多烯磷脂酰胆碱干预大鼠非酒精性脂肪肝细胞模型基因芯片组学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0619

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (36): 5833-5839.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0619

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多烯磷脂酰胆碱干预大鼠非酒精性脂肪肝细胞模型基因芯片组学分析

刘锐1，何嘉2，刘秀芳2，冯晓秋1，古展鑫2，康善平1

(1广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011；2广西中医药大学研究生学院，广西壮族自治区南宁市 530001)

收稿日期:2018-09-13 出版日期:2018-12-28 发布日期:2018-12-28
通讯作者: 康善平，硕士，副主任医师，广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011
作者简介:刘锐，男，1980年生，江西省瑞金市人，2010年湖南中医药大学毕业，博士，副主任医师，主要从事生物信息学的应用防治老年病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区项目(81460717)；广西自然科学基金面上项目(2014GXNSFAA118249)

Gene chipset analysis in rats with non-alcoholic fatty liver disease intervened by polyene phosphatidylcholine

Liu Rui1, He Jia2, Liu Xiufang2, Feng Xiaoqiu1, Gu Zhanxin2, Kang Shanping1

(1Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China)

Received:2018-09-13 Online:2018-12-28 Published:2018-12-28
Contact: Kang Shanping, Master, Associate chief physician, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Liu Rui, MD, Associate chief physician, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460717; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region (General Program), No. 2014GXNSFAA118249

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
基因芯片分析：为了通过生物信息学方法从这些芯片数据中发现可能对生物效应起作用的关键基因，从中寻找特定模式并对每个基因给予注释，从而挖掘出隐含的生物学过程并抽提出生物学的或功能层面上的意义。
基因本体论：基因本体联合会所建立的数据库，皆在建立一套适用于各种物种的，对基因和蛋白质功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。

摘要
背景：随着信息技术的发展及与生物医学领域的互融，产生了大量基因组学、转录组学等相关的大数据，并通过生物信息学分析与计算机科学相结合的方法对这些数据进行分析，可研究多个基因之间的相互联系。多烯磷脂酰胆碱保护肝脏、改善脂肪代谢、干预非酒精性脂肪肝细胞的相关靶点及其作用机制尚未完全明确。
目的：通过筛选mRNA(ClariomTM S Assay)芯片及miRNA芯片的显著差异性基因，预测microRNA相关靶基因，研究多烯磷脂酰胆碱改善肝细胞脂肪代谢的调控机制。
方法：①提取多烯磷脂酰胆碱灌胃SD大鼠的含药血清；②培养BRL大鼠肝细胞，加含体积分数50%胎牛血清的培养基建立非酒精性脂肪肝细胞模型，24 h后模型组加入正常血清、多烯磷脂酰胆碱组加入多烯磷脂酰胆碱含药血清进行干预；③提取细胞总RNAs，采用Clariom S表达谱芯片及miRNA芯片检测细胞mRNA及miRNA的表达水平。运用生物信息学方法预测miRNA的靶基因，对脂肪代谢相关基因进行富集分析和通路分析。
结果与结论：经筛选和预测得到5 629个预测靶基因参与13种生物学过程，14种细胞成分，有11种分子作用，代谢途径、嘌呤代谢、类固醇生物合成路径被富集；rno-miR-21-5p、rno-miR-370-3p、rno-miR-542-3p为调控网络中心；IPA数据库共检出56个与实验有关的脂肪代谢基因。提示：多烯磷脂酰胆碱治疗非酒精性脂肪肝的机制可能与rno-miR-21-5p、rno-miR-370-3p、rno-miR-542-3p，代谢途径、嘌呤代谢、类固醇生物合成路径相关性较高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3666-1076(刘锐)

