黄芪多糖抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的作用途径

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1255

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
血管紧张素Ⅱ：是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽，通过与特异性受体结合，对心血管结构和功能产生影响，是重要的促心肌肥大因子。AngⅡ可通过内分泌、自分泌/旁分泌以及胞内分泌发挥作用，作为一种 Gq 蛋白激动因子，它已经被证明能够在多种模型中诱导肥大反应。
黄芪多糖：是从黄芪中分离得到的一种大分子化合物，是黄芪的主要活性成分，具有增强心肌收缩力、改善心肌供血和心肌代谢的药理学作用。

摘要
背景：黄芪多糖是中药材黄芪中重要的天然有效成分，具有抗应激、抗氧化、抗自由基和降血糖等药理作用。
目的：分析黄芪多糖对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的作用及可能的机制。
方法：大鼠心肌细胞株H9c2：中山大学实验中心馈赠。将培养的H9c2心肌细胞随机分为空白对照组，血管紧张素(10-6 mol/L)组；血管紧张素(10-6 mol/L)+黄芪多糖(10-6 mol/L)高浓度组；血管紧张素(10-6 mol/L)+黄芪多糖(10-7 mol/L)中浓度组；血管紧张素(10-6 mol/L)+黄芪多糖(10-8 mol/L)低浓度组。在体积分数10%FBS的DMEM培养液中培养48 h，检测H9c2心肌细胞表面积、蛋白浓度、细胞存活率及肥大相关基因心房利钠肽、脑利钠肽的mRNA表达，观察黄芪多糖对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大的作用。
结果与结论：①与空白对照组相比，血管紧张素Ⅱ组H9c2心肌细胞表面积显著增加(P < 0.05)，加入黄芪多糖后，H9c2心肌细胞表面积减小，尤其黄芪多糖高浓度组心肌细胞表面积较空白对照组明显减小(P < 0.05)；②血管紧张素Ⅱ组细胞总蛋白含量及心肌细胞肥大相关基因的mRNA表达较空白对照组增加(P < 0.05)，黄芪多糖高浓度组H9c2心肌细胞总蛋白含量及黄芪多糖高、中浓度组心肌细胞肥大相关基因的mRNA的表达显著下调(P < 0.05)；③与血管紧张素组相比，黄芪多糖高、中浓度组能明显提升心肌细胞存活率(P < 0.05)；④结果说明，黄芪多糖可有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8618-5880(李琴)

关键词: 黄芪多糖, 心肌肥大, 血管紧张素Ⅱ, NF-κB

Abstract:

BACKGROUND: Astragalus polysaccharide, an important ingredient of astragalus, exerts pharmacological effects of anti-stress, anti-oxidation, anti-free radical and can reduce blood glucose.
OBJECTIVE: To explore the effect of astragalus polysaccharide on angiotensin II-induced cardiac hypertrophy and the underlying mechanism.
METHODS: H9c2 cardiomyocytes were provided by Experimental Center of Sun Yat-sen University, and then randomly divided into control group, angiotensin II (10-6 mol/L) group, angiotensin II (10-6 mol/L)+astragalus polysaccharide (10-6 mol/L) group, angiotensin II (10-6 mol/L) +astragalus polysaccharide (10-7 mol/L) group, and angiotensin II (10-6 mol/L)+astragalus polysaccharide (10-8 mol/L) group. The cells were cultured in the DMEM containing 10% fetal bovine serum for 48 hours. The surface area of cardiomyocytes, protein concentration, cell viability, and the mRNA expression of hypertrophy-related genes atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide were detected to investigate the effect of astragalus polysaccharide on angiotensin II-induced cardiac hypertrophy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, angiotensin II significantly increased the surface area of H9c2 cardiomyocytes (P < 0.05). The cell area was significantly decreased after addition of astragalus polysaccharide compared with the control group, especially 10-6 mol/L astragalus polysaccharide (P < 0.05). (2) The total protein content and expression level of hypertrophy-related genes in the angiotensin II group were significantly higher than those in the control group. The total protein content and expression level of hypertrophy-related genes in the angiotensin II (10-6 mol/L)+astragalus polysaccharide (10-6 mol/L) and angiotensin II (10-6 mol/L)+astragalus polysaccharide (10-7 mol/L) groups were significantly down-regulated (P < 0.05). (3) Compared with the angiotensin II group, the survival rate of cardiomyocytes was increased significantly in the angiotensin II (10-6 mol/L)+astragalus polysaccharide (10-6 mol/L) and angiotensin II (10-6 mol/L)+astragalus polysaccharide (10-7 mol/L) groups (P < 0.05). (4) These results indicate that astragalus polysaccharide can effectively improve cardiac hypertrophy induced by angiotensin II.

