2.1  小鼠BMSCs中CD29、CD44及SCA-1的表达  小鼠BMSCs高表达CD29、CD44、SCA-1，表达率分别为99.71%、97.28%和99.4%，低表达CD11b，表达率仅为0.1%，见图1。

2.2  慢病毒转染48 h后小鼠BMSCs中GATA-4的表达  慢病毒转染小鼠BMSCs 48 h，过表达GATA-4组GATA-4基因表达丰度为阴性对照组的97.27倍，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3  采用免疫荧光技术定性评估BMSCs表达α-actin、Cx43、Desmin、cTnT情况  BMSCs^{miR-673-5p-mimic}-exosome与小鼠BMSCs共培养24 h，可见细胞核被DAPI染为蓝色，cTnT、α-actin、Cx43、Desmin绿色荧光强度较强；BMSCs^GATA-4-exosome与小鼠BMSCs共培养24 h，可见绿色荧光强度较也较强；BMSCs^{GATA-4-空载体}-exosome与小鼠BMSCs共培养24 h，可见绿色荧光强度明显减弱；BMSCs-exosome与小鼠BMSCs共培养24 h，可见绿色荧光强度明显减弱；BMSCs单独培养24 h，未见表达出绿色荧光；BMSCs^{miR-673-5p-inhibitor}-exosome与小鼠BMSCs共培养24 h，可见表达出极少绿色荧光，见图3。

2.4  RT-PCR检测BMSCs中心肌特异性抗原cTnT、α-actin、Cx43、Desmin及TSC-1、ERK1/2、Mef2c蛋白表达

2.4.1  BMSCs内心肌特异性抗原cTnT、α-actin、Cx43、Desmin表达  BMSCs^{miR-673-5p-mimic}-exosome与BMSCs共培养组可以表达出更多的心肌特异性抗原，见表2。

2.4.2  BMSCs内TSC-1、ERK1/2、Mef2c表达水平BMSCs^{miR-673-5p-mimic}-exosome+BMSCs组内TSC-1的表达明显下降，与其他各组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但ERK1/2、Mef2c表达水平则无明显规律性，见图4及表3。

冠心病引起的心肌梗死已成为目前世界范围内的头号 “杀手”，虽然对冠心病的治疗取得了一定的进展，但其仍然是世界十大死亡原因之一^[1]。目前国内外对冠心病的治疗主要分为外科治疗、内科治疗及细胞治疗。外科治疗对于高龄患者风险性极大，死亡率高。内科治疗主要为抗血小板药物治疗，但对于严重冠心病患者效果欠佳。细胞治疗中应用最为成熟的是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，虽然已有大量文献证实BMSCs可以改善心肌梗死后心功能，但亦有更多的学者提出干细胞临床应用尚不成熟，主要表现为：①BMSCs提高心肌梗死后心功能的机制尚不明确；②BMSCs注入人体后不良反应不详，是否可能形成肿瘤等。以上的问题已经限制BMSCs的临床应用。GATA-4是调控心脏基因表达的重要转录因子，参与了心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程。外泌体(exosome)是细胞分泌的囊泡，其可以扮演细胞与细胞之间的信号传导信使作用，远距离运输并将所携带物质释放入受体细胞。前期研究表明过表达GATA-4的BMSCs分泌的外泌体(BMSCs^GATA-4- exosome)可以促进BMSCs向心肌样细胞分化并改善心肌梗死后心功能^[2]，并发现在BMSCs^GATA-4-exosome中miRNA-673-5p明显高表达^[3]，其可能是修复心肌损伤的关键分子。基于此，该实验在BMSCs体系内过表达miRNA-673-5p并提取分泌的外泌体与BMSCs共培养，利用免疫荧光共聚焦技术定性检测其心肌细胞特异性分子α-actin、Desmin、cTnT、Cx43的表达，RT-PCR定量检测BMSCs上述心肌细胞特异性分子的表达。根据基因数据库推测miRNA-673-5p对应靶基因，采用Western blot检测靶基因转录蛋白的表达，对其促细胞分化分子机制调控网络进行研究。实验试图对BMSCs^GATA-4- exosome促BMSCs向心肌样细胞分化的分子调控机制解析，为临床转化应用提供科学依据，具有社会与经济效益。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  完全随机实验设计。