关键词: 多烯磷脂酰胆碱, 非酒精性脂肪肝, miRNA, 靶基因, 脂肪代谢, 生物信息学分析, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: With the development of information technology and integration with the biomedical field, a large number of big data related to genomics and transcriptomics, have been generated, and these data are analyzed through a combination of bioinformatics and computer science. Further the interrelationships between multiple genes are explored. The targets of polyene phosphatidylcholine protecting liver, improving lipid metabolism and intervening nonalcoholic fatty liver and underlying mechanisms remain unclear.
OBJECTIVE: To predict and investigate the regulatory mechanism of polyene phosphatidylcholine improving fat metabolism of hepatocyte based on screening the difference between mRNA (Clariom™ S Assay) and miRNA expression.
METHODS: Serum of Sprague-Dawley rats receiving intragastric administration of polyene phosphatidylcholine was extracted. BRL rat hepatocytes were cultured in the medium containing 50% of fetal bovine serum to establish the model of nonalcoholic fatty hepatocytes. Then polyene phosphatidylcholine serum was used as experimental group and negative control serum was used as control group, respectively. Total RNAs were extracted and differently expressed miRNAs were detected by Clariom S expression profile chip for expression level of mRNA and miRNA. Bioinformatics method was used to predict target genes of differential miRNAs regulation. Enrichment of functions and signaling pathways of the target genes was conducted by fat metabolism related genes.
RESULTS AND CONCLUSION: In screening and predicting, 5 629 target genes were involved in 13 kinds of biological processes, 14 kinds of cellular components, and 11 kinds of molecular functions. Metabolic pathways, purine metabolism and steroid biosynthesis pathway were enriched. rno-miR-21-5p, rno-miR-370-3p, rno-miR-542-3p were the center of the molecular network. According to IPA database, 56 genes with fat metabolism effective interaction were screened out. These results show rno-miR-21-5p, rno-miR-370-3p, rno-miR-542-3p and Metabolic pathways, purine metabolism and steroid biosynthesis pathway may play a role in the differentiation process of non-alcoholic fatty liver induced by phosphatidylcholine.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Fatty Liver, Computational Biology, MicroRNAs, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘锐1，何嘉2，刘秀芳2，冯晓秋1，古展鑫2，康善平1 . 多烯磷脂酰胆碱干预大鼠非酒精性脂肪肝细胞模型基因芯片组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(36): 5833-5839.

Liu Rui1, He Jia2, Liu Xiufang2, Feng Xiaoqiu1, Gu Zhanxin2, Kang Shanping1. Gene chipset analysis in rats with non-alcoholic fatty liver disease intervened by polyene phosphatidylcholine[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(36): 5833-5839.

图/表（结果） 2

2.1 差异表达基因的筛选结果 mRNA芯片共有上调基因893个，下调基因891个。

2.2 microRNA差异基因的筛选、靶基因预测及Cytoscape的构建经筛选得出44条miRNAs差异表达(按|Fold Change|> 1.5，选取上下调各排前10个)，其中有26个属上调，上调较明显的为：rno-miR-181a-1-3p 。18个属下调，下调交明显的为：rno-miR-370-3p，见表1。

选取3个数据库预测的所有靶基因并排除重复基因后共得到5 629个预测靶基因，选取所含基因库≥2的靶基因，采用Cytoscape构建调控网络图，在select中设定 Degree≥2，并根据 Degree的数量制定不同的颜色区分，由多到少依次为rno-miR-21-5p、rno-miR-370-3p、rno-miR-542-3p，均下调，显著突出基因为Pnpla3，见图2。

2.3 脂肪代谢有关基因的筛选及生物信息学功能分析 IPA数据库共检出178个与脂肪代谢有关基因，与此次实验差异基因有交集的共56个，这些基因采用 DAVID数据库进行GO富集分析，见图3，主要参与13种生物学过程(biological process，BP)，包括胆固醇生物合成的过程、氧化还原过程、类异戊二烯生物合成的过程、MAP激酶活性的负向调节等；细胞组分(cellular component，CC)分析显示，共含14种组分类型，分别为细胞外的外来体、细胞质、核浆、线粒体、粘着斑等；显示有11种分子功能(molecular function，MF)，主要是带多聚腺苷酸的核糖核酸结合、核苷酸结合、相似蛋白结合、蛋白异源二聚体活性、氧化还原酶活性等。通过 KEGG分析发现，有27种信号通路参与，其中代谢途径、嘌呤代谢、类固醇生物合成差异最显著(P < 0.01)，见表2，图4-6。

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引言

材料方法

1.1 设计基因水平细胞实验。

1.2 时间及地点实验于2018年7月1日在广西中医药大学科学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性SD大鼠20只，SPF级，体质量180-200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(湘)2016-0002，饲养于广西中医药大学动物实验中心。

1.3.2 实验药物及细胞多烯磷脂酰胆碱：228 mg/粒，北京赛诺菲公司生产(批号7BJD137)，使用前用蒸馏水超声乳化，配制成每毫升含多烯磷脂酰胆碱132.4 mg。BRL大鼠肝细胞(中乔新舟公司，货号：ZQ0078)。

