5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4629-4634.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.007

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化

王静¹，韩江红¹，李琼²

¹新乡医学院三全学院，河南省新乡市 453000；²新乡医学院，河南省新乡市 453000

修回日期:2017-05-02 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 李琼，博士，副教授，新乡医学院，河南省新乡市 453000
作者简介:王静，女，1982年生，河南省南阳市人，汉族，硕士，讲师，主要从事心肌组织再生研究。
基金资助:
河南科技发展攻关项目(2015HNJ0031)

5-Azacytidine combined with angiotensin II induces differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes

Wang Jing¹, Han Jiang-hong¹, Li Qiong²

¹Sanquan College of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, China; ²Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, Chin

Revised:2017-05-02 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Li Qiong, M.D., Associate professor, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, China
About author:Wang Jing, Master, Lecturer, Sanquan College of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, China
Supported by:
the Scientific Development Program of Henan Province, No. 2015HNJ0031

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管紧张素Ⅱ：是血管紧张素中最重要的组成部分。人体的血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞以及脑的一些部位、心脏和肾脏器官的细胞上存在有血管紧张素受体。血管紧张素Ⅱ与血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应。
心肌细胞：又称心肌纤维，有横纹，受自主神经支配，属于有横纹的不随意肌，具有兴奋收缩的能力。呈短圆柱形，有分支，其细胞核位于细胞中央。各心肌纤维分支的末端可相互连接构成肌纤维网。广义的心肌细胞包括组成窦房结、房内束、房室交界部、房室束(即希斯束)和浦肯野纤维等的特殊分化了的心肌细胞，以及一般的心房肌和心室肌工作细胞。

摘要
背景：采取有效措施修复坏死心肌成为临床治疗心肌梗死的新方向。
目的：探讨5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ对小鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的影响。
方法：取20只4周龄ICR小鼠，利用Ⅰ型胶原酶消化法获得脂肪间充质干细胞，观察细胞的形态学特点，运用MTT法检测细胞的増殖情况，运用免疫荧光技术检测细胞表面抗原CD90，CD105，CD73，CD45的表达。第4代脂肪间充质干细胞培养24 h后，更换为含15 μmol/L 5-氮杂胞苷和15 μmol/L 5-氮杂胞苷+0.1 μmol/L血管紧张素Ⅱ的培养基诱导24 h，然后更换为完全培养基，Western Blot检测细胞中cTnT蛋白表达。
结果与结论：①原代脂肪间充质干细胞胞核较小，呈梭形、星形，传代后细胞体积增大，形态趋于一致，排列规则；②第3代小鼠脂肪间充质干细胞的生长曲线呈现“S”形，第1-3天为潜伏期，第4天进入对数生长期，第5-7天细胞生长达到峰值，进入平稳期；③第4代脂肪间充质干细胞表面CD90、CD105及CD73呈阳性表达，CD45阴性表达；④5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组心肌细胞中cTnT蛋白表达量显著高于5-氮杂胞苷(P < 0.05)；⑤结果表明，5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ能够显著促进脂肪间充质干细胞向心肌细胞样细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3451-3862(王静)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 心肌细胞, 5-氮杂胞苷, 脂肪间充质干细胞, 血管紧张素Ⅱ, Ⅰ型胶原酶, Western Blot, 免疫荧光技术, cTnT, 心肌样细胞分化率

Abstract:

