去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1738

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (22): 3542-3548.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1738

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去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性研究

张自强¹，张以河¹，安琪¹，徐荣荣²，李欢²，王恩博³

¹非金属矿物与固废资源材料化利用北京市重点实验室，中国地质大学(北京)材料科学与工程学院，北京市 102200；²北京湃生生物科技有限公司，北京市 102200；³北京大学口腔医学院口腔颌面外科，北京市 100081

收稿日期:2019-02-22
通讯作者: 张自强，非金属矿物与固废资源材料化利用北京市重点实验室，中国地质大学(北京)材料科学与工程学院，北京市 102200
作者简介:张自强，男，1980年生，河南省三门峡市人，汉族，博士，主要从事生物材料研究。
基金资助:
北京市科技计划专项课题(Z16010101427)，项目负责人：张自强

Study on immunogenicity of type I atelocollagen

Zhang Ziqiang¹, Zhang Yihe¹, An Qi¹, Xu Rongrong², Li Huan², Wang Enbo³

¹Beijing Key Laboratory of Material Utilization of Non-metallic Minerals and Solid Waste Resources, School of Materials Science and Technology, China University of Geosciences, Beijing 102200, China; ²Beijing Peisheng Biotech Co., Ltd., Beijing 102200, China; ³Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Peking University Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China

Received:2019-02-22
Contact: Zhang Ziqiang, Beijing Key Laboratory of Material Utilization of Non-metallic Minerals and Solid Waste Resources, School of Materials Science and Technology, China University of Geosciences, Beijing 102200, China
About author:Zhang Ziqiang, PhD, Beijing Key Laboratory of Material Utilization of Non-metallic Minerals and Solid Waste Resources, School of Materials Science and Technology, China University of Geosciences, Beijing 102200, China
Supported by:
the Science and Technology Program of Beijing, No. Z16010101427 (to ZZQ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

端肽：Ⅰ型胶原蛋白由2条α1多肽链一条α2多肽链组成的三维螺旋结构，核心为不间断重复Gly-X-Y三肽，两侧为球状域前肽，又叫“端肽”，这2个区域是由短的、非螺旋氨基酸序列所组成，是胶原的主要免疫原性位点，它可在提取胶原时被选择性的水解或去除而失活。

α-Gal抗原：是动物组织或器官引起免疫排斥反应的主要靶抗原，是一种含有半乳糖基的糖蛋白或糖脂类抗原物质，人体内存在与Gal抗原反应的特异性IgG天然Gal抗体的存在，导致动物组织或动物源性生物材料移植后免疫排斥反应的发生。

背景：Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性主要分布在分子链的端肽区域，可在胶原蛋白提取过程中通过水解或是去除而使其失活，制备去端肽Ⅰ型胶原蛋白，降低其免疫原性。

目的：评价去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性。

方法：采用酶切、盐析、透析工艺制备去端肽Ⅰ型胶原蛋白，通过考马斯亮蓝对牛血清白蛋白染色极限的分析，鉴定去端肽Ⅰ型胶原蛋白的纯度，依据YY/T 0606.25-2014中规定的方法，利用Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits试剂盒测定去端肽Ⅰ型胶原蛋白的DNA残留量，利用ELISA试剂盒分析去端肽Ⅰ型胶原蛋白的端肽去除效果，依据YY/T 1561-2017标准检测去端肽Ⅰ型胶原蛋白的α-Gal抗原含量。

结果与结论：去端肽Ⅰ型胶原蛋白的纯度可达99.8%，DNA残留量为4 µg/g，C、N末端肽浓度低于试剂盒检测限，α-Gal抗原含量低于检测限。通过酶切、盐析、透析工艺制备的去端肽Ⅰ型胶原蛋白，可显著去除天然胶原蛋白的免疫原性根源，有效控制胶原蛋白临床应用的免疫原性风险。

ORCID: 0000-0002-0679-381X(张自强)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 去端肽胶原蛋白, Ⅰ型胶原蛋白, 免疫原性, DNA残留量, 端肽, α-Gal抗原, 胶原纯度

Abstract:

BACKGROUND: The immunogenicity of type I collagen mainly locates in the telopeptide of molecular chain, which can be inactivated through hydrolysis or removal in the process of collagen extraction. Type I atelocollagen decreases its immunogenicity.

