激光微孔化脱细胞骨软骨支架的制备及表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0864

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (18): 2836-2842.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0864

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

激光微孔化脱细胞骨软骨支架的制备及表征

刘雪剑^1，2，3，刘士臣¹，孙百川^1，2，3，张凯红^2，3，孟昊业^2，3，王玉^2，3，黄绍代^2，3，鲁长风^2，3，王冲^2，3，余文^2，3，荆晓光^1，2，3，赵跃¹，杨建华^1，4，彭江^2，3

¹佳木斯大学，佳木斯大学附属第一医院，黑龙江省佳木斯市 154007；²中国人民解放军总医院骨科研究所，北京市 100853；³骨科再生医学北京市重点实验室，北京市 100853；⁴深圳市龙岗区人民医院，广东省深圳市 518172

收稿日期:2018-03-16 出版日期:2018-06-28 发布日期:2018-06-28
通讯作者: 彭江，副教授，中国人民解放军总医院骨科研究所，北京市 100853；骨科再生医学北京市重点实验室，北京市 100853
作者简介:刘雪剑，男，1990年生，河南省登封市人，汉族，佳木斯大学在读硕士，主要从事关节外科研究。
基金资助:
北京市科技专项(Z161100005016059)；国家自然科学基金(81572148)；国家重点研发计划(2016YFC1102104)；佳木斯大学科学技术重点项目(基础研究类)(12Z1201507)；黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(201610222058)；黑龙江省教育厅基础研究项目(2016-KYYWF-0548)

Preparation and characterization of laser microporous acellular osteochondral scaffolds

Liu Xue-jian^{1, 2, 3}, Liu Shi-chen¹, Sun Bai-chuan^{1, 2, 3}, Zhang Kai-hong^{2, 3}, Meng Hao-ye^{2, 3}, Wang Yu^{2, 3}, Huang Shao-dai^{2, 3}, Lu Chang-feng^{2, 3}, Wang Chong^{2, 3}, Yu Wen^{2, 3}, Jing Xiao-guang^{1, 2, 3}, Zhao Yue¹, Yang Jian-hua^{1, 4}, Peng Jiang^{2, 3}

¹First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; ²Institute of Orthopedics, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China; ³Beijing Key Laboratory of Orthopaedic Regeneration Medicine, Beijing 100853, China; ⁴People’s Hospital of Longgang District, Shenzhen 518172, Guangdong Province, China

Received:2018-03-16 Online:2018-06-28 Published:2018-06-28
Contact: Peng Jiang, Associate professor, Institute of Orthopedics, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China; Beijing Key Laboratory of Orthopaedic Regeneration Medicine, Beijing 100853, China
About author:Liu Xue-jian, Master candidate, First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; Institute of Orthopedics, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China; Beijing Key Laboratory of Orthopaedic Regeneration Medicine, Beijing 100853, China
Supported by:
the Special Scientific Fund of Beijing, No. Z161100005016059; the National Natural Science Foundation of China, No. 81572148; the National Key Research and Development Plan of China, No. 2016YFC1102104; the Key Scientific Program of Jiamusi University (Basic Research), No. 12Z1201507; College Students Innovation and Entrepreneurship Training Project of Heilongjiang Province, No. 201610222058; the Basic Research Program of Heilongjiang Provincial Education Department, No. 2016-KYYWF-0548

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

细胞外基质：由细胞合成并分泌到胞外的物质，这些物质遍布于细胞表面和细胞之间，细胞外基质可通过其功能(大部分是多功能的)或生物化学信号来诱导影响细胞的迁移、增殖和分化。因此，尽可能多地保留细胞外基质的组成和结构是至关重要的，同种异体或异种材料均具有这两个特征。

微孔化处理：通过CO₂激光机器(机器工作参数可控，能够形成一套客观的标准)对猪膝关节骨软骨的软骨层进行激光烧灼，增加软骨层的孔隙，增加了脱细胞化学物质与支架的接触面积，提高脱细胞效率；同样也有利于种子细胞往支架内部迁移，使细胞发挥更大的作用。