BACKGROUND: Taking effective measures for myocardial necrosis develops a trend in the clinical treatment of myocardial infarction.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of 5-azacytidine combined with angiotensin II in the differentiation of mouse adipose-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes.
METHODS: Twenty ICR mice aged 4 weeks old were used to isolate adipose-derived mesenchymal stem cells using type I collagenase digestion method. Cell morphology was observed, cell proliferation was detected using MTT, and immunofluorescence technique was used to detect the expression of CD90, CD105, CD73 and CD45. Passage 4 adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured for 24 hours, then induced by 15 μmol/L 5-azacytidine or
15 μmol/L 5-azacytidine plus 0.1 μmol/L angiotensin II for another 24 hours, and finally cultured in a complete medium. The expression of cTnT protein in myocardial cells was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Primary adipose-derived mesenchymal stem cells with small nuclei were spindle-shaped or starlike. After passage, the cells were increased in size, with uniform shape and regular arrangement. Passage 3 mouse adipose-derived mesenchymal stem cells showed an S-shaped growth curve: days 1-3 was incubation period, the cells showed logarithmic growth at day 4, the cell growth reached the peak at days 5-7, and then entered stationary phase. The passage 4 cells were positive for CD90, CD105 and CD73, but negative for CD45. The expression of cTnT was significantly higher after cell induction with 5-azacytidine combined with angiotensin II than 5-azacytidine alone. In conclusion, the combined use of 5-azacytidine and angiotensin II is beneficial for the cardiomyocyte-like differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Angiotensin II, Myocytes, Cardiac, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王静，韩江红，李琼. 5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4629-4634.

Wang Jing, Han Jiang-hong, Li Qiong. 5-Azacytidine combined with angiotensin II induces differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4629-4634.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 20只4周龄ICR小鼠全部进入结果分析，中途无脱落。

2.2 小鼠脂肪间充质干细胞形态 倒置显微镜下观察，刚刚分离获得的小鼠脂肪间充质干细胞悬浮在培养液中，呈球形，体积较小；培养3 d后多数细胞贴壁，呈梭形、星形，不同细胞之间相互连接；培养7 d后细胞增殖迅速，多为长梭形，放射状；传代培养后细胞形态和排列趋于均一，细胞间联系紧密，见图1。

2.3 小鼠脂肪间充质干细胞生长曲线 第3代小鼠脂肪间充质干细胞的生长曲线呈现“S”形，第1-3天为潜伏期，第4天进入对数生长期，第5-7天细胞生长达到峰值，进入平稳期，见图2。

2.4 小鼠脂肪间充质干细胞鉴定结果 采用免疫荧光技术对第4代脂肪间充质干细胞进行鉴定，结果显示：第4代脂肪间充质干细胞表面CD90、CD105及CD73分别表现为绿色、绿色及红色荧光，CD45无荧光表达，说明第4代脂肪间充质干细胞具备间充质干细胞表面标记，见图3。

2.5 诱导分化后心肌细胞形态 5-氮杂胞苷组诱导后细胞增殖速度下降，超过50%细胞出现脱壁、降解、死亡。光镜下观察细胞明显增大、体积不等、胞质粗糙，细胞的数量较同期5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组的细胞数量明显减少。5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组诱导后1周细胞开始脱壁凋亡，增殖速度降低，第10天细胞增殖速度开始趋向加快，第4周后，出现内皮细胞的形态特征，见图4。

2.6 两组心肌细胞中cTnT蛋白表达 诱导7 d时，5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组心肌细胞中cTnT蛋白表达量显著高于5-氮杂胞苷，见图5。

参考文献

[1] Ishihara K, Nakayama K, Akieda S, et al. Simultaneous regeneration of full-thickness cartilage and subchondral bone defects in vivo using a three-dimensional scaffold-free autologous construct derived from high-density bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 2014;9:98.

[2] Heywood HK, Nalesso G, Lee DA, et al. Culture expansion in low-glucose conditions preserves chondrocyte differentiation and enhances their subsequent capacity to form cartilage tissue in three-dimensional culture. Biores Open Access. 2014;3(1):9-18.

[3] Najar M, Raicevic G, Fayyad-Kazan H, et al. Impact of different mesenchymal stromal cell types on T-cell activation, proliferation and migration. Int Immunopharmacol. 2013; 15(4):693-702.

[4] 庞荣清,何洁,李福兵,等.一种简单的人脐带间充质干细胞分离培养方法[J].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2011,1(2):30-33.

[5] 陈运贤,欧瑞明,钟雪云,等.自体骨髓干细胞原位移植治疗急性心肌梗死的临床研究[J].中国病理生理杂志,2003,19(4):452-454.

[6] 牛丽丽,曹丰,郑敏,等.同种异体移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠心肌梗死[J].中华内科杂志, 2004,43(3):186-190.

