慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1828

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5275-5280.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1828

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慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死

马跃刚，李强，陶旋，周桢杰，朱伦井，段江涛

桂林医学院附属医院，广西壮族自治区桂林市 541000

修回日期:2019-06-05 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 李强，硕士，主任医师，教授，硕士生导师，桂林医学院附属医院，广西壮族自治区桂林市 541000
作者简介:马跃刚，男，1994年生，浙江省诸暨市人，汉族，硕士，主要从事骨组织工程领域研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31160199)，项目负责人：李强；广西壮族自治区自然科学基金项目(2014GXNSFAA118263)，项目负责人：李强；广西省教育厅科研项目(LX2014254)，项目负责人：李强

Bone marrow mesenchymal stem cells co-transfected by lentivirus-mediated bone morphogenetic protein 2 and vascular endothelial growth factor 165 in combination with demineralized bone matrix for treating rabbit femoral head necrosis

Ma Yuegang, Li Qiang, Tao Xuan, Zhou Zhenjie, Zhu Lunjing, Duan Jiangtao

Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Revised:2019-06-05 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Li Qiang, Master, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Ma Yuegang, Master, Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31160199 (to LQ); the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2014XNSFAA118263 (to LQ); Scientific Research Projects of Guangxi Education Department, No. LX2014254 (to LQ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管内皮生长因子165：主要作用是促进血管生成及增加毛细血管通透性，也能促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化，其在骨折愈合过程中不可或缺。
慢病毒载体：是以人HIV-1来源的病毒载体，携带外源基因，通过感染细胞，将外源基因整合入宿主细胞的基因组中，且不会因为宿主细胞的分裂增殖而消失，具有高感染率，使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。

摘要
背景：骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165均在骨修复过程中扮演着重要角色。利用慢病毒介导这2种基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗骨损伤具有重要意义。
目的：观察慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165基因共转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死的效果，以此来探讨双基因在未来骨损伤修复过程中的可行性。
方法：采用液氮冰冻联合髓芯减压方法制备股骨头坏死模型，将造模成功的实验兔分为3组(n=12)：①未转染组：植入骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨；②单基因转染组：植入骨形态发生蛋白2转染的骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨；③双基因转染组：植入骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165共转染的骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨。术后3，6，9周各组分别处死4只兔子，Western blot检测股骨头内骨形态发生蛋白2蛋白的表达量；苏木精-伊红染色观察股骨头坏死修复情况。实验方案经桂林医学院动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①术后3，6，9周各组均有骨形态发生蛋白2阳性表达，单基因转染组、双基因转染组表达量均高于未转染组(P < 0.05)，且呈递增趋势；术后3周，单基因转染组、双基因转染组骨形态发生蛋白2表达差异无显著性意义(P > 0.05)；术后第6，9周，双基因转染组骨形态发生蛋白2表达量明显高于单基因转染组(P < 0.05)；②术后9周，双基因转染组新生骨痂可填满股骨头缺损处，未转染组、单基因转染组虽有骨痂形成，但均未填满缺损处；苏木精-伊红染色示未转染组有初级骨小梁形成，但骨细胞坏死较多，骨小梁较少；单基因转染组有大量骨小梁形成，形态较好，仅有部分中断，仍不及正常骨组织；双基因转染组形成大量成熟致密骨小梁，形态与正常骨组织无明显差异；③结果表明，慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因共转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗股骨头坏死的效果优于骨形态发生蛋白2单基因转染形式，且目的蛋白能在体内长期有效表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4622-7919(马跃刚)