OBJECTIVE: To evaluate the immunogenicity of type I atelocollagen.

METHODS: Type I atelocollagen was prepared by enzyme digestion, salting-out and dialysis. The purity of type I atelocollagen was identified through analyzing the dyeing limit of comassiebule. The residual DNA was detected by Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits described in YY/T 0606.25-2014. The effect of telopeptide removing was detected by ELISA. The content of α-Gal antigen was tested according to the criteria in YY/T 1561-2017.

RESULTS AND CONCLUSION: The purity of type I atelocollagen reached 99.8%. The residual DNA was below 4 µg/g. The contents of N-terminal telopeptide and C-terminal telopeptide were lower than the examination limit. The content of α-Gal antigen was lower than the detection limit. The immunogenicity of collagen is remarkably decreased by preparing type I atelocollagen using enzyme digestion, salting-out and dialysis, which can effectively control its risk of immunogenicity in clinical application.

Key words: atelocollagen, type I collagen, immunogenicity, residual DNA, telopeptide, α-Gal antigen, collagen purity

中图分类号:

张自强，张以河，安琪，徐荣荣，李欢，王恩博. 去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性研究[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(22): 3542-3548.

Zhang Ziqiang, Zhang Yihe, An Qi, Xu Rongrong, Li Huan, Wang Enbo. Study on immunogenicity of type I atelocollagen[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(22): 3542-3548.

图/表（结果） 6

2.1 胶原纯度图4为去端肽Ⅰ型胶原蛋白样品的电泳图谱，图谱上共有4个条带，自上而下依次为分子质量在 270 kD左右的γ链(α链的三聚体)、180 kD左右β链(α链的二聚体)与分子质量在90 kD左右的α2链、α1链，说明所制备的去端肽Ⅰ型胶原蛋白具有胶原蛋白的特征结构-三维螺旋结构。图谱上没有其他杂带，说明所制备的去端肽Ⅰ型胶原纯度较高，蛋白中的杂质可能引起机体发生不希望的免疫学反应，因此控制纯度对于保证动物源材料的安全性至关重要。

经影像分析系统分析显示，去端肽Ⅰ型胶原蛋白纯度为99.8%，表明去端肽Ⅰ型胶原蛋白中，脂质、杂蛋白等杂质的含量处于一个非常微小的范围，杂质可能会引起的免疫学反应得到了有效控制。

2.2 DNA残留量 3种批号去端肽Ⅰ型胶原蛋白的DNA残留量均为4 µg/g，而常规的脱细胞基质中，DNA残留量通常都处于50-100 µg/g范围。表明经过盐析与透析等提纯过程，能够将去端肽Ⅰ型胶原蛋白中DNA残留量控制在极微量的水平^[10]。

2.3 去端肽Ⅰ型胶原蛋白的端肽浓度

2.3.1 去端肽Ⅰ型胶原蛋白的C端肽浓度表1为去端肽Ⅰ型胶原蛋白C端肽吸光度检测结果，A3-B5为标准品的吸光度值，t 检验结果显示3组吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。依据测试结果，以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，绘制标准曲线，其方程式为y= 0.031x+0.298(R²=0.98)，然后将样品的吸光度值代入回归方程，得到C端肽的浓度。

从表2可以看出，3个批次的去端肽Ⅰ型胶原蛋白均未检出C端肽，说明样品中C端肽浓度较低，且明显低于试剂盒检测范围。表明在制备过程中经过酶解过程后^[11-12]，胶原蛋白的C端肽基本已被去除，制备而成的Ⅰ型胶原蛋白具备明显的去C端肽特征。