1.3.3 实验试剂 DMEM高糖(货号：319-006-CL)、D-PBS磷酸盐缓冲液(货号：311-425-CL)、青霉素-链霉素液体(货号：450-201-EL)、胎牛血清FBS 特级(货号：085-110)、0.25%胰酶-0.02%EDTA(货号：325-043-EL)均由北京维森特公司提供，油红O染色液(北京索莱宝公司，货号：G1262)，无水乙醇(货号：64-17-5)、异丙醇(货号：67-63-0)、氯仿(货号：ybc-500) 由天津市大茂化学试剂厂提供，Murine Rnase inhibitor(货号：R301-01)、RNA isolater(货号：R401-01)购自诺唯赞公司，DEPC水(RNase-free水)购自美国Biosharp公司(货号：BL510 A)，Agilent RNA6000 Nano Kit(美国Agilent公司)，GeneChip WT PLUS Ki试剂盒、 GeneChip Hybridization Wash and Stain Kit试剂盒及FlashTag^TM Biotin HSR Labeling Kit试剂盒均由Affymetrix公司提供。

1.3.4 实验仪器 HR1200-ⅡB2生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)，MCO-18AIC二氧化碳培养箱(三洋电机株式会社，日本)，ST16R/ST16离心机(Thermo公司，美国)，CKX41倒置显微镜(OLYMPUS公司，日本)，Thremo Nanodrop 2000(Thermo公司，美国)，GeneChip Hybridization Oven 645、GeneChip Fluidics Station 450及GeneChip Scanner 3000(Affymetrix公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及含药血清制备

分组干预方法：20只SD大鼠随机分为正常组、观察组，每组10只，均采用普通饲料喂养。正常组予蒸馏水灌胃10 mL/(kg·d)，观察组予多烯磷脂酰胆碱 1.2 mL/(kg·d)灌胃，相当于成人等效剂量。第1天灌胃前12 h禁食禁水，连续3 d给药，第3天灌胃结束后禁食，次日晨再灌胃1次。

含药血清制备：末次灌胃后1 h所有大鼠按3 mL/kg剂量予10%水合氯醛腹腔麻醉。无菌条件下暴露腹腔，缓慢剥离出下腔动脉，采用7号采血针及不抗凝采血管取全血，标记后室温下静置3 h。离心机4 ℃预冷，将采血管放入离心机内3 000 r/min离心15 min，放入生物安全柜中使用 1 mL注射器收集上清液注入相应组别的50 mL离心管内，混匀后分装至15 mL离心管内，水浴锅中56 ℃灭活(提前预热)，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.4.2 BRL大鼠肝细胞培养将BRL大鼠肝细胞弃旧培养液，加入3 mL PBS洗涤2次，加入1 mL胰酶消化细胞，置于显微镜下观察，待细胞回缩变圆、脱落后加2 mL含体积分数10%胎牛血清的新培养液(90%DMEM+体积分数10%胎牛血清+1%双抗)终止消化使其变成单细胞悬液。将细胞收集于离心管中离心1 000 r/min，5 min，弃上清，加入新培养基吹打混匀，按1︰2比例进行传代。每隔1 d换1次液，3 d可传代1次(稳定后按1︰3或1︰4传代)及冻存。传至第4，5代细胞状态稳定进行实验。

1.4.3 建立大鼠非酒精性脂肪肝细胞模型及实验分组将25 cm²细胞培养瓶培养好的BRL细胞按取2×10⁵细胞接种于6孔板内，另取1×10⁶细胞数重新培养。分成模型组及多烯磷脂酰胆碱组。两组先用2 mL含体积分数10%胎牛血清完全培养基培养24 h，弃液后加含体积分数50%胎牛血清的培养基建立非酒精性脂肪肝细胞模型，24 h后模型组加入正常血清、多烯磷脂酰胆碱组加入多烯磷脂酰胆碱含药血清进行干预。

造模后予油红O染色并观察细胞质变化，参照范建高等方法^[10-12]，可见细胞核呈蓝色，胞质散在橘红色分布，镜像比较造模前后细胞内的脂滴变化，每单位面积见1/3以上的肝细胞脂肪变性和脂肪储积，无其他明显组织学改变。显示造模成功。细胞正常形态及造模前后对比，见图1。