关键词: 慢病毒, 骨髓间充质干细胞, 骨形态发生蛋白 2, 血管内皮生长因子 165, 脱钙松质骨, 双基因转染, 股骨头坏死, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and vascular endothelial growth factor 165 (VEGF-165) play important roles in bone repair. It is of great significance to treat bone injury by lentivirus-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with demineralized bone matrix.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cells with lentivirus-mediated BMP-2 and VEGF-165 co-transfection and demineralized bone matrix in a rabbit model of osteonecrosis of the femoral head, so as to explore the feasibility of dual genes in the bone repair.
METHODS: Femoral head necrosis model was prepared by liquid nitrogen freezing combined with core decompression. Rabbit models successfully prepared were divided into three groups (n=12/group): non-transfection group, treated with bone marrow mesenchymal stem cells combined with demineralized bone matrix; single gene transfection group, treated with BMP-2-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with demineralized bone matrix; dual-gene transfection group, treated with BMP-2 and VEGF-165 co-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with demineralized bone matrix. Four rabbits from each group were sacrificed at 3, 6, and 9 weeks postoperatively. Western blot was used to detect the expression of BMP-2 protein in the femoral head of each group. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the repair of femoral head necrosis in each group. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Guilin Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: BMP-2 positively expressed in all groups at 3, 6, and 9 weeks postoperatively, and the positive expression of target protein was significantly higher in the two transfection groups than the non-transfection group (P < 0.05). The positive expression of BMP-2 in the two transfection groups showed an increasing trend at three time periods. At 3 weeks postoperatively, there was no difference in the BMP-2 expression between the two transfection groups, while the BMP-2 expression was significantly increased in the dual-gene transfection group compared with the single gene transfection group at 6 and 9 weeks postoperatively (P > 0.05). In the dual gene transfection group, new osteophytes could fill in the defect of the femoral head at 9 weeks postoperatively, while in the other two groups, new osteophytes formed were not enough to fill in the defect. Hematoxylin-eosin staining indicated that primary trabeculae were formed in the non-transfection group, but there were more necrotic cells and less bone trabeculae. In the single gene transfection group, a large amount of trabeculae formed with good shape, some of which however were inferior to normal bone tissues because of fractures. In the dual gene transfection group, a mass of mature and dense trabeculae were formed and had normal shape. To conclude, lentivirus-mediated BMP-2 and VEGF-165 co-transfection is superior to single BMP-2 transfection in the combination of bone marrow mesenchymal stem cells and demineralized bone matrix for treating femoral head necrosis. Moreover, in vivo expression of target protein persists for a long time.

Key words: lentivirus, bone marrow mesenchymal stem cells, bone morphogenetic protein 2, vascular endothelial growth factor 165, demineralized bone matrix, double gene transfection, femoral head necrosis, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

马跃刚，李强，陶旋，周桢杰，朱伦井，段江涛. 慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5275-5280.

Ma Yuegang, Li Qiang, Tao Xuan, Zhou Zhenjie, Zhu Lunjing, Duan Jiangtao. Bone marrow mesenchymal stem cells co-transfected by lentivirus-mediated bone morphogenetic protein 2 and vascular endothelial growth factor 165 in combination with demineralized bone matrix for treating rabbit femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5275-5280.

图/表（结果） 1

2.1 复苏后骨髓间充质干细胞的形态 复苏后7 d即长至80%-90%培养皿体积，呈漩涡、鱼群状分布，生长状态良好，见图1。

2.2 病毒转染骨髓间充质干细胞的效率 转染后7 d在普通倒置显微镜下观察可见细胞生长状态良好，倒置荧光显微镜下显示细胞转染效率在90%以上，见图2，证明BMP-2及VEGF-165基因已成功转入细胞中。

2.3 转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨支架观察结果 在细胞和支架复合48 h后，倒置显微镜下见脱钙松质骨具有良好的三维结构与孔隙，见图3A；置于荧光显微镜下观察，双基因BMP-2/VEGF-165转染组可见支架发出明亮红绿亮光，伴有红绿点状亮点，见图3B；单基因BMP-2转染组可见支架发出明亮绿色亮光，伴有绿色点状亮点，见图3C。

2.4 Western blot 检测目的蛋白BMP-2表达 术后3，6，9周，3组BMP-2蛋白均呈阳性表达，但单基因转染组、双基因转染组表达量明显多于未转染组，差异有显著性意义(P < 0.05)。随着时间延长，单基因转染组、双基因转染组BMP-2表达量逐渐增加。术后3周，单基因转染组、双基因转染组BMP-2表达量差异无显著性意义(P > 0.05)，术后6，9周时，双基因转染组BMP-2表达量较单基因转染组明显升高(P < 0.05)，见图4。灰度分析显示：双基因转染组在术后3，6，9周时目的蛋白BMP-2/内参GAPDH表达量比值分别为0.481±0.025，0. 612±0. 012，0. 837±0.018，两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，上述结果证明慢病毒介导BMP-2和VEGF-165双基因转染骨髓间充质干细胞的目的蛋白BMP-2能在体内稳定表达，且随着时间的推移，此蛋白表达能力逐渐增强，效果好于单基因BMP-2转染形式。

