典型物培养中心(ATCC)的说明，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下，接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液中培养，隔天换液1次，培养至对数生长期。
|
THP-1单核细胞不同转染方法的比较实验所用试剂与仪器：
|
|
试剂与仪器
|
来源
|
|
人单核细胞系THP-1
|
上海细胞所
|
|
RPMI1640培养基、胎牛血清
|
Gibco公司
|
|
载体绿色荧光蛋白真核表达质粒(pEGFP-N1)
|
美国Clontech公司
|
|
DEAE-葡聚糖(二乙胺乙基葡聚糖，DEAE-Dextran)(相对分子质量500 000)
|
Pharmacia公司
|
|
阳离子脂质体Lipofectamine2000
|
美国Invitrogen公司
|
|
FuGENE 6(非脂质体配方)
|
瑞士Roche公司
|
|
阳离子聚合物梭华-sofast
|
厦门太阳马生物工程有限公司
|
|
质粒小量提取试剂盒
|
华舜公司
|
|
大肠杆菌(E.coli)DH5α
|
由本实验室保存
|
|
荧光倒置显微镜(IX70型)
|
日本Olympus
|
|
流式细胞仪(FACSort)
|
美国Becton Dickson公司
|
|
实验方法：
DEAE-Dextran法转染：具体步骤按参考文献[15]进行。转染前24 h，THP-1细胞浓度在1×109 L-1左右；置PBS、STBE、DEAE-Dextran于37 ℃水浴锅中预热；准备转染液：每1 mL STBE中，依次加入2.5 μg的样品DNA和 300 μg的DEAE-Dextran，温柔混匀；转染时，1 000 r/min 离心5 min，获得细胞沉淀，并用PBS洗2次；每(3-5)×106细胞用1 mL转染液重悬，置于37 ℃含体积分数5%CO2的培养箱中孵育20 min，每5 min混匀1次；离心去上清，用 PBS洗1次；1 500 r/min离心3-5 min，用不含血清的RPMI 1640洗1次，去掉残留的DEAE-Dextran，然后用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640重悬，置于37 ℃含体积分数5%CO2的培养箱中培养。
优化DEAE-Dextran法转染的不同剂量和孵育时间：转染前THP-1细胞浓度在1×109 L-1左右，转染时，THP-1细胞先用PBS洗2次，每(0.5-1.0)×106细胞在200 µL STBE中与0.5 μg质粒绿色荧光蛋白真核表达质粒、不同剂量的DEAE-Dextran混匀，37 ℃孵育不同时间，去掉残留的DEAE-Dextran，然后用正常培养基培养，24 h后收集细胞，观察指标。
比较DEAE-Dextran的不同促进剂：通过以上实验，选用DEAE-Dextran优化的剂量和孵育时间，转染后培养细胞4-6 h后，弃去培养液，加入不同促进剂，10%-20%甘油或二甲基亚砜溶液在室温孵育2.0-3.0 min，去除甘油或二甲基亚砜溶液，用PBS洗THP-1细胞2次，加培养基培养，或者按1∶1 000将100 mmol/L氯喹直接加入培养基中(氯喹终浓度100 μmol/L)，孵育不超过2.5 h或出现细胞毒性前更换新鲜的培养基。
DEAE-Dextran预处理转染方法：THP-1细胞先用PBS洗2次，去除PBS，加入预先准备好的含300 mg/L DEAE-Dextran的STBE溶液，孵育20 min后。去除DEAE-Dextran，用PBS轻轻洗涤细胞2次。去除PBS，将预先准备好的含DNA的STBE溶液均匀滴加到细胞表面。细胞培养箱内孵育30 min，孵育期间经常摇动培养板以保持所有细胞湿润。最后缓慢加入细胞培养液(约稀释DNA的STBE溶液体积的10倍)继续培养。