[7] 王宝珠,马依彤,王春兰,等.大鼠自体脂肪干细胞移植治疗心肌梗死动物模型的建立[J].中华实验外科杂志,2010,27(9):1187.

[8] 石金鑫,刘剑锋,王海滨,等.棕色脂肪干细胞与白色脂肪干细胞移植对心肌梗死大鼠心功能的影响[J].中国医药导报,2013,10(15): 18-21.

[9] Melief SM, Zwaginga JJ, Fibbe WE, et al. Adipose tissue-derived multipotent stromal cells have a higher immunomodulatory capacity than their bone marrow-derived counterparts. Stem Cells Transl Med. 2013;2(6):455-463.

[10] Strioga M, Viswanathan S, Darinskas A, et al. Same or not the same? Comparison of adipose tissue-derived versus bone marrow-derived mesenchymal stem and stromal cells. Stem Cells Dev. 2012;21(14):2724-2752.

[11] Liu C, Fan Y, Zhou L, et al. Pretreatment of mesenchymal stem cells with angiotensin II enhances paracrine effects, angiogenesis, gap junction formation and therapeutic efficacy for myocardial infarction. Int J Cardiol. 2015;188:22-32.

[12] Qin Q, Wang J, Yan Y, et al. Angiotensin Ⅱ induces the differentiation of mouse epicardial progenitor cells into vascular smooth muscle-like cells. Biochem Biophys Res Commun. 2016;480(4):696-701.

[13] Hou J, Yan P, Guo T, et al. Cardiac stem cells transplantation enhances the expression of connexin 43 via the ANG II/AT1R/TGF-beta1 signaling pathway in a rat model of myocardial infarction. Exp Mol Pathol. 2015;99(3):693-701.

[14] Fan Y, Wang L, Liu C, et al. Local renin-angiotensin system regulates hypoxia-induced vascular endothelial growth factor synthesis in mesenchymal stem cells. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(3):2505-2514.

[15] Xue C, Zhang J, Lv Z, et al. Angiotensin II promotes differentiation of mouse c-kit-positive cardiac stem cells into pacemaker-like cells. Mol Med Rep. 2015;11(5):3249-3258.

[16] Castelo-Branco MT, Soares ID, Lopes DV, et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 2012;7(3):e33360.

[17] Nagyova M, Slovinska L, Blasko J, et al. A comparative study of PKH67, DiI, and BrdU labeling techniques for tracing rat mesenchymal stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2014; 50(7):656-663.

[18] 国强华,宋维鹏,王庆胜,等.组织块贴壁法培养人肠系膜动脉平滑肌细胞的研究[J].武警医学,2012,23(12):1033-1035.

[19] Park JR, Kim E, Yang J, et al. Isolation of human dermis derived mesenchymal stem cells using explants culture method: expansion and phenotypical characterization. Cell Tissue Bank. 2015;16(2):209-218.

[20] Mori Y, Ohshimo J, Shimazu T, et al. Improved explant method to isolate umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and their immunosuppressive properties. Tissue Eng Part C Methods. 2015;21(4):367-372.

[21] Gittel C, Brehm W, Burk J, et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Vet Res. 2013;9:221.

[22] Boyette LB, Creasey OA, Guzik L, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells display enhanced clonogenicity but impaired differentiation with hypoxic preconditioning. Stem Cells Transl Med. 2014;3(2):241-254.

[23] Brini AT, Amodeo G, Ferreira LM, et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Sci Rep. 2017;7(1):9904.

[24] Liew LJ, Ong HT, Dilley RJ.Isolation and Culture of Adipose-Derived Stromal Cells from Subcutaneous Fat. Methods Mol Biol. 2017;1627:193-203.

[25] Muñoz-Criado I, Meseguer-Ripolles J, Mellado-López M, et al. Human Suprapatellar Fat Pad-Derived Mesenchymal Stem Cells Induce Chondrogenesis and Cartilage Repair in a Model of Severe Osteoarthritis. Stem Cells Int. 2017;2017:4758930.