2.3.2 去端肽Ⅰ型胶原蛋白的N端肽浓度表3为去端肽Ⅰ型胶原蛋白N端肽吸光度检测结果，A3-B5为标准品的吸光度值，t 检验结果显示3组样品吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。依据测试结果，以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，绘制标准曲线，其方程式为其方程式为y=0.152x+0.191(R²=0.97)，然后将样品的吸光度值代入回归方程，得到端N端肽浓度。

从表4可看出，3个批次的去端肽Ⅰ型胶原蛋白均未检出胶原N端肽，说明样品中胶原N端肽浓度明显低于试剂盒检测范围。表明去端肽Ⅰ型胶原蛋白的制备工艺能够去除胶原蛋白N端肽^[10]。

2.4 α-Gal 抗原表5为Gal-牛血清白蛋白标准品浓度与对应的抗α-Gal抗体结合抑制率测试数据，以Gal-牛血清白蛋白标准品浓度为横纵标，抗α-Gal抗体结合抑制率为纵坐标，绘制最佳拟合曲线，见图5，即标准曲线，其公式为y=14.331ln(x)+64.448(R²=0.98)，说明相关性良好^[13]。

如表6检测结果显示，原材料牛跟腱中α-Gal抗原含量为0.61 mg/L，而3批号去端肽Ⅰ型胶原蛋白的α-Gal抗原含量均低于检测限，表明经过了特殊的免疫原性去除工艺过程，去端肽Ⅰ型胶原蛋白中α-Gal抗原含量降低到检测限以下。

2.5 动物实验验证 SD大鼠购自北京金牧阳试验动物养殖有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK-(军) 2012-0004，体质量180-210 g。

为验证胶原蛋白海绵的免疫原性的去除效果，评估其安全有效性，实施了胶原蛋白海绵大鼠股主静脉创伤动物实验^[14]，与胶原蛋白海绵大鼠肝脏创口止血修复动物实验^[15]。胶原蛋白海绵在植入肝脏组织后，生物相容性良好，胶原蛋白海绵材料在肝脏组织中能够逐步降解，促进破损的肝脏组织再次愈合；胶原蛋白海绵对于静脉出血可发挥良好的止血性能，促进创口愈合，柔韧性更佳、黏附性强，且组织相容性好、生物降解快，未引起机体产生不良炎症反应与免疫应答反应。实验方案经北京湃生生物科技有限公司动物实验伦理委员会批准，批准号为001。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE指南)。

2.6 临床试验确认为评估胶原蛋白海绵对促进拔牙手术后的伤口愈合的安全性和有效性，在北京协和医院、首都医科大学附属北京友谊医院及北京口腔医院开展了拔牙创临床试验，临床报告显示海绵止血性能优异，患者术后创面愈合良好，白细胞计数、淋巴细胞计数及红细胞计数均处于正常范围，没有出现GB/T 16886.20-2015中所规定的刺激/急性炎症、免疫抑制、免疫刺激、自身免疫等免疫系统的潜在应答反应，表明艾瑞金胶原蛋白海绵具有较低的免疫原性。根据国家卫生部《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》《药物临床试验质量管理规范》《医疗器械临床试验规定(2004)》《医疗器械临床试验质量管理规范(第25号)》《赫尔辛宣言》《人体生物医学研究国际道德指南》的伦理原则，经北京协和医院、首都医科大学附属北京口腔医院、首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会审查，同意按所批准的临床研究方案、知情同意书等进行此项研究。