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Key words: astragalus polysaccharides, cardiac hypertrophy, angiotensin II, nuclear factor-κB

中图分类号:

R496

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图/表（结果） 1

2.1 各组心肌细胞表面积利用激光共聚焦对细胞表面积进行定量分析见图1。结果发现：与空白对照组相比，血管紧张素组细胞表面积明显增大(P < 0.05)。与血管紧张素组相比，黄芪多糖高浓度组细胞表面积明显减小(P < 0.05)。

2.2 各组心肌细胞肥大相关基因mRNA表达与空白对照组比较，血管紧张素组肥大相关基因的mRNA表达明显增加(P < 0.05)；加入黄芪多糖后，黄芪多糖高、中浓度组的肥大相关基因的mRNA表达水平明显下降(P < 0.05)。见图2。

2.3 各组心肌细胞的存活率采用MTT法测定各组心肌细胞存活率，结果发现，与空白对照组细胞相比，血管紧张素组在给药72 h后，H9c2心肌细胞处的存活率开始降低(P < 0.05)，与血管紧张素组相比，黄芪多糖高浓度组、中浓度组H9c2心肌细胞存活率都明显增加(P < 0.05)，见图3，提示黄芪多糖可提高血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞的存活率。

2.4 各组细胞总蛋白浓度采用BCA法测定各组心肌细胞蛋白含量的分析见图4。与空白对照组比较，血管紧张素组蛋白浓度增加；加入黄芪多糖后，黄芪多糖高、中浓度组蛋白浓度下降。

2.5 各组心肌细胞中NF-κB的表达与分布采用Western Blot法测定各组心肌细胞中IκB-α蛋白表达，结果发现血管紧张素组细胞IκB-α蛋白表达下降(P < 0.05)；与血管紧张素组相比，黄芪多糖高浓度组细胞IκB-α蛋白表达升高(P < 0.05)。提取H9c2心肌细胞胞核蛋白，进一步观察P65的蛋白表达情况，结果发现血管紧张素组细胞核蛋白中P65表达增加，而黄芪多糖能抑制P65在核蛋白中的表达。荧光结果也显示：血管紧张素Ⅱ刺激P65在细胞核中的表达，而黄芪多糖能改善这一情况。见图5。

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引言

据不完全统计，全球每年死于心血管疾病和脑卒中的人数约占所有死亡的1/3^[1]。如何通过有效的干预手段降低心血管疾病发病率与死亡率，已经成为一个日益迫切的重大公共卫生问题。心肌肥大是心血管发病率和死亡率增加的独立危险因素^[2-3]，主要表现为心肌细胞体积增大、质量增加、间质细胞增生以及心肌重构等，长期的心肌肥大可导致冠心病、心律失常、心力衰竭和猝死^[4-6]。研究发现压力负荷和神经体液因子是心肌肥大重要的诱发因素，而血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中主要的活性激素之一，其和AT1受体结合后，能激活胞内多个信号转导途径，诱导心肌细胞发生肥大，并最终导致心脏功能由代偿逐渐走向失代偿^[7-10]，因此研究血管紧张素诱导的心肌肥大作用机制有着十分重要的意义。

黄芪多糖是中药材黄芪中重要的天然有效成分，具有抗应激、抗氧化、抗自由基和降血糖等药理作用^[11-14]。研究发现，黄芪多糖能降低心肌细胞凋亡率，提高缺氧/复氧损伤心肌细胞的存活率及心脏血流动力^[15-16]，还可通过干预心肌细胞能量代谢预防心衰的发生^[17-19]。然而黄芪多糖是否可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大尚未见报道。