2.5 苏木精-伊红染色结果 股骨头正常结构：骨小梁排列连续、完整，与周边纤维组织分辨清晰，伊红染色后呈红色网状结构，成骨细胞形态正常，胞核清晰完整，苏木精染色后呈蓝紫色，见图5A。坏死的骨小梁结构不规则，连续性不完整，网格状结构消失，边缘不整齐，可被苏木精染成蓝紫色。未转染组：术后3周骨小梁较少，呈点状分布，未见连续性，成骨细胞坏死较多，见图5B；术后6周骨小梁仍较少，结构不规则，少许连续性，为初级骨小梁，点状分布，可见成骨反应，见图5C；术后9周时可见纤维组织填满钻孔处，孔隙附近存在成骨反应，向心性生长，坏死组织含量高，存在初级骨小梁，见图5D。单基因转染组：术后3周见钻孔处有少许新生骨痂填充，可见少许初级骨小梁，骨小梁边缘粗糙，形态不规则，连续性较差，骨组织坏死较未转染组少，见呈向心性生长的成骨反应趋势，见图5E；术后6周可见钻孔处新生骨痂增多，但仍不及钻孔范围一半；骨小梁含量增多，形态较前好，呈网状，有部分连续性，可见明显成骨反应，见图5F；术后9周见钻孔处骨痂超过孔深一半，但仍有部分孔隙未被填满；骨小梁明显，形态较好，呈网状分布，较前致密，连续性好，仅有部分中断，见图5G，但仍不及正常骨组织。双基因转染组：术后3周变化与单基因转染组相似，见图5H；术后6周即可见新生骨痂超过孔深一半，孔隙内可见毛细血管长入，未见炎症反应，可见大量初级骨小梁，形态规则，网状，连续性较好，少许中断，见图5I；术后9周可见骨痂填满孔隙，填充区充满成熟骨小梁，骨小梁致密饱满，形态较好，丝瓜络样，连续性好，无中断，骨小梁形态及分布与正常骨组织无明显差异；表面成骨细胞生长状态好，数量多且清晰可见，见图5J。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞复合支架体外观察实验，随机对照动物体内实验。

1.2 时间及地点 2018年7月至2019年3月在桂林医学院科学实验中心进行。

1.3 材料

1.3.1 实验动物与细胞 健康清洁级雄性新西兰大白兔39只，3月龄，体质量(2.5±0.9) kg，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：scxk(湘)2014-0010，实验中所有操作均遵守动物伦理学原则。

1.3.2 实验试剂、材料 慢病毒载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)；进口胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶(四季青)；DMEM细胞低糖培养基(Gibco公司)；总蛋白提取盒(北京博奥森)；BCA蛋白定量试剂盒(北京碧云天)；BMP-2单克隆抗体(Bioworld Technology公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、抗GAPDH多克隆抗体及山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥)；4%组织细胞固定液(北京索莱宝)；注射用青霉素钠(华北制药)；BHC-1300生物安全柜(苏州净化设备有限公司)；Western blot化学发光设备(美国BIO-RAD公司)；倒置荧光显微镜(上海锘海生物科学仪器股份有限公司)；液氮罐(Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的复苏 课题组前期用全骨髓法在足月新西兰大白兔骨髓中成功提取出骨髓间充质干细胞，保存于液氮中。实验时，从液氮罐中取出第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，在37 ℃水浴锅中迅速解冻 2 min，并将融化的悬液转移至含2 mL低糖DMEM培养基的15 mL无菌离心管中，离心(1 500 r/min)5 min，弃去上清，加入3 mL含体积分数12%胎牛血清的完全低糖DMEM培养基重悬，接种于直径10 cm培养皿中，再加入7 mL含体积分数12%胎牛血清的完全低糖DMEM培养基，混匀，置于体积分数5%CO₂、37 ℃恒温箱中培养，两三天换液。在细胞长满后，取同代细胞实验。