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引言

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，广泛分布于哺乳动物的骨、皮肤、肌腱等结缔组织中，占哺乳动物总蛋白的25%-30%，目前已确认的胶原蛋白种类有20余种^[1]。胶原蛋白的分子结构是由2条α1肽链与1条α2肽链组成互相缠绕而成的3股螺旋结构，见图1，每一条肽链都由Gly-X-Y氨基酸序列重复而成。Ⅰ型胶原蛋白的Gly-X-Y重复序列两侧，存在由C端、N端的2个前肽形成的非螺旋结构，即C端肽与N端肽，在蛋白酶的作用下，可将端肽剪切去除，从而制备成熟的去端肽Ⅰ型胶原蛋白^[2]。

胶原蛋白具有良好的生物活性、生物相容性及一定的机械强度，在食品、医学与生物领域都有着广泛的用途。但是免疫原性的存在，导致该类材料的应用受到了一些限制，尽管其具有优异的生物相容性，但不确定的免疫原性，仍然可能使人体产生不良的免疫应答。在1954年以前，甚至认为胶原不具备抗原性，20世纪80年代测定了多种胶原产品的免疫原性，发现非胶原成分或胶原降解产物都会引起免疫反应^[3]。Ⅰ型胶原的免疫原性主要分布在分子链的端肽区域，可在胶原提取过程中通过水解或是去除而使其失活，制备去端肽Ⅰ型胶原蛋白，降低其免疫原性。但胶原中一些潜在的免疫原性物质，如核酸、蛋白、多糖、脂质、α-Gal抗原和其他小分子物质等，仍然可能引起免疫应答，对人体健康带来巨大的安全隐患^[4-5]。

牛跟腱组织中含有丰富的Ⅰ型胶原蛋白成分，牛跟腱是规则的致密结缔组织，其中的胶原纤维较粗大、数量多、排列紧密、互相交织排列，主要是胶原蛋白；细胞种类和数目则较少，主要是成纤维细胞和纤维细胞。由于含细胞少、代谢率低，为不活泼组织且细胞组分含量很少，胶原本身有3种类型的抗原因子，第1类是由胶原肽链非螺旋的端肽引起的，第2类是由胶原3股螺旋的构象引起的，第3类是由α链螺旋区的氨基酸序列引起的，第2类抗原因子只存在于天然抗原分子中，第3类出现在变性胶原分子中，而第1类抗原因子在变性和天然胶原中均存在^[6]。

在众多影响因素中，胶原纯度、α-Gal抗原、端肽的去除、DNA残留量，对去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性起着关键性作用^[7]。目前胶原纯度、α-Gal抗原、端肽的去除、DNA残留量的检测方法已经过多次验证，非常纯熟，并且开发出相关的试剂盒，这些试剂盒已成功上市，如：荧光染色法检测试剂Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits试剂盒、α-Gal 抗原定量检测试剂盒、牛Ⅰ型胶原C端肽酶联免疫分析试剂盒、牛Ⅰ型胶原N端肽酶联免疫分析试剂盒。与传统实验室检测相比，采用试剂盒进行样品甚至直接获得检测结果的分析模式，整个检测过程可实现标准化、流水化工作，简单、快捷、灵敏。因此，实验通过检测胶原纯度、端肽、α-Gal抗原、DNA残留量，对去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性进行评价，为该类产品的临床应用提供实验依据与参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计分析观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年10月至2018年10月在中国地质大学(北京)材料科学与工程学院、北京湃生生物科技有限公司于北京大学口腔医学院完成。

1.3 材料原材料牛跟腱，市售，批号20161027-2；去端肽Ⅰ型胶原蛋白，北京湃生生物科技有限公司提供，批号：20160503，20160419，20160513；牛Ⅰ型胶原C端肽(CTX-I)酶联免疫分析试剂盒，上海广锐生物科技有限公司提供，批号：201608；牛Ⅰ型胶原N端肽(NTX)酶联免疫分析试剂盒，上海广锐生物科技有限公司提供，批号：201608；牛Ⅰ型胶原C端肽标准品，上海广锐生物科技有限公司提供，批号：201608；牛Ⅰ型胶原N端肽标准品，上海广锐生物科技有限公司提供，批号：201608。