实验拟用黄芪多糖干预血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞肥大，通过检测细胞表面积、心肌细胞总蛋白浓度、肥大相关基因mRNA表达及NF-κB和P65蛋白的表达与分布，观察黄芪多糖对血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞肥大的作用，探索治疗心肌肥大的有效方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2017年7月至2018年6月在广东医科大学科研中心完成。

1.3 材料

1.3.1 药品与材料黄芪多糖(上海源叶生物，批号：20171206210)；血管紧张素Ⅱ(sigma，美国)；RNAiso Plus(Taκara)；胚胎牛血清(FBS，Thermo Fisher Scientific，美国)；RIPA裂解液(碧云天)。

1.3.2 仪器 CO₂培养箱(Applied Biosystems公司，美国)；PCR仪(BD Biosciences，美国)；电泳仪(Bio-Rad，美国)；LSM780激光共聚焦显微镜(ZEISS，德国)。

1.3.3 细胞株大鼠心肌细胞株H9C2：中山大学实验中心馈赠。

1.4 方法

1.4.1 H9c2心肌细胞的培养和模型的建立取对数生长期的H9c2心肌细胞接种于六孔板上，细胞浓度为4.8× 10⁸L^-1，以含体积分数10%FBS的DMEM培养液培养24 h，待细胞贴壁后，再将细胞以无血清的DMEM培养液饥饿培养12 h。随机分为空白对照组，血管紧张素组(10^-6 mol/L)，血管紧张素+黄芪多糖(10^-6 mol/L)高浓度组，血管紧张素+黄芪多糖(10^-7 mol/L)中浓度组和血管紧张素+黄芪多糖(10^-8 mol/L)低浓度组。用含体积分数10%FBS的DMEM培养液继续培养48 h，期间除空白对照组外，其余各组均给予血管紧张素Ⅱ(10^-6 mol/L)诱导肥大，给药组再用不同浓度的黄芪多糖进行干预。

H9c2心肌细胞培养
细胞来源：	大鼠心肌细胞株H9c2由中山大学实验中心馈赠
培养基介绍：	含体积分数 10%FBS的DMEM培养基；无血清的DMEM培养基
添加材料：	根据分组分别添加：血管紧张素(10^-6mol/L)组；血管紧张素(10^-6mol/L)+黄芪多糖(10^-6mol/L)高浓度组血管紧张素(10^-6mol/L)+黄芪多糖(10^-7mol/L)中浓度组血管紧张素(10^-6mol/L)+黄芪多糖(10^-8 mol/L)低浓度组
培养时间：	48 h
传代情况：	细胞培养三四天后进行传代，7-10 d取对数生长期的H9c2心肌细胞进行实验。

1.4.2 H9c2心肌细胞表面积测定取各组对数生长期的H9c2心肌细胞，进行相应处理后弃去培养基，37 ℃的PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛室温固定15 min。PBS洗2次，加入0.1%曲拉通室温避光孵育30 min。PBS洗3次，每次 5 min。每孔加入100 μL配好的0.5% rhodamine- phalloidin，室温避光孵育30 min；置于摇床上用PBS洗3次，每次5 min。再加入DAPI染液，室温避光孵育10 min，激光共聚焦显微镜进行观察，随机选取5次实验的7个视野，每个视野包含心肌细胞5-10个，测量100-120个细胞表面积，并利用Image-J图像分析软件对细胞表面积计算结果。