Lipofectamine 2000试剂转染：具体步骤参见说明书。在准备混合液之前，以每孔(4-8)×105 THP-1细胞的密度接种于24孔培养板中，每孔加入0.5 mL含体积分数10%血清的RPMI1640(不含抗生素)；对于要转染的每孔细胞，用 50 μL的Opti-MEM培养基稀释0.8 μg的DNA，用50 μL的 Opti-MEM培养基稀释2 µL Lipofectamine 2000，并在室温下孵育5 min。
一旦Lipofectamine 2000稀释完成后，30 min内必须和DNA溶液混合孵育；将稀释了的DNA和稀释了的 Lipofectamine 2000温柔混合，在室温下孵育20 min促使 DNA-Lipofectamine 2000混合物的形成；直接往每孔中加入DNA-Lipofectamine 2000混合物100 μL，并轻轻前后晃动培养板混匀；37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的CO2孵箱孵育4 h后，Opti-MEM更换为含体积分数10%血清的 RPMI1640中培养。
FuGENE 6试剂转染：具体步骤参见说明书。在准备混合液之前，以每孔(1-5)×105 THP-1细胞的密度接种于24孔培养板中，每孔加入0.5 mL含体积分数10%血清的RPMI1640(不含抗生素)；对于要转染的每孔细胞，用20 μL的无血清培养基稀释0.6 µL的FuGENE 6，混匀，室温下孵育5 min；按照转染试剂∶DNA(μg)比例3∶1直接加入DNA，混匀并室温下孵育15 min；将以上混合液逐滴加入培养细胞的24孔板中，并轻轻前后晃动培养板混匀； 37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的CO2孵箱培养，无须更换新鲜培养基。但是，如果转染过程中需要用无血清培养基，那么可以在转染后孵育3-8 h，更换为含体积分数10%血清的RPMI1640中培养。
梭华-Sofast试剂转染：具体步骤参见说明书。在准备混合液之前，以每孔(4-8)×105 THP-1细胞的密度接种于24孔培养板中，每孔加入0.5 mL含体积分数10%血清的 RPMI1640(不含抗生素)。
梭华-Sofast/DNA复合物的制备：0.6 μg DNA质粒稀释于30 µL不含血清和抗生素的 Opti-MEM中，轻轻混匀；1.0-2.0 µL梭华-Sofast稀释于 30 µLOpti-MEM中，轻轻混匀；30 µL梭华-Sofast稀释液滴加到DNA稀释液中，一边滴加一边混匀。室温孵育 15-20 min。60 µL梭华- Sofast/DNA复合物加到每孔中并轻轻摇动使均匀混合。放置37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的CO2孵育箱孵育24-48 h后，分析报告基因转染效率。
荧光显微镜观察：于转染后在4-72 h内荧光显微镜下动态观察绿色荧光蛋白信号，阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。于48 h时进行显微细胞计数：每孔找3个具有代表性的视野，各观察100个细胞，计算阳性细胞的百分率。
流式细胞仪检测：于转染48 h后收集培养孔内细胞，用PBS漂洗，1 500 r/min离心5 min，混匀后采集样本，用FACSort流式细胞仪检测，每组取3个样本，每样本计数 10 000个细胞，并计算其阳性率。
主要观察指标：①THP-1细胞用DEAE-Dextran处理后，在正常条件下生长24 h后用1%锥虫蓝染色15 min，然后用显微镜镜检，透明光亮圆形细胞为活细胞，被染上蓝紫色的细胞为死亡细胞，计数细胞死亡率，并用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率。②比较DEAE-Dextran的不同剂量、孵育时间以及不同促进剂介导THP-1细胞瞬时转染的效率，从而优化DEAE-Dextran介导的THP-1细胞瞬时转染外源报告基因质粒表达的条件。③采用DEAE-Dextran、Lipofectamine 2000、FuGENE 6、梭 华-Sofast 4种不同方法转染THP-1细胞后，通过荧光显微镜下观察和流式细胞仪检测比较这4种不同转染方法的差异。