去端肽Ⅰ型胶原蛋白为白色或淡黄色海绵状固体。胶原蛋白海绵具有网状多孔支架结构，在扫描电镜下观察到胶原海绵表面呈纤维状，见图2所示，其孔径大小在500 nm以内；在透射电镜下观察胶原蛋白海绵纤维结构，200 nm条件下可清晰地看到胶原纤维形态上呈现“横纹带或横纹褶皱”，见图3中箭头所示，而这横纹带或横纹褶皱正是Ⅰ型胶原三螺旋纤维的典型表现^[8-9]。

胶原蛋白材料由18种氨基酸组成，无酸性蛋白酶残留，采用2种机制进行病毒灭活，病毒降低系数之和≥6 logs，通过了GB/T 16886系列的生物学评价，具有良好的生物相容性与细胞适应性，体内可降解。

实验用试剂：①胶原纯度检测：牛血清白蛋白标准品，胶原蛋白对照品(sigma)，十二烷基硫酸钠，三羟甲基氨基甲烷，细菌胶原酶；②DNA残留量检测：蛋白酶K(Sigma)，荧光染色法检测试剂Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits试剂盒(Invitrogen)；③α-Gal抗原检测：α-Gal抗原定量检测试剂盒，北京三药科技开发公司提供，批号20170213。

实验用仪器与设备：①胶原纯度检测：电泳仪(Mini Protein 3 Cell)；影像分析系统(ImageJ2x)；②DNA残留量检测：荧光酶标仪(Molecular Devices)；低温离心机(Sigma 1-14)；电热恒温水浴锅(D2KW-4)；③α-Gal抗原检测：酶标仪(Spectromax M5)；低温离心机(Sigma 1-14)；匀浆仪(D1000-E)；恒温摇床(HZQ-X100)；高精度天平(FA1104H)；涡旋混合器(VORTEX-Genie2)；④端肽去除：电热恒温水浴锅(D2KW-4)；全波长酶标仪(VARIOSKAN FIASH)。

1.4 实验方法

1.4.1 检测样品原材料牛跟腱与去端肽Ⅰ型胶原蛋白。

1.4.2 去端肽Ⅰ型胶原蛋白的制备工艺研究以牛跟腱为原材料，牛跟腱通过去筋膜、乙醇及碱溶液浸泡、酶解、盐析、透析等步骤达到脱细胞、去除杂蛋白、去除Ⅰ型胶原C端肽与N末端肽等目的。脱细胞过程中去除了α-Gal抗原及残留DNA，酶解过程去除Ⅰ型胶原蛋白端肽结构，盐析透析过程进一步去除α-Gal抗原、残留DNA、端肽、残留的酸性蛋白酶成分。

1.5 主要观察指标

1.5.1 胶原纯度胶原蛋白具有独特的分子结构-3股螺旋，配合特异性的胶原蛋白酶作用，以考马斯亮蓝分析牛血清白蛋白染色极限，可以确定去端肽Ⅰ型胶原蛋白样品中胶原蛋白纯度。具体方法依照《中华人民共和国药典》(2005年版)二部附录VF第五法测定。

聚丙烯酰胺凝胶分析：用超纯水将牛血清白蛋白稀释成梯度浓度，然后分别取20 μL各浓度的牛血清白蛋白溶液上样，接入电极，110 V电压下开始电泳，待溴酚蓝的蓝色到达金属丝时，停止电泳。取下胶片，加入适量的考马斯亮蓝染色液，静置一夜备用，然后以考马斯亮蓝脱色液对样品进行脱色。脱色后的胶片以影像分析系统进行分析，确定考马斯亮蓝对牛血清白蛋白染色极限，以得到胶原纯度^[10]。