1.4.2 脱钙松质骨的制取 根据Urist等^[13]方法制取脱钙松质骨。取3只2.5 kg新西兰大白兔，麻醉处死，分离四肢骨干骺端，用剪刀和刀片剔除骨表面的骨膜及软组织，用无菌蒸馏水反复冲洗，置于脱钙液中脱钙48-72 h，至骨头成白色海绵状，能被压缩并恢复原状，再将已脱钙骨依次置于乙醚中脱脂及无水乙醇中脱水，各24 h。用PBS反复冲洗直至骨块成中性，再将骨块置于PBS中浸泡过夜，第2天取出骨块并自然晾干。用无菌剪刀剪成3 mm×3 mm×3 mm小块状立方体，环氧乙烷消毒后置于15 mL无菌离心管中，4 ℃保存。

1.4.3 Lv-BMP-2及Lv-VEGF-165病毒转染细胞及实验分组 取复苏后第3代细胞进行实验，以各为50的感染复数，对细胞进行转染，7 d后在荧光倒置显微镜下对转染后的细胞进行观察。实验分组：①未转染组；②Lv-BMP-2/GFP组：带有绿色荧光的单基因BMP-2转染组(感染复数50)；③Lv-BMP-2/GFP-VEGF-165/RFP组：带有红绿荧光的双基因BMP-2及VEGF-165共转染组(VEGF-165与BMP-2感染复数均为50，感染比例1∶1)。

1.4.4 骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨 课题组已证明，骨髓间充质干细胞和脱钙松质骨支架具有良好的生物相容性^[14]。随机选取36块脱钙松质骨，置于含有体积分数为12%胎牛血清的低糖DMEM培养基中，浸泡8-12 h至骨块蓬松，用无菌滤纸吸干，在超净台中自然晾干5 min，选取未转染组、BMP-2转染组及BMP-2/VEGF-165共转染组骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，每块接种60 μL，将接种后的骨块置于体积分数为5%CO₂、37 ℃恒温箱中4 h，加入含体积分数为12%的低糖DMEM培养基，培养48 h后换液，荧光倒置显微镜下观察。

1.4.5 动物造模及分组 新西兰大白兔均选取右侧参与实验，取俯卧位，参照李海冰等^[15]液氮冰冻联合髓芯减压方法，造模结束后X射线检测确认造模成功，将新西兰大白兔随机分成3组：未转染组、单基因转染组、双基因转染组，每组12只，共36只。各组在钻孔处分别填塞复合相应细胞的脱钙松质骨，止血处理后缝合切口。术后连续3 d(包括手术当天)肌注青霉素钠注射液4×10⁵ U。

1.5 主要观察指标

1.5.1 Western blot检测股骨头中BMP-2的表达 术后3，6，9周，每组每个时间点各处死4只兔，取出患侧股骨，剔除表面的软组织，取部分股骨头样品置于液氮预冷过的研钵中，充分研磨成粉后加入1.5 mL EP管中，提取蛋白，定量后常规电泳、转膜、封闭、敷一抗、二抗、曝光。

1.5.2 苏木精-伊红染色观察骨小梁的数量与形态 术后3，6，9周，将剩余股骨头投入40 g/L组织细胞固定液中固定5 d，EDTA脱钙液中脱钙28 d，梯度乙醇脱水，透明，包埋，5 μm厚冠状切片，苏木精-伊红染色，在显微镜下观察骨小梁的数量与形态，并与正常股骨头(健侧)做对比。

1.6 统计学分析 使用SPSS 20.0软件进行分析，所有参数均用x(_)±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