1.4.4 总RNA提取与芯片分析用Trizol法提取细胞总RNA样品，通过agilent2100分析后，采用GeneChip WT PLUS Kit制备cDNA。cDNA进行纯化，然后将其片段化后与芯片探针杂交。杂交完成后，对芯片进行洗染；采用FlashTag^TM Biotin HSR Labeling Kit试剂盒先对样品进行Poly(A)尾和生物素标记，之后进行杂交。结束后，用Gene Chip Hybridization Wash and Stain Kit试剂盒对芯片进行洗染，最终扫描获取图片和原始数据。

1.4.5 mRNA差异基因的筛选所得的标准化数据进行组间比较，按|Fold Change|> 1.5且P < 0.05的条件挑选出差异基因及表达上调、下调的基因。

1.4.6 miRNA差异基因的筛选、靶基因预测及Cytoscape网络图绘制按1.4.5步骤得出差异基因及表达上下调的基因。根据筛选出差异倍数排名前10的microRNA，在Targetscan、microRNA.ORG和miRDB三个数据库中进行靶基因预测，利用Cytoscape3.6.1构建miRNA-靶基因网络关系图。

1.4.7 脂肪代谢有关基因的筛选及生物信息学功能分析汇总mRNA的差异基因及miRNA芯片中差异倍数排名前10的miRNA预测的靶基因并取交集，再与IPA数据库检出的与脂肪代谢相关基因取交集，得出该实验差异基因中与脂肪代谢有关的基因，最后采用在线分析软件DAVID 6. 8进行基因富集GO分析及KEGG通路分析。

1.5 主要观察指标模型组及多烯磷脂酰胆碱组细胞mRNA及miRNA的差异表达；预测miRNA的靶基因；脂肪代谢相关基因的富集分析和通路分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

多烯磷脂酰胆碱能从多个方面保护肝细胞免受损害，有效减少脂质过氧化与氧应激、抑制肝细胞凋亡和抑制肝星状细胞激活等，并且可有效降低肝组织炎性反应程度，改善脂肪代谢^[13-15]。在作者前期实验发现，经多烯磷脂酰胆碱干预下，通过上调对肝脏组织 ABCA1 蛋白表达，以及下调SREBP-1c蛋白表达而实现^[8]。近年来，随着信息技术的发展及与生物医学领域的互融，产生了大量基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学相关的大数据，并通过生物信息学分析与计算机科学相结合的方法对这些数据进行分析，可研究多个基因之间的相互联系^[16-18]。该实验通过检测基因芯片差异表达，筛选多烯磷脂酰胆碱干预大鼠非酒精性脂肪肝细胞的相关靶点，进一步探究和预测其发挥作用的分子机制。

实验结果表明，差异表达的44条miRNAs中，上调明显的是：rno-miR-181a-1-3p， miR-181a是miR-181a家族重要一员，在肝脏生理和病理过程中具有重要作用。Brockhausen等^[19]发现miR-181a介导的转化生长因子β表达上调参与了非酒精性脂肪肝或肝癌的发生。而下调明显的为：rno-miR-370-3p。有研究表明肝脏中最丰富的miRNA是miR-370-3p，在维持肝体内平衡中起关键作用^[20-24]。Zheng等^[23]及Li等^[25]认为miR-370-3p通过Nrf2介导的氧化应激反应和激活p53信号通路为最显着改变的miRNA。

IPA数据库共检出与此次实验差异基因有交集的56mRNAs富集分析结果表明，其发挥作用的生物学过程主要包括胆固醇生物合成的过程、氧化还原过程、类异戊二烯生物合成的过程、MAP激酶活性的负向调节等；分子功能也指向了miRNA基本功能，包括带多聚腺苷酸的核糖核酸结合、核苷酸结合等。提示在多烯磷脂酰胆碱作用下转录调控的生物反应被进一步激活。