1.5.2 DNA残留量依据YY/T 0606.25-2014中规定的方法测定DNA残留量，通过Quant-IT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits试剂盒测定。

配置质量浓度分别为80，40，20，10，5，2.5，0 µg/L的标准品溶液，取每孔125 μL加入96孔黑色酶标板内。将DNA纯化样品适当稀释后，取每孔125 μL加入96孔黑色酶标板内。取适量PicoGreen以1∶1的体积比，与各样品均匀混合，避光环境下反应5 min后，用荧光酶标仪测试。此方法最低检测限为0.3 µg/L。

1.5.3 端肽的去除取适量去端肽Ⅰ型胶原蛋白样品，并将样品溶于3%醋酸中，使胶原最终质量浓度为1 g/L，于56 ℃下水浴24 h后备用。配置浓度分别为7.5，15，30，60，90 nmol/L的胶原C端肽标准品与0.75，1.5，3，6， 9 nmol/L的N端肽标准品，依照ELISA试剂盒检测方法检测样品端肽浓度。

1.5.4 α-Gal 抗原依据《YY/T 1561-2017 组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测》检测样品中α-Gal 抗原的残留量，最低检测限为0.031 25 mg/L。

首先对样本进行预处理，使α-Gal抗原处于完全暴露的状态，然后用裂解液裂解后的α-Gal抗原阴性参考品配置初始质量浓度分别为0.016，0.031 25，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg/L的Gal-牛血清白蛋白标准品。将裂解好的样本和标准曲线样本分别与等体积抗α-Gal抗体反应，静置、离心后，取适当上清液与固相抗原反应，依照ELISA法对样本残留的抗α-Gal抗体进行检测。

1.6 统计学分析数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，正态分布数据用x(_)±s表示，将数据进行方差分析。当P ≤ 0.01时表示差异有非常显著性意义，当P ≤ 0.05时表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前，Ⅰ型胶原蛋白制备的医疗器械被广泛应用于临床，尽管其有效性得到了人们的广泛认可，但它的安全性特别是免疫原性日益受到人们的关注。张静怡等^[16]采用罗飞鱼皮提取Ⅰ型胶原蛋白免疫ICR小鼠，测定小鼠产生的胶原蛋白抗体含量，评价其免疫状况，实验结果显示罗非鱼皮提取Ⅰ型胶原蛋白能够引起免疫原性反应。

Ⅰ型胶原的免疫原性主要分布在分子链的C、N末端，由短的、非螺旋氨基酸序列所组成的端肽区域，端肽是天然Ⅰ胶原蛋白产生免疫原性的根源，因此端肽的去除效果，在很大程度上影响了去端肽Ⅰ型胶原蛋的免疫原性的强弱。因此，在胶原的提取过程中，可通过盐析与透析等过程及采用其他物理或化学方法选择性地使端肽去除或是水解，去除胶原产品中的免疫成分，避免胶原基生物材料在植入人体后，杂质的存在可能会导致过敏、致热或异物反应等不良现象发生，显著降低胶原的免疫原性^[17]，

动物实验验证，材料细胞表面的α-Gal抗原与人体内的抗α-Gal抗体结合，会导致人体发生一系列不良炎症反应^[18-19]。动物组织、器官的移植或者动物源性生物材料的应用，存在超急性及慢性免疫排斥反应的风险。已有相关研究表明，α-Gal抗原是动物组织或器官引起免疫排斥反应的主要靶抗原，是一种含有半乳糖基的糖蛋白或糖脂类抗原物质，广泛存在于动物的小血管(毛细血管、小血管、小动脉)内皮细胞、肝脏实质、肝脏近曲小管、心脏、肺泡、细支气管、胰腺中，人体内存在与Gal抗原反应的特异性IgG天然抗体Gal，人血液循环中有1%-3%的免疫球蛋白是抗-Gal抗体，将动物源性组织中的Gal抗原作为异体移植中超急性免疫排斥反应和慢性免疫反应的靶抗原，导致动物组织或动物源性生物材料移植后免疫排斥反应的发生。α-Gal抗原的残留，在很大程度上可反映动物源性生物材料免疫原的去除程度。尽管动物源性生物材料己被广泛用于临床，但仍然存在残留Gal抗原引起的慢性免疫排斥反应等风险^[20]。为克服异种组织、器官移植后Gal抗原引起的超急性免疫排斥反应，人们将动物来源的组织、器官进行脱Gal抗原处理，用来制备动物源性生物材料，以此减轻人体免疫反应。动物源性生物材料的残留Gal抗原含量检测，是控制产品质量的重要指标之一。