背景：如何制备出既具有软骨源性成分又具有良好初始力学强度的支架，是组织工程软骨研究的方向。

目的：制备微孔化脱细胞骨软骨支架，评价其力学性能及细胞相容性。

方法：取猪膝关节骨软骨，采用激光微孔化技术制作微孔化骨软骨支架，随后利用化学方法制作微孔化脱细胞骨软骨支架，扫描电镜观察支架结构，检测支架的压缩模量。分别采用微孔化脱细胞骨软骨支架浸提液(实验组)、含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM(对照组)培养骨髓间充质干细胞，培养5 d内CCK-8法检测细胞增殖。将骨髓间充质干细胞接种于微孔化脱细胞骨软骨支架上，共培养28 d内进行苏木精-伊红染色与甲苯胺蓝染色，观察细胞生长情况。

结果与结论：①扫描电镜：微孔化脱细胞骨软骨支架表面平整，孔与孔之间分布均匀，纵切面孔深达软骨下骨；②力学性能：微孔化脱细胞骨软骨支架的平均压缩模量为0.77 MPa，接近于正常骨软骨压缩模量(1.15 MPa)；③CCK-8实验：实验组培养1，2，3，4，5 d的细胞增殖与对照组无差异；④共培养实验：苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色显示，培养1 d后，大量骨髓干细胞在微孔化脱细胞骨软骨支架孔隙中生长，培养7 d后有少量细胞贴孔壁生长，孔隙中有少量细胞生长；培养21 d后，孔壁上有少量细胞贴壁生长，孔隙中有少量细胞生长；培养28 d后，孔壁上有少量细胞贴壁增殖，孔隙中有大量细胞成团增殖；⑤结果表明：微孔化脱细胞骨软骨支架具有良好的力学性能及细胞相容性。

ORCID: 0000-0002-1841-0214(刘雪剑)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 软骨组织工程, 脱细胞, 骨软骨支架, 共培养, 骨髓间充质干细胞, 激光微孔化, α-Gal抗原检测, 生物相容性, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Preparing a scaffold with cartilage derived components and good initial mechanical strength is the direction of tissue engineering cartilage research.

OBJECTIVE: To prepare porous acellular osteochondral scaffolds, and to explore their mechanical properties and cell compatibility.

METHODS: Osteochondral bone from the porcine knee joint was taken, and then porous osteochondral scaffolds were made by laser microporation technology. Subsequently, the scaffolds were decellularized chemical methods. Scaffold structure was observed by scanning electron microscopy, and the compression modulus of the scaffolds was determined. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in L-DMEM containing 10% fetal bovine serum (control group) and cultured in the medium extract of porous acellular osteochondral scaffolds (experimental group), respectively. Cell proliferation was detected by cell counting kit-8 method within 5 days of culture. Bone marrow mesenchymal stem cells were seeded on the porous acellular osteochondral scaffolds, and within 28 days of co-culture, cell growth was observed by hematoxylin-eosin staining and toluidine blue staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Observation under scanning electron microscopy: The porous acellular osteochondral scaffolds had the smooth surface with evenly distributed pores. The pores of the scaffold extended longitudinally into the subchondral bone. (2) Mechanical properties: The average compressive modulus of porous acellular osteochondral scaffolds was 0.77 MPa, which was close to the compression modulus of the normal cartilage (1.15 MPa). (3) Cell counting kit-8 test: There were no differences in cell proliferation between the control and experimental groups at 1, 2, 3, 4 and 5 days of culture. (4) Cell-scaffold co-culture: A large amount of bone marrow mesenchymal stem cells were observed to be adherent to the scaffold after 1 day of culture through hematoxylin-eosin and toluidine blue staining. However, as time went on, a few cells adhered to the pore wall or grew into the pores at 7 and 21 days of culture. There were also some adherent cells but a large amount of cell masses formed in the pores at 28 days of culture. To conclude, the porous acellular osteochondral scaffold has good mechanical properties and cell compatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Materials Testing, Cell Proliferation, Cytotoxicity Tests, Immunologic, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘雪剑，刘士臣，孙百川，张凯红，孟昊业，王玉，黄绍代，鲁长风，王冲，余文，荆晓光，赵跃，杨建华，彭江. 激光微孔化脱细胞骨软骨支架的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(18): 2836-2842.