最新研究表明骨细胞是由骨骼干细胞分化而来的^[16]，骨髓间充质干细胞是骨髓中含量最高的干细胞，具有免疫原性低、极强的增殖和分化能力、取材方便广泛等特点^[17]。脱钙松质骨制取经济、方便，同种异体脱钙松质骨具有良好的三维结构、孔隙率，且与骨髓间充质干细胞复合后不影响其增殖分化，两者之间有良好的生物相容性^[18]。慢病毒作为近年新兴的一种病毒载体，可将目的基因整合入细胞基因组中，相比于腺病毒，其不会因为细胞的分裂增殖而消失，能使目的基因在细胞中持续、高效且稳定地表达^[19]。BMP-2是目前所知成骨能力最强的细胞因子，当体内BMP-2水平下调时，会导致骨折不愈合^[20]；美国FDA已经批准其应用于临床治疗骨损伤^[21]。VEGF-165具有促进血管生成及增加毛细血管通透性等功能。许多研究指出，VEGF与BMP-2共同作用可加强骨髓间充质干细胞的成骨性^[22-25]。骨小梁的数量与形态与骨组织的状态息息相关。正常骨组织的骨小梁数量多且致密，完整性好，无连接中断，大部分为致密骨小梁；损伤或坏死的骨组织，其骨小梁形态较差，数量较少，连续性差，大部分由初级骨小梁构成，甚至无骨小梁。该实验通过慢病毒介导VEGF-165和BMP-2双基因转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨构建组织工程骨，将其植入兔股骨头坏死模型中，利用Western blot技术检验目的成骨蛋白BMP-2的表达情况，苏木精-伊红染色观察骨小梁的数量与形态，与单基因BMP-2转染模式对比，探讨双基因BMP-2与VEGF-165在未来骨组织工程中的应用前景。

该实验中，术后3，6，9周，3组均有BMP-2蛋白的阳性表达，但单基因转染组、双基因转染组表达量明显多于未转染组，随着时间延长，单基因转染组、双基因转染组BMP-2表达量逐渐增加。术后3周时，单基因转染组、双基因转染组BMP-2表达量差异无显著性意义(P > 0.05)，术后6，9周时，双基因转染组BMP-2表达量较单基因转染组明显升高(P < 0.05)。灰度分析显示：双基因转染组BMP-2目的蛋白/内参表达量比值在术后3个时间段两两比较差异均有显著性意义。结果证明慢病毒介导VEGF-165和BMP-2共转染骨髓间充质干细胞的目的蛋白能在体内持续稳定表达，且作用效果比单基因BMP-2转染形式好。

苏木精-伊红染色结果显示：术后9周，未转染组钻孔周边含部分初级骨小梁，骨小梁含量少，不见其连续性；单基因转染组骨小梁含量较未转染组明显增高，且骨小梁连续性好，但仍不及正常骨组织；双基因转染组充满成熟骨小梁，较单基因转染组致密，网状结构明显，无连续中断，与正常骨组织无明显差异。

Peterson等^[26]报道，骨髓间充质干细胞转导外源性BMP-2可在小鼠模型中修复临界大小的股骨缺损。然而，由于支架内血管网不足，骨髓间充质干细胞表达BMP-2在修复关键性骨缺损方面效果较差。由于组织中血管形成不足，约25%的骨不连骨折在单次BMP-2修复后需要二次植骨^[27]。目前，研究者主要关注骨再生组织中的血管化。VEGF-165具有促进血管生成的作用，也可通过软骨内骨化途径促进骨再生^[28]，理论上，BMP-2联合VEGF-165可增强骨髓间充质干细胞的成骨性。但也有学者指出，VEGF-165、BMP-2双基因共转染与BMP-2单基因转染骨髓间充质干细胞的成骨性无差异，甚至可能会抑制其成骨性^[29]。VEGF-165联合BMP-2的成骨性存在争议。而此次研究结果表明，双基因转染组目的蛋白BMP-2表达较单基因转染组、未转染组效果好，其在各个时间段生成骨小梁的数量与形态明显好于其他两组，在术后9周时，双基因转染组骨小梁的数量、形态及其完整性几乎与正常骨组织无差异。

综上所述，Lv-VEGF-165和Lv-BMP-2双基因转染兔骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨能有效治疗兔股骨头坏死，其目的成骨基因能在体内稳定、高效、持续表达，术后9周生成骨小梁的数量与形态与正常骨组织无明显差异。BMP-2和VEGF-165以何种比例共转染能达到最佳治疗效果，仍需进一步探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染骨髓间充质干细胞复合脱钙松质骨治疗兔股骨头坏死

Bone marrow mesenchymal stem cells co-transfected by lentivirus-mediated bone morphogenetic protein 2 and vascular endothelial growth factor 165 in combination with demineralized bone matrix for treating rabbit femoral head necrosis

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