[26] Balducci L, Alessandri G.Isolation, et al. Expansion, and Immortalization of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells from Biopsies and Liposuction Specimens. Methods Mol Biol. 2016;1416:259-274.

[27] 刘红,俞小芳,滕杰,等.低氧预处理对小鼠骨髓间充质干细胞迁移能力的影响[J].中华医学杂志,2012,92(10):709-713.

[28] Lönne M, Lavrentieva A, Walter JG, et al. Analysis of oxygen-dependent cytokine expression in human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord. Cell Tissue Res. 2013;353(1):117-122.

[29] 刘林奇,鲁峰,高建华.血管内皮生长因子参与血管形成的机制研究进展[J].中华实验外科杂志,2012,29(4):770-772.

[30] Lee Y, Jung J, Cho KJ, et al. Increased SCF/c-kit by hypoxia promotes autophagy of human placental chorionic plate-derived mesenchymal stem cells via regulating the phosphorylation of mTOR. J Cell Biochem. 2013;114(1): 79-88.

[31] 刘林奇,高建华,袁艺,等.低氧预处理对人脂肪来源干细胞的活性及表面标志的影响[J].中国美容整形外科杂志,2013,24(3): 180-183.

[32] 刘毅,王有虎,哈小琴.转染HGF基因的MSCs对移植颗粒脂肪存活率的影响[J].中华医学美学美容杂志,2011,17(1):12-16.

[33] 戴晓俊,王飓,陶凯,等.影响自体游离脂肪移植成活率相关因素的研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2013,24(4):232-234.

[34] 王克勇,张福业,王永刚,等.人脐带间充质干细胞辅助的一种脂肪移植的实验研究[J].东南大学学报,2013,32(6):733-737.

引言

心肌梗死具有死亡率高、致残率高及治愈率低等特点，随着人口老龄化的日益加剧，导致心肌梗死发生率呈现上升及年轻化趋势。常规方法以药物治疗、介入治疗为主，虽然能改善冠脉循环提高心肌供氧，改善患者临床症状，但是对于心肌细胞修复效果较差。研究表明，心肌梗死后部分心肌细胞仍可以进行分裂增殖，但是每年的更新率仅为1%，不能弥补梗死区域损失的心肌细胞数量。因此，采取有效的措施修复坏死心肌成为临床治疗心肌梗死的新方向。干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，能在不同的微环境、化学物质、细胞因子等影响下，发挥“环境依赖性变化”特点，进而分化为体内多种细胞^[1-2]。研究表明，脂肪干细胞的数量占脂肪组织的2%，而脂肪组织中脂肪干细胞浓度是骨髓中骨髓间充质干细胞浓度的100-300倍，并且脂肪干细胞具有来源广、易分离、免疫原性低及具有多向分化潜能等优点^[3]。

干细胞移植已成为治疗心血管疾病的热点，将体外分离纯化、培养增殖的外源性细胞移植到梗死部位，取代瘢痕、纤维组织，从而恢复心肌功能^[4-8]。间充质干细胞在体外经多种诱导剂诱导均可成功转化为心肌样细胞，目前国内外报道中普遍采用的诱导剂为5-氮杂胞苷，但5-氮杂胞苷对细胞具有一定的毒性^[9]。血管紧张素Ⅱ是心肌细胞裂解液中的重要生物活性物质，构成心肌微环境，具有多种生物学效应，能刺激血管平滑肌细胞、纤维细胞增生。血管紧张素Ⅱ与血管内皮生长因子的分泌密切相关，并且血管内皮生长因子具有促血管生成的作用^[10-15]。

实验探讨5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ对小鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的影响，为治疗缺血性心脏病提供细胞学基础和理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 于2014年1月至2015年12月在新乡医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 取20只4周龄ICR小鼠，雌雄随机，体质量23-45 g，平均(32.9±3.0) g，由新乡医学院动物实验中心提供。实验过程中对动物饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》相关规则。实验经过新乡医学院动物委员会批准同意。