1.2  时间及地点  实验于2017年1月至2018年12月在云南省第一人民医院基础研究所实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验试剂  DMEM/F12基础培养基(美国Gibco公司)；外泌体提取试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)；Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit(广州市锐博生物科技有限公司)；Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Primer (广州市锐博生物科技有限公司)；miRNA-673-5P mimic试剂盒、miRNA-673-5P inhibitor试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)；α-actin引物、Connex-43引物、Desmin引物、cTnT引物(美国Invitrogen公司)；TSC-1抗体(Abcam公司)；ERK1/2抗体(CST公司)；Mef2c抗体(Abcam公司)；α-actin抗体(Abcam公司)；Cx43抗体(Proteintech公司)；Desmin抗体(Abcam公司)；cTnT抗体(Abcam公司)。

1.3.2  实验动物  健康4周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠20只，由成都达硕实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(川)2015-030。所有动物的喂养、观察均按照GLP (非临床研究管理规范)规定执行。

1.4  实验方法

1.4.1  小鼠BMSCs的分离、培养及鉴定  全骨髓培养小鼠BMSCs，胰蛋白酶消化传至第3代时采用CD11b磁珠负选，去除造血干祖细胞，继续传至第7代。取增殖至第7代BMSCs，待细胞汇合达80%-90%时，制备单细胞悬液，用流式细胞仪检测CD29、CD11b、CD44、SCA-1 ( PE-CD29单抗5 μL作1∶20稀释至100 μL、PE-CD11b单抗5 μL作1∶40稀释至200 μL、PE/Cy5-CD44 5 μL作  1∶20稀释至100 μL、FITC anti-mouse SCA-1 5 μL作  1∶20稀释至100 μL)，具体见参考文献[3]。

1.4.2  慢病毒载体及基因开启技术构建过表达GATA-4的BMSCs  将已构建成功的GATA-4基因插入慢病毒包装质粒GV308中，构建GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒。将构建成功的GV308-GATA-4重组慢病毒包装质粒转染入小鼠BMSCs并加入基因开启剂强力霉素，具体见参考文献[3]。

1.4.3  BMSCs^{miR-673-5p-mimic}和BMSCs^{miR-673-5p-inhibitor}构建  将目的细胞在不含外泌体血清的培养基中培养至24 h，换掉培养液，加入不含外泌体血清的新培养液，同时在细胞中分别加入miRNA-673-5p mimics，miRNA-673-5p inhibitor，继续培养24 h(在培养期间持续加入强力霉素)。

1.4.4  外泌体的提取  按照广州市锐博生物科技有限公司外泌体提取试剂盒说明书提取外泌体。

1.4.5  细胞的分组及处理  实验分为6组：BMSCs分泌exosome(5 mg/L)与BMSCs(×10⁴个)共培养，BMSCs^{GATA-4-空载体}-exosome(5 mg/L)与BMSCs(×10⁴个)共培养，BMSCs^GATA-4-exosome(5 mg/L)与BMSCs(×10⁴个)共培养，BMSCs^{miR-673-5p-mimic}-exosome(5 mg/L)与BMSCs共培养(×10⁴个)，BMSCs^{miR-673-5p-inhibitor}-exosome(5 mg/L)与BMSCs共培养(×10⁴个)及单独培养的BMSCs(×10⁴个)。上述各组BMSCs接种至24孔爬片上，并与各外泌体共培养24 h。

1.4.6  免疫荧光技术定性评估各组共培养BMSCs表达心肌细胞特异性分子α-actin、Cx43、Desmin、cTnT的情况  将共培养及单独培养完成的细胞，加合适浓度的第一抗体(α-actinin 2.5 mg/L；desmin 0.6 mg/L；cTnT 6.6 mg/L；Cx43 1.6 mg/L)，再加入合适浓度的荧光标记二抗     (10 mg/L，稀释比例1∶1 000)，采用免疫荧光技术在共聚焦显微镜下观察细胞cTnT、α-actin、Connex-43、Desmin表达。

1.4.7  RT-PCR方法检测各组共培养BMSCs内α-actin、Cx43、Desmin、cTnT的表达  取共培养及单独培养完成的细胞，提取总RNA，按照Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit 和 Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Primer试剂盒说明合成cDNA第一条链，随后完成目的基因扩增(95 ℃ 10 min；95 ℃ 2 s；60 ℃ 20 s；70 ℃ 10 s)，收集信息，做Ct值分析。

引物设计与合成：在PubMed上查询对应物种的目的基因mRNA序列，以CDS序列设计引物。应用beacon designer 7.90设计Q-PCR引物，引物序列见表1。