1.4.3 RT-PCR法检测H9c2细胞肥大相关基因的mRNA表达取各组对数生长期的H9c2心肌细胞，进行相应处理后弃去培养基，用Trizol试剂提取细胞总RNA，使用超微量紫外-可见光分光光度计测定RNA浓度、纯度和质量，参照Takara公司RT-PCR试剂盒说明书，用反转录试剂(Fermentas)将提取的RNA配置20 µL反应液，将反应液置于PCR仪中进行DNA去除和反转录反应。心房利钠肽、脑利钠肽的引物均由英潍捷基贸易有限公司代为合成(序列见表1)，反应体系和条件如下：①加入5 * DNA erasing buffer(4 µL)和gDNA eraser(2 µL)，42 ℃，2 min)；②加入5× PrimeScript buffer(4 µL)、PrimeScript RTase(1 µL)，Oligo dT Prime (1 µL)、RNA(0.8 µL)、RNase-free dd H₂O (Up to 20)，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，最后通过检查PCR反应体系中荧光的信号强度对目的基因进行定量。

表1 相关基因引物序列

Table 1 Primer sequence

基因名称	引物序列
心房利钠肽	Fw: 5' GGA AGT CAA CCC GTC TCA3'
心房利钠肽	Rev: 5' AGC CCT CAG TTT GCT TTT3'
脑利钠肽	Fw: 5' TTT GGG CAG AAG ATA GAC CG3'
脑利钠肽	Rev: 5' AGA AGA GCC GCA GGC AGA G3'
GAPDH	Fw: 5' AGG AGT AAG AAA CCC TGG AC3'
GAPDH	Rev: 5' CTG GGA TGG AAT TGT GAG3'

1.4.4 MTT法检测细胞存活率取各组对数生长期的H9c2心肌细胞，进行相应处理后弃去培养基，每孔加入 10 μL(5 g/L)的MTT溶液，继续培养4 h，待结晶充分形成后，用移液枪小心吸干培养基，加入100 μL二甲基亚砜溶解液，结晶全部溶解后，于酶标仪下，570 nm测吸光度，最后以自身对照计算作图。

1.4.5 BCA法测定细胞总蛋白浓度取对数生长期的H9c2心肌细胞，进行相应处理后弃去培养基，用预冷的PBS冲洗3次，弃PBS，每孔加入35 μL全细胞裂解液(PMSF∶RIPA 1∶100)，在冰上用细胞刮将细胞全部刮下，移至1.5 mL离心管，冰上孵育30 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清液，参照Thermo公司BCA蛋白定量试剂盒说明书，用BCA蛋白标准液将提取的蛋白配置反应液，每孔200 µL A+B混合液，5 μL BSA蛋白标准液，20 μL PBS，每个样本设置2个复孔以减小误差。充分混匀后， 37 ℃，孵育30 min，用酶标仪于570 nm处测定各孔的吸光度值，得出蛋白定量标准曲线回归方程。

1.4.6 Western Blot检测细胞中NF-κB及P65蛋白表达取各组对数生长期的H9c2心肌细胞，进行相应处理后，收集细胞，计数，弃去培养基，按照1∶99比例配制蛋白酶抑制剂混合物和抽提试剂，1×10⁷细胞中加入1 mL试剂A(Cytosol Extraction Buffer A)，涡旋5 s以充分混匀，冰上孵育20 min，每孔加入40 μL试剂B(Cytosol Extraction Buffer B)，涡旋5 s，冰上孵育1 min，4 ℃ 12 000 r/min (13 400 ×g)离心15 min，收集上清至另一离心管中(此提取液为胞浆蛋白)，沉淀加入100μL试剂N(Nuclear Extraction Buffer)，涡旋5 s，重悬沉淀，冰上孵育40 min，每隔10 min涡旋混匀1次，每次15-30 s，4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min，收集上清至另一离心管中(此提取液为胞核蛋白)，将样品与5×loading buffer混匀后沸水中煮5 min使蛋白彻底变性，根据蛋白分子量大小配制分离胶和浓缩胶，进行SDS-PAGE电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，再转PVDF膜，电转完成后1×TBST洗膜2次，每次5 min，将PVDF膜置于含5 %脱脂奶粉的TBST中，室温封闭1 h，将一抗(NF-ΚB P56抗体、IΚB-α抗体、Histone H1抗体、tunlin抗体)分别用一抗稀释液稀释至1∶50 000，1∶1 000，1∶1 000， 1∶1 000，4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min，用封闭液将Anti-Rabbit 稀释至1∶5 000，室温下孵育PVDF膜1.5 h，TBST洗3次，每次10 min，进行显影，定影。将胶片扫描后用Image J凝胶蛋白分析软件对条带进行灰度分析，测定各组P56、IΚB-α蛋白表达量及相应内参Histone H1、tunlin蛋白表达量。