1.3.2 主要仪器和试剂 超净工作台(苏州净化集团安泰公司)；倒置相差显微镜(德国莱卡公司，型号TE2000-U)；高速离心机(德国Thermo公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Ficoll 淋巴细胞分离液(天津TBD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠脂肪间充质干细胞分离、培养及传代 采用ZUK方法将小鼠断颈处死，放入体积分数为75%乙醇中浸泡数秒消毒，然后仰放置于泡沫板上，用大头针固定四肢。①用无菌手术器械逐层分离小鼠皮肤，充分暴露腹股沟，取出脂肪组织放入培养皿中；②用无菌PBS洗涤脂肪组织三四次，去除脂肪组织上的纤维组织和小血管，将脂肪组织放入青霉素小瓶中浸泡2 h；③取出浸泡后的脂肪组织，加入2倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，用吸管吹打1-3 min，37 ℃下振荡20 min；④加入0.25%的胰酶，混合均匀后消化20 min；⑤加入含体积分数为1%胎牛血清的L-DMEM完全培养基终止消化，1 500 r/min离心5 min，去除上清液，加入完全培养基制备细胞悬液；⑥采用差速贴壁法纯化细胞，将细胞悬液移入培养瓶中，37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内培养60 min；⑦细胞融合90%，加入0.25%胰酶消化，传代培养^[16-17]。

1.4.2 小鼠脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化 取第4代脂肪间充质干细胞培养24 h后换液，分为5-氮杂胞苷组，5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组。①5-氮杂胞苷组：添加含有15 μmol/L的5-氮杂胞苷培养基进行诱导24 h，然后更换为完全培养基；②5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组：在5-氮杂胞苷组基础上添加0.1 μmol/L的血管紧张素Ⅱ诱导24 h，然后更换为完全培养基。每组铺6个6孔板，共12个孔板，在光镜下观察细胞形态学变化^[18]。

1.5 主要观察指标

1.5.1 小鼠脂肪间充质干细胞形态观察 倒置相差显微镜下观察小鼠脂肪间充质干细胞生长情况，拍照记录。

1.5.2 小鼠脂肪间充质干细胞生长曲线 采用MTT法绘制细胞生长曲线，在倒置显微镜下调整细胞浓度为1×10⁵ L^-¹，每孔加入100 μL，37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内培养，直至细胞贴壁。从第2天开始向96孔板中加入20 μL 0.5% MTT混合均匀，37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内培养4 h，各孔内加入100 μL二甲基亚砜，在摇床上低速振荡10 min，在酶标仪490 nm处读出吸光度值，绘制细胞生长曲线^[19-20]。

1.5.3 小鼠脂肪间充质干细胞鉴定 取第4代脂肪间充质干细胞，去除培养液，PBS洗涤3次，加入2.5 g/L胰蛋白酶，待80%细胞贴壁后加入L-DMEM培养液终止消化，800 r/min离心3 min，加入FITC标记的CD105、CD73、CD90及CD41，加入DAPI避光染核10 min，抗荧光淬灭剂封固，荧光显微镜下观察、拍照^[21]。

1.5.4 心肌细胞形态观察 取5-氮杂胞苷组与5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组细胞，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，拍照记录细胞形态。

1.5.5 心肌细胞中cTnT蛋白表达 诱导7 d，采用Western Blot检测心肌细胞中cTnT蛋白表达情况。取蛋白标准配制液1.2 mL，加入到一管蛋白标准品中，充分溶解，配置成质量浓度为25 g/L的蛋白标准溶液。取适量的蛋白标准溶液，采用生理盐水稀释，控制质量浓度为0.5 g/L，稀释后备用。依据样本数量，按50倍体积BCA试剂A加入1倍体积的BCA试剂B，配置BCA工作液，24 h稳定，加入96孔板中，加入标准品，稀释到20 μL，将1 μL样品加入96孔板中，向每孔中加入200 μL BCA工作液，使用微量紫外光光度计测量样品和标准品的蛋白浓度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