Liu Xue-jian, Liu Shi-chen, Sun Bai-chuan, Zhang Kai-hong, Meng Hao-ye, Wang Yu Huang Shao-dai, Lu Chang-feng, Wang Chong, Yu Wen, Jing Xiao-guang, Zhao Yue, Yang Jian-hua, Peng Jiang . Preparation and characterization of laser microporous acellular osteochondral scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(18): 2836-2842.

图/表（结果） 8

2.1 支架组织学染色和抗原含量检测扫描电镜下观察支架表面平整，孔与孔之间分布均匀，纵切面孔深达软骨下骨，孔径范围为250-300 μm(图2)；α-Gal抗原试剂盒检测多孔骨软骨支架脱细胞前后抗原数量比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3；苏木精-伊红及DAPI染色显示，支架脱细胞后细胞成分及抗原含量去除满意(图4)。

2.2 支架力学性能检测结果根据计算得到压缩模量，微孔化骨软骨支架的压缩模量平均为0.77 MPa，与正常软骨的1.15 MPa相比较无差异(P > 0.05)，见图5。

2.3 骨髓间充质干细胞的三系诱导及流式细胞鉴定结果在脂肪诱导培养基中培养8 d后，可看到大部分细胞中出现了脂滴，经过油红“O”染色后呈红色；在成骨诱导培养基中培养3周，可看到细胞呈团块状生长，茜素红染色呈现红色；在软骨培养基中培养24 h后可看到细胞成球生长，培养28 d后，阿尔新蓝染色可见细胞周围基质呈蓝色(图6)。流式细胞仪检测细胞表面抗原，高表达CD29和CD71，低表达CD34和CD45(图7)。

2.4 CCK-8细胞毒性实验结果实验组培养第1天的吸光度值与第3，4，5天相比差异有显著性意义(P < 0.05)；对照组培养第1天的吸光度值与第4，5天相比相比差异有显著性意义(P < 0.05)，培养第2，3天的吸光度值与第5天相比差异有显著性意义(P < 0.05)；实验组培养不同时间点的吸光度值与对照组相比无差异，见图8。因此，在两种培养基中，骨髓干细胞具有良好的生长状况。

2.5 支架与细胞共培养结果苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色显示，共培养1 d后，可看到呈紫色的大量骨髓干细胞在微孔化脱细胞骨软骨支架孔隙中生长；共培养7 d后，可看到有少量细胞贴支架孔壁生长，支架孔隙中有少量细胞生长；共培养21 d后，孔壁上有少量细胞贴壁生长，支架孔隙中有少量细胞生长；共培养28 d后，可看到支架孔壁上有少量细胞贴壁增殖，支架孔隙中有大量细胞成团增殖，见图9。

参考文献

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引言

正常软骨没有血供、神经支配及淋巴回流，因此关节软骨自我修复能力有限，损伤后的关节软骨再生是临床上具有挑战性的难题^[1]。然而，临床中又有许多疾病(关节创伤、肢端肥大症、自身免疫性疾病等)导致了骨性关节炎的发生，加重了软骨损伤^[2]。随着治疗技术的不断进步，关节软骨损伤后也由单纯的服用药物缓解疼痛症状发展到微骨折术、自体软骨细胞移植等方法，但多数病例不能获得满意的疗效，修复形成的组织大部分是纤维软骨。进而也有用自体软骨移植的方法修复软骨缺损，尽管这种方法能在缺损处形成光滑的表面，但是同样出现了供区组织损伤、术后负重区移植物沉降和移植物与宿主之间腔隙难以修复的新问题^[3]，这对患者造成了二次伤害。软骨工程组织的出现为软骨缺损的修复提供了新的方法^[4]。