1.4.7 细胞免疫荧光染色各组细胞在对数生长期时进行相应处理后，用预温1×PBS洗3次，每次10 min(1 mL每孔)，40 g/L多聚甲醛每孔加入200 µL室温固定30 min，1× PBS洗3次，每次10 min，0.2% Triton X-100每孔加入 200 µL透化5 min，1×PBS洗3次，每次10 min。5% BSA(Albumin Bovine V)室温封闭30 min，加入Anti-NF-ΚB p56抗体(Anti-NF-ΚB p56抗体：1%BSA 1∶100)放在湿盒里，4 ℃过夜。1×PBS洗3次，每次10 min，加Alexa Fluor 488标记山羊抗兔体IgG(H+L)(Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L))(Alexa Fluor 488标记山羊抗兔体IgG(H+L): 1 %BSA 1∶100)避光孵育30 min，1× PBS洗3次，每次10 min。加入200 µL的0.015 g/L DAPI染液(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)室温避光孵育10 min，PBS洗2次后，每孔各加200 µL PBS。拍摄荧光下细胞状态照片。

1.5 主要观察指标肥大相关基因心房利钠肽、脑利钠肽的mRNA表达、H9c2心肌细胞存活率、细胞总蛋白浓度、NF-κB及P65蛋白表达。

1.6 统计学分析采用SPSS10.0统计软件分析，数据用 x(_)±s表示，以P < 0.05为差异有显著性意义，以P < 0.01为差异有非常显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

研究发现压力负荷和神经体液因子是引起心肌肥大的重要因素，血管紧张素Ⅱ是神经体液因素中重要的调节因子，长期的血管紧张素Ⅱ刺激可激活多种细胞信号转导途径，在胞内引起一系列的级联反应，最终导致心肌肥大的产生^[20-22]，因此有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大是预防和治疗这种疾病的一个重要方面。

中药黄芪为豆科植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根，味甘、性温，有补气升阳、固表止汗、利水消肿和生肌等功效，是临床上防治心血管疾病的重要药物^[23-24]。黄芪多糖是从黄芪中分离得到的一种大分子化合物，是黄芪的主要活性成分，具有增强心肌收缩力，改善心肌供血和心肌代谢的药理学作用^[25-26]。文章以血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞肥大作为观察对象，研究黄芪多糖在心肌肥大中的药理学作用。结果发现血管紧张素Ⅱ诱导H9c2心肌细胞产生心肌肥大，与模型组相比，黄芪多糖能抑制H9c2心肌细胞表面积，使细胞总蛋白含量及心肌细胞肥大相关基因mRNA的表达水平明显下降，心肌细胞存活率明显上升，说明黄芪多糖能有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。

核因子κB(nuclear factor κappa B，NF-κB)是细胞内非常重要的核转录因子，在心肌肥大的发生发展中起着重要作用^[27-28]。NF-κB由p65与p50或p52组成的同源或异源二聚体，静息状态下以失活状态停留在细胞质中，并与其抑制蛋白IκB结合成三聚体，外界刺激可以活化IκB激酶复合体(IκK)，使IκBα特异性磷酸化并降解，并刺激下P65进入细胞核，与靶基因结合，从而启动或抑制相应基因的转录^[29-31]。实验中发现，血管紧张素Ⅱ刺激P65在H9c2心肌细胞核中表达，黄芪多糖组的H9c2心肌细胞，其胞核中p65蛋白表达减少，说明黄芪多糖能抑制H9c2心肌细胞中血管紧张素Ⅱ刺激下p65的核转移，从而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞肥大。

前期实验证实黄芪多糖能有效抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大，还需进一步研究，观察黄芪多糖在动物模型中的作用，为其在治疗心肌肥大的临床应用提供新的实验数据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程