KEGG通路分析显示代谢途径、嘌呤代谢、类固醇生物合成被显著富集，通过图4示意图能发现在代谢途径中主要以多糖生物合成和代谢起作用。Wen等^[24]研究表明在黏多糖生物合成和鞘糖脂生物合成相关多糖生物合成中，氮代谢和初级胆汁酸合成相关代谢信号通路中，可调节脂质代谢紊乱，改善非酒精性脂肪肝的作用。在嘌呤代谢中，Benoit等^[26]实验表明由于细胞内氧化磷酸化作用受损引起代谢综合征，并且增加长链脂酰辅酶A合成，致循环腺苷升高，从而引起钠水、尿酸盐潴留，产生嘌呤代谢紊乱甚至形成高尿酸血症。并且血饱和脂肪酸水平明显增高，导致胰岛素抵抗的加重^[27]。在类固醇生物合成途径中，在前期对脂肪代谢的遗传机制进行了一系列研究^[28]，并发现了许多相关的基因，如肝脏脂质代谢的关键调控者中的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)，激活后不仅促进肝脏脂肪酸和三酰甘油的合成，而且还抑制三酰甘油的转运。在下游靶基因中，FAS mRNA、蛋白的表达量与SREBP-1c的改变是同一水平的。高燕翔等^[29]实验研究发现白藜芦醇抑制SREBP-1c的表达与活性，下调FAS等脂肪合成基因的表达，减少肝脏脂肪合成，从而改善肝脏的脂肪蓄积和脂肪变性。与作者前期研究中降低肝脏SREBP-1c蛋白表达，减少三酰甘油合成的结论基本一致^[8]。

在miRNA-靶基因差异调控网络分析中rno-miR-21-5p、rno-miR-542-3p、rno-miR-370-3p为复杂调控关系的中心，均下调表达。在miR-21的报道中，Xu等^[30]发现丝裂原活化蛋白激酶-激酶3(mitogen-activated protein kinase-kinase 3，MAP2K3)是miR-21的靶点，通过抑制其表达，促进肝细胞的增殖。Tomimaru等^[31]和Gougelet等^[32]认为循环miR-21可以作为慢性肝炎或者肝癌的标记物。miR-21-5p在肝细胞癌组织中高表达已经被证实，提示其为肿瘤组织来源。影响肿瘤的迁移和浸润能力，均在肿瘤的发生、发展过程中发挥作用。Zhang等^[33]的实验研究，脂质代谢紊乱的内皮衰老产生抑制作用是通过miR-21-5p的显著下调的变化机制；此外rno-miR- 542-3p在芯片检测中下调更为明显，可将rno-miR-542-3p视为此次研究的权重中心，值得注意的是被rno-miR- 370-3p与rno-miR-542-3p双重调控的Pnpla3，为3个数据库共同预测的靶点。马铃薯糖蛋白样磷脂酶蛋白3(Pnpla3)是与NAFLD肝细胞功能损伤及脂代谢密切相关的一种特定转录因子(又称脂肪滋养蛋白)，位于22号染色体长臂1区3带3亚带1次亚带^[34-35]，是一种非分泌型脂肪因子，由3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞，其非分泌蛋白所编码的蛋白是由481个氨基酸组成的，其N端具有高度的保守序列Gly-X-Ser-X-Gly，有非特异性酰基水解酶活性，可促进三酰甘油水解^[36-37]，在肝脏组织中水平最高。在部分体外实验中，Pnpla3具有三酰甘油水解酶和酰基甘油转酰基酶活性^[38-40]。此次实验预测发现Pcsk9转录基因也能被rno-miR-542-3p调控，其作为属于前蛋白转化酶家族中的一员,参与脂质代谢过程。因此，显著下调的rno-miR- 542-3p可能是多烯磷脂酰胆碱干预大鼠非酒精性脂肪肝细胞模型相关性较高的靶点。

综上所述，该研究利用高通量表达谱筛选了多烯磷脂酰胆碱干预大鼠非酒精性脂肪肝细胞模型差异表达miRNA，通过生物信息学手段预测并揭示多烯磷脂酰胆碱干预NAFLD的网络靶点可能为rno-miR-21-5p、rno-miR- 370-3p、rno-miR-542-3p等44条差异表达的miRNA及其相关家族，代谢途径、嘌呤代谢、类固醇生物合成信号通路等富集较显著的通路可能是多烯磷脂酰胆碱作用的关键。然而，miRNAs调控的靶点众多，同一miRNA可调控不同靶点，而同一靶点又可接受不同miRNA调控，且非酒精性脂肪肝脂肪代谢的机制复杂，因此多烯磷脂酰胆碱对肝细胞脂肪代谢的调控作用还需进一步验证和探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

多烯磷脂酰胆碱干预大鼠非酒精性脂肪肝细胞模型基因芯片组学分析

Gene chipset analysis in rats with non-alcoholic fatty liver disease intervened by polyene phosphatidylcholine

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