成体组织干细胞具备自我更新能力，能在一定条件下向多种细胞分化。脂肪间充质干细胞在适宜的微环境和细胞因子存在条件下能分化为骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等。但是，脂肪间充质干细胞作为种子细胞前需要进行多次培养和传代，才能获得足够量的细胞完成损伤器官的修复^[22-26]。目前，对于脂肪间充质干细胞分离、培养方法主要有4种：差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法、流式细胞仪分选法。前2种分离方法相对简单，易于操作，但是这2种方法分离时纯度不够，分离所需要的周期较长^[27-28]。免疫磁珠分选法、流式细胞仪分选法均可以在短时间内获得较高纯度的脂肪间充质干细胞，通过抗原抗体反应，利用多种抗体与细胞表面抗原相互结合，从而能分选出所需的细胞^[29]。实验采用差速贴壁法制备小鼠脂肪干细胞，倒置显微镜下显示：刚刚分离获得的小鼠脂肪间充质干细胞悬浮在培养液中，呈球形，体积较小；培养3 d后多数细胞贴壁，形态呈梭形、星形，不同细胞之间相互连接；培养7 d后细胞增殖迅速，多为长梭形，放射状；传代培养后细胞形态和排列趋于均一，细胞间联系紧密。由此看出，采用差速贴壁法能获得脂肪干细胞，并且不同培养阶段细胞形态、数量等均会发生明显的变化。第3代小鼠脂肪间充质干细胞的生长曲线呈现“S”形，第1-3天为潜伏期，第4天进入对数生长期，第5-7天细胞生长达到峰值，进入平稳期。此外，采用免疫荧光技术检测结果显示：第4代脂肪间充质干细胞表面CD90、CD105及CD73分别表现为绿色、绿色及红色荧光，而细胞表面不表达CD45，提示第4代脂肪间充质干细胞具有间充质干细胞表面标志，从而能为下阶段实验的顺利进行奠定基础^[30]。

冠心病是临床上常见的疾病，该疾病具有发病率高、致残率高及致死率高等特点，且随着人口老龄化的日益加剧，导致冠心病发生率呈现上升趋势^[31-32]。目前，冠心病治疗方法以药物治疗联合手术治疗为主，这些方法能改善心肌供氧和营养，挽救濒临死亡的心肌。但是，对于大面积心肌死亡患者，传统方法并不能取得预期效果。近年来，心肌细胞移植在冠心病患者中得到应用，且效果理想^[33]。通过移植干细胞能改善预后，从而为冠心病的治疗提供依据和参考，但是人体中心肌细胞数量相对较少，难以满足心肌修复需要。实验采用5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞样细胞分化，结果显示：5-氮杂胞苷组细胞诱导后增殖速度下降，超过50%细胞出现脱壁、降解、死亡。光镜下观察细胞明显增大、体积不等、胞质粗糙；5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组细胞诱导后1周开始脱壁凋亡，增殖速度降低，第10天细胞增殖速度开始趋于加快。5-氮杂胞苷是传统的诱导剂，该诱导剂能诱导脂肪干细胞向心肌样细胞分化，从而促进细胞有丝分裂时的甲基化，能调节细胞分化的环境，从而能有效提高细胞分化率^[34]。血管紧张素Ⅱ是一种从心肌细胞提取物中提取的一种生物活性物质，该物质作为血管生长活性因子在细胞的生长发育、分化、凋亡中发挥了重要作用。血管紧张素Ⅱ能直接作用于血管壁上，促进内皮细胞、平滑肌细胞增殖，从而能促进血管炎症反应。实验中，脂肪干细胞向心肌细胞分化时5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导效果理想，能发挥不同诱导剂优势，达到优势互补，从而能促进脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化。5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ组心肌细胞中cTnT蛋白表达量显著高于5-氮杂胞苷组。由此看出，采用5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞样细胞分化，提高细胞中cTnT蛋白表达量，能为冠心病的治疗提供充足的种子细胞。

综上所述，用Ⅰ型胶原酶消化分离小鼠脂肪间充质干细胞，并完成脂肪间充质干细胞的培养和鉴定，采用5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ能够诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞样细胞分化，有望作为体外心肌组织工程理想的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

5-氮杂胞苷联合血管紧张素Ⅱ诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化

5-Azacytidine combined with angiotensin II induces differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[4]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[5]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[6]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[7]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.