1.4.8  根据基因库推测miRNA-673-5p的靶基因  采用miRWalk、microt4、miRanda、miRbridge、miRDB、miRMap、miRNAMap、Pictar2、PITA、RNA22、RNAhybrid、Targetscan数据库对miRNA-673-5p的靶基因进行预测(筛选条件：靶基因总和>10同时靶基因与miRNA的匹和度>8)，可见miRNA-673-5P对应的靶基因为TSC-1、ERK1/2、Mef2c。

1.4.9  Western blot检测TSC-1、ERK1/2、Mef2c的蛋白表达  取共培养及单独培养完成的细胞，用Western blot检测各组细胞TSC-1、ERK1/2、Mef2c的表达。

蛋白样品制备：每10⁶个细胞中加入500 μL RIPA裂解液(含50 μL蛋白酶抑制剂)，冰上混匀，冰浴上静置裂解   20 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清液。根据BCA试剂盒说明书进行蛋白浓度测定。

SDS-PAGE电泳：①调整各个样品的蛋白上样量均为80 μg(总蛋白上样量均一化)，上样体积用RIPA裂解液补齐至15 μL，以保证蛋白上样量和上样体积一致，每管加入   3 μL 6×loading buffer，吹打混匀，于沸水中变性10 min，瞬时离心5 s，4 ℃短暂保存，-20 ℃长期保存；②清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，一只手蘸洗衣粉少许轻轻擦洗，自来水充分冲洗，双蒸水冲洗干净后立在筐里放入烘箱烘干；③灌胶与上样。

转膜：采用湿转法转膜。

免疫反应：①将PVDF膜置于5%牛血清白蛋白中，室温(20-30 ℃)封闭1 h；②脱色摇床上，TBST漂洗3次，每次5 min；③尽量吸干BSA液，加入一抗5 mL，装入杂交袋中，将剪好的PVDF膜置于其中，捆绑于静音混合仪上，放置4 ℃冰箱中过夜；④取出杂交袋，室温复温10 min，去除一抗液体，加入TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；⑤加入酶标二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次     10 min。

化学发光、显影、定影：用吸水纸尽量吸干PVDF膜上的水分，将其平放在采集化学发光信号凝胶成像仪里，不要有气泡；吸取ECL试剂盒中的A液和B液各50 μL加入900 μL双蒸水中，混匀，均匀地滴加到膜上；点击live aquire，开始采集图像。

1.5  主要观察指标  ①各组BMSCs表达出心肌细胞特异性抗原荧光强度及量；②各组BMSCs中TSC-1、ERK1/2、Mef2c表达水平。

1.6  统计学分析  使用SPSS 15.0软件进行统计分析。数据以x(_)±s表示，各细胞亚群间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni post-hoc检验。所有统计假设检验均为双侧假设检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

前期已经证明过表达GATA-4的BMSCs分泌的外泌体可以通过促进BMSCs向心肌样细胞分化有效修复心肌梗死引起的心肌损伤^[3-4]，进一步发现在其分泌的外泌体中miRNA-673-5p明显高表达且功能涉及促分化，提示miRNA-673-5p可能是外泌体修复心肌损伤的关键分子^[3]。

在验证miRNA-673-5p功能时：BMSCs^{miR-673-5p-mimic}- exosome+BMSCs组心肌特异性分子免疫荧光强度最强，其BMSCs表达心肌细胞特异性分子α-actin、Desmin、cTnT、Cx43的含量最高(P < 0.05)。BMSCs^{miR-673-5p-mimic}- exosome+BMSCs组BMSCs内的TSC-1蛋白表达最低。

BMSCs可用于心肌梗死后心肌修复，主要是BMSCs能分化为心肌样细胞或是内皮细胞^[5-6]，但BMSCs向心肌样细胞分化能力不足，因而作者将目光转向了GATA-4。GATA结合蛋白是具有Ⅳ型锌指结构的转录因子。脊椎动物有2类GATA结合蛋白，GATA-1/2/3参与了造血系统调控，GATA-4/5/6则参与心脏、肠及外胚组织中基因表达调控。GATA-4是调控心脏基因表达的重要转录因子，参与了心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程。GATA-4在心脏发育早期起重要作用，抑制其表达可以阻断P19畸胎瘤细胞向心肌细胞分化，强表达则可增强向心肌细胞分化^[7-10]。作者前期实验已证明经尾静脉向小鼠心肌梗死模型注射BMSCs后可以向心肌样细胞分化，并能改善心肌梗死后的心功能^[11]。