一系列研究表明，组织工程技术是修复关节软骨的有效途径^[5-6]。其方法在于将支架复合种子细胞，制备成人工软骨^[7]。而支架要求多孔，孔隙率在80%以上，虽然有利于细胞营养^[8]，但这将影响组织工程软骨的初始力学强度^[9]。对于支架的孔径有研究表明，在成软骨诱导条件下，孔径为200-450 μm更有利于干细胞往成软骨方向分化，有利于细胞向支架深部迁移^[10]。因此，如何制备出既具有软骨源性成分又具有良好初始力学强度的支架，是组织工程软骨研究的方向。

此次实验在前期研究的基础上，采用激光打孔技术制备微孔猪关节软骨，再进行化学方法脱细胞处理，采用该方法不仅保持支架的完整性，还有助于细胞在支架微孔结构中的迁移，能够为干细胞生长提供良好的空间环境。这为组织工程修复提供了新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组对照体外培养实验。

1.2 时间及地点实验于2016年9月至2017年5月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料新鲜健康猪膝关节(北京市岳各庄市场)；成脂诱导培养基(美国赛业公司)；CD29、CD71、CD34、CD45 (美国BD公司)；α-Gal抗原检测试剂盒(北京三药公司)；DAPI染色液(北京化学试剂有限公司)；CCK-8试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司)；L-DMEM、DNase、RNase、SDS(Sigma公司)；离心机(美国赛默飞世尔公司)；胎牛血清(美国康宁公司)；CO₂激光机器(北京红阳晨升科技有限公司，参数为：速度4.00 mm/s，功率100%，布孔距离0.6 mm，出光时间50 s)；冰冻切片机(德国徕卡公司)；荧光显微镜、光镜显微镜(日本奥林巴斯公司)；扫描电镜(德国蔡司公司)；BOSE材料试验机(美国BOSE公司)；CO₂恒温培养箱(德国Hereus公司)；酶标仪(美国伯腾公司)。

实验动物：出生24 h的SD大鼠6只，由军事医学科学院提供。

1.4 实验方法

1.4.1 微孔化脱细胞骨软骨支架的制备用直径为8 mm的环钻在猪膝关节内外髁钻取直径为8 mm的骨软骨支架，将其打磨成厚度为4 mm的骨软骨柱。将制备好的组织工程支架浸泡于0.01 mol/L PBS中，经CO₂激光机器激光头发出的激光束烧灼骨软骨支架软骨层，进行微孔化处理，孔径300 μm，孔间距300 μm，孔深达软骨下骨(孔深可根据速度、出光时间、功率的改变而变化)(图1)。将制备好的骨软骨支架放入10 mmol/L Tris-HCl(含蛋白酶抑制剂)中，反复清洗多次。再将骨软骨支架放入2%SDS洗涤液(内含蛋白酶抑制剂)中，于37 ℃恒温摇床48 h，去除细胞成分，反复用PBS冲洗，直至液体清亮无泡沫。冲洗后将支架置于1 U/mL RNase和50 U/mL DNase混合液中，37 ℃恒温摇床中24 h。反复用PBS冲洗，用γ射线辐照消毒，照射量为25 kGy，照射时间5-10 h，4 ℃冰箱保存^[11]。

1.4.2 组织工程支架的组织学观察将制备的支架通过冰冻切片机切成10 μm，通过苏木精-伊红染色液染色，在光镜显微镜下观察，于载玻片上滴DAPI染色液染色5 min，PBS冲洗3遍，在荧光显微镜下观察，比较支架脱细胞前后情况。扫描电镜观察脱细胞后支架微观结构。

按照α-Gal抗原检测试剂盒操作说明，将浓缩的纯化水稀释20倍，分别将萃取好的脱细胞处理支架和未经脱细胞处理支架液体抽出到100 μL孔板中，做好标记，用封板膜封板后，置于37 ℃温箱中60 min，移液枪吸干孔中液体，再每孔加入洗液200 μL，浸泡30 s，弃去洗液，如此洗涤5遍，每孔中加酶标试剂100 μL，封板膜封板，置于37 ℃温箱中30 min，继续清洗5遍，将A液和B液等体积混合均匀，每孔加入混合好的显色液100 μL，37 ℃温箱30 min，取出孔板，迅速在每孔加终止液50 μL，轻轻振荡均匀，立即在450 nm波长下检测OD值，再通过IR={(M-b)-(T-b)}/ (M-b)×100%公式算出各组与抗体I的结合抑制率，然后乘以1.82×10¹⁴/μg，得到Gal抗原含量。