对残留DNA的检测，是控制生物源性材料免疫原性风险的重要指标之一^[21]。在材料的制备过程中，可通过提纯工艺，使DNA残留量低于4 µg/g(干质量)，远低于目前常规的脱细胞基质中DNA的残留水平50-100 µg/g，显著降低由DNA引起的免疫原性。残留DNA引起的免疫原性及脱细胞过程是否充分，均可通过检测残留DNA进行评价，生物材料残留的DNA，可引起人体广泛的免疫反应，人体也会对细菌污染的材料所残留的细菌DNA等产生免疫应答。脊椎动物所特有的DNA中CpG抑制，是一种识别自身和外源DNA的重要免疫机制，能够对自身与外源性DNA进行识别，外源性DNA进入机体时，免疫系统通过识别CpG特征结构做出免疫应答。脊椎动物免疫系统正是通过以未甲基化CpG双核苷为核心的特定核苷酸序列(CpG)特征结构辨别外源DNA，并对其产生免疫应答。残留DNA检测可直接评价由残留DNA引起的免疫原性风险，又能反映脱细胞过程是否完全，因此生物原性材料的残留DNA含量，成了产品脱细胞过程是否充分及免疫原性风险是否得到有效控制的重要产品技术指标之一^[22]。

何创龙等^[23]以脱脂剂、蛋白酶等对牛密质骨进行处理，去除胶原端肽与杂蛋白，制备的胶原基质材料具有优异的力学性能及较低的免疫原性。王秋卓等^[24]通过特殊工艺去除胶原的C、N端肽，并对其进行结构修饰，制备了一种高纯度且无免疫反应的可吸收胶原止血海绵。贠志敏等^[25]利用α-半乳糖苷酶对猪皮细胞及基质的α-Gal抗原进行清除，制备了低免疫原性的猪皮基质敷料，但对α-Gal抗原的去除效果无相关信息。吴世福等^[26]利用MTT法和CFSE法体外研究动物源性胶原蛋白海绵浸提液对小鼠脾脏淋巴细胞转化和增殖作用，并对2种方法的影响因素进行了分析，研究发现胶原蛋白海绵浸提液未引起小鼠体外脾脏淋巴细胞发生明显转化和增殖。

研究采用酶解、透析、冻干、灭菌等工艺所制备的去端肽Ⅰ型胶原蛋白，纯度可达99.8%，DNA残留量为 4 µg/g，远低于50-100 µg/g，C、N末端肽浓度低于试剂盒检测限，即未检出Ⅰ型胶原C、N末端肽，α-Gal抗原含量低于检测限。说明在去端肽Ⅰ型胶原蛋白的制备过程中，酶解工艺对Ⅰ型胶原蛋白的端肽去除效果非常显著，极大降低了Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性。

综上研究表明，采用酶解、透析、冻干、灭菌等工艺制备而成的去端肽Ⅰ型胶原蛋白，其胶原纯度、DNA残留量、端肽的去除及α-Gal抗原均控制在合理范围，动物实验及临床试验表明该类材料植入生物体后临床效果优异，无不良免疫反应与炎症发生，说明去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性得到了有效控制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

去端肽Ⅰ型胶原蛋白的免疫原性研究

Study on immunogenicity of type I atelocollagen

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