1.4.3 支架力学性能检测取直径为8 mm、厚度4 mm的微孔化支架与正常新鲜猪骨软骨各4个，置于BOSE材料试验机下，连接传感器，计算压缩模量，分析支架的力学性能^[12]。

1.4.4 骨髓间充干细胞的分离培养取出生24 h的SD大鼠，脱颈法处死后，浸泡于体积分数75%乙醇消毒5 min，移于超净台下，剪下的股骨和胫骨浸泡于无血清的培养基中，把取下来的骨头剪成1-3 mm³大小的颗粒状，转移入6个25 cm²的培养瓶中，加入含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中，72 h后半量换液，96 h后1∶1传代。

干细胞的鉴定：取传代后的第2代干细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导。①成脂诱导：将骨髓间充质干细胞以1× 10⁸ L^-1细胞浓度接种于无血清培养基的6孔板中，3 h后观察细胞状态良好，每孔更换成成脂诱导培养基2 mL，诱导液A液的成分为：成脂诱导分化基础培养基A液，含基础培养基、体积分数10%胎牛血清、10 μmol/L双抗、2 μmol/L胰岛素、10 μmol/L谷氨酰胺、1 μmol/L罗格列酮、1 μmol/L IBMX、1 μmol/L的地塞米松；诱导液B液，含基础培养基、体积分数10%胎牛血清、10 μmol/L双抗、10 μmol/L谷氨酰胺、2 μmol/L胰岛素。A液诱导72 h，换成B液诱导24 h，以此交替培养4次，继续用B液培养7 d直至脂滴成型，油红“O”染色鉴定；②成骨诱导：与成脂诱导步骤基本一致，把培养基换成成骨诱导培养基，其成分为：基础培养基、10 μmol/L双抗、10 μmol/L谷氨酰胺、体积分数10%胎牛血清、10 μmol/L β-甘油磷酸钠、2 μmol/L抗坏血酸、 0.1 μmol/L地塞米松。每隔3 d换1次液，诱导2-4周后，用茜素红进行染色鉴定；③成软骨诱导：成软骨诱导时，取0.5 mL细胞浓度为5×10⁸ L^-1的细胞混悬液，置于离心管中，室温下200 r/min离心5 min，加入成软骨诱导液(成软骨诱导分化基础培养基，0.1 μmol/L地塞米松，1 μmol/L脯氨酸，10 μmol/L ITS添加物，1 μmol/L丙酮酸钠，3 μmol/L抗坏血酸，10 μmol/L转化生长因子β3)。当出现聚拢现象后(一两天时间)清弹离心管底部使软骨团块脱落悬浮，2 d换液1次，每次0.5 mL，共28 d，对软骨团块福尔马林固定，石蜡包埋切片，阿尔新蓝染色^[13]。

取培养的第2代骨髓间充质干细胞，胰酶消化使贴壁的细胞脱壁，1 000 r/min离心5 min，用PBS洗涤2次；细胞计数，将细胞浓度调整为1×10⁹ L^-1，加入大鼠单克隆抗体常温避光孵育30 min；PBS洗涤2次重悬，流式细胞仪检测CD29、CD71、CD34、CD45的表达。

1.4.5 CCK-8毒性实验检测将微孔化脱细胞骨软骨支架置于离心管中，按表面积1.25 cm²/mL的比例加入含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM，置于恒温培养箱中24 h，制备材料浸提液。取第2代骨髓间充质干细胞，进行细胞计数后，以2×10³/孔接种于96孔板中，分2组干预，实验组加入100 μL材料浸提液，对照组加入100 μL含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM，每组3复孔。每天固定时间换液，使培养液均为100 μL，于设定的时间点每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，然后用波长为450 nm的酶标仪进行测量。

1.4.6 骨髓间充质干细胞与组织工程支架共培养将已消毒的微孔化脱细胞骨软骨支架置于6孔板中，将细胞浓度为5×10⁹ L^-1的骨髓间充质干细胞接种于支架上，加入含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM。培养1，7，21，28 d。进行苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色，观察细胞在支架中的生长情况。

1.5 主要观察指标微孔化脱细胞骨软骨支架的理化性能及细胞相容性。

1.6 统计学分析通过SPSS 22.0软件进行分析。采用单因素方差分析(One-wayANOVA)进行组间比较，采用独立样本t 检验进行两两比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在组织工程中，支架的应用能够促进种子细胞的生长、黏附和增殖^[14]。许多研究机构开发了大量的可降解材料合成支架，但在临床应用方面收效甚微。并且，目前还没有获得有关部门批准的支架^[15]。尽管自体软骨移植仍然是目前病变软骨重建的最好方法，但也存在着各种弊端，如对供体部位造成的损伤、自体软骨组织可获得部位有限及移植后退变等，使其临床应用更加复杂^[16-17]。合成支架和自体软骨移植具有很大的局限性^[18-20]。如果是生物来源组织工程支架则显示出巨大优势，有报道利用异种脱细胞软骨作为修复支架，显示出良好的力学和生物学特性，但细胞大多聚集在表层，无法深入支架内部^[14]。

如上所述，通过化学方法进行脱细胞技术可去除骨软骨支架中的细胞成分和α-Gal抗原，极大消除了免疫原性，此方法已被广泛应用于组织工程技术中^[21-22]，此次实验制作的支架保留了软骨层、软骨下骨及骨质层，与天然组织结构相似。

此次实验骨软骨支架具有一定的力学性能，与以往的支架相比具有较高的抗压缩性能^[23]，与正常软骨组织相比力学性能下降并不明显，可为组织修复提供可靠的力学强度。

骨髓间充质干细胞在组织工程领域是一种具有潜力的细胞类型^[24]，它诱导出的软骨细胞能够分泌富含Ⅱ型胶原的透明质酸样细胞外基质，有临床实验用骨髓间充质干细胞修复大面积软骨缺损的报道，随访结果显示缺损修复良好^[25-27]。通过三系诱导及流式细胞分析，培养的骨髓间充质干细胞具有良好的分化性能，为支架共培养提供了良好种子细胞。

支架与细胞共培养实验中，与其他脱细胞支架不同^[14]，此次实验主要对脱细胞骨软骨支架进行激光微孔处理，使之形成多孔，使细胞能够深入支架内部^[28-29]。实验表明骨髓间充质干细胞与支架共培养中，与培养1 d的相比，7 d后细胞数量明显减少，而之后随着培养天数的增加，细胞数量也不断增多。考虑原因可能为早期换液时细胞从孔隙中流失，而之后细胞不断增殖，孔隙中及孔壁上的细胞数量也不断增多。长期共培养可看出支架有利于细胞的贴附及增殖。考虑实验中细胞的流失，需要找到一种不可降解的生物膜覆盖在支架软骨层表面，防止细胞从孔中流失，并且也不会影响培养液的渗透。

此次实验制备的多孔脱细胞骨软骨支架具有良好的生物相容性，能为细胞提供合适的生长环境，有利于细胞的黏附和增殖；微孔结构深达软骨下骨，有利于细胞向支架深部长入，改良了整块软骨组织脱细胞后孔隙过小不利于细胞长入和迁徙的缺点^[23^，^30]，可促进骨、软骨同时修复；支架保留了软骨下骨结构，其一体化结构得到了最大程度的保留，是一种良好的支架，弥补了传统双相和多向支架移植动物体内各部易分离的缺点^[11]。此支架可能对支架在缺损修复区重塑有一定的促进作用，尤其对大面积软骨缺损修复也有重要意义，需要动物体内实验去进一步验证。此次实验对软骨组织工程修复的研究方面提供了良好方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

激光微孔化脱细胞骨软骨支架的制备及表征

Preparation and characterization of laser microporous acellular osteochondral scaffolds

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