虽然前期实验已经充分证明过表达GATA-4的BMSCs具有更强的抗凋亡能力，能更好地向心肌样细胞分化^[12]，进而更好地修复受损心肌^[13]，但是由于过表达基因的干细胞在体内的长期影响无法估量，细胞属性不清楚，为此无细胞修复心肌梗死被提上了日程。外泌体做为细胞分泌小体，能够使细胞在不直接接触下完成信息的传导^[14]。对此，将研究转向外泌体。

外泌体是小的膜性囊泡，从20世纪90年代起受到极大关注^[15]。在最近5年内，有超过1 500篇有关“Exosome”的文章可以在PubMed上被检索到，而且囊泡协会有超过700个单位加入^[16]。前期在纠正复杂先天性心脏病时曾提取外泌体，并进行电镜检测，可见其大小介于80-100 nm之间^[17]。所有的外泌体都包括膜转运体、溶质蛋白(GTpase)、四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD8、CDS2)、HSP70、HSP90、囊泡生成蛋白、磷脂相关蛋白及磷     脂^[18-19]。生理学上外泌体与胞质小体相似，为脂质双层富含磷脂酰丝氨酸、神经酰胺和鞘磷脂^[20]。

外泌体可以保护缺血再灌注损伤的组织，它具有减轻心肌缺血再灌注损伤的效果。HE等^[21]将间充质干细胞培养基采用滤膜将内部成分系统性的分为各个等级大小，具有心肌保护成分为>1 000 kPa，即心肌保护是由直径为50-100 nm的囊泡所介导的。间充质干细胞改善心肌缺血已有大量研究，据HOOD^[22]报道间充质干细胞分泌的外泌体可以改善缺血再灌注损伤，其在狭小心肌修复窗内，通过在细胞间快速传递功能性蛋白和miRNA而启动细胞修复。外泌体含有的miRNA主要为一些前体形式，推测在心肌保护中外泌体的介入可能代表着其发挥着重要的组织修复功能，也有可能不同的细胞其分泌出不同的外泌体，进而修复不同的组织。

前期在纠正复杂先天性心脏病时，提取患儿血液中的外泌体进行分析，发现miRNA-155可能与先天性心脏病发病有关^[23-24]。外泌体的产生和所含内容可能会由于来源细胞接受分子信号不同而不同。作为这一假说的证据是肿瘤细胞暴露于缺氧环境下，其分泌的外泌体具有增强血管生成和促进转移的潜能，这表明肿瘤细胞为适应缺氧微环境而分泌刺激血管生成或促进转移的分子；另一方面，间充质干细胞的myc永生化基因并没有改变外泌体保护心肌的效果^[25]。

前期已经成功证实过表达GATA-4的BMSCs分泌的外泌体(BMSCs^GATA-4-exosome)，可以促进BMSCs表达出心肌细胞特异性分子。采用RNA-seq检测BMSCs^GATA-4- exosome与BMSCs^空载体-exosome及BMSCs-exosome中的miRNA变化，并筛选出前10位上调及下调的miRNA，发现miRNA-673-5p的表达量最多，且功能涉及分化。该研究进一步证实miRNA-673-5p表达量的增加可促使BMSCs向心肌样细胞分化，进而发挥了修复心肌损伤的效果及作用。

MicroRNAs(miRNAs)是一大类长度为18-25个核苷酸的小分子非编码RNA^[26]，在哺乳动物基因组中已经发现200多种miRNAs^[27]。miRNA-673-5p和MAVS之间的相互作用在多能性过程中抑制抗病毒IFN的转换，并提供增强其抗病毒免疫力的遗传途径^[28]。SKEELES等^[29]用MicroInspector，Patrocles和microSNiPer评估并预测了ETV1和Ifrd1基因内SNPs对miRNA结合位点的影响，并确定了11个SNPs与总共43个miRNA差异性结合。通过RNAhybrid和RNAcofold两种工具，确定了Ifrd1为miRNA-3064-5p和miRNA-875-3p两种miRNA靶标，ETV1为miRNA-673-5p靶标，在两种小鼠品系预测差异中杂交自由能均大于5 kcal/joule MFE。

该研究采用基因数据库对miRNA-673-5p的靶基因进行预测(筛选条件：靶基因总和>10同时靶基因与miRNA的匹和度>8)，可见miRNA-673-5p对应的靶基因为Mef2c、ERK1/2、TSC-1。采用Western blot检测了各组共培养条件下BMSCs内Mef2c、ERK1/2、TSC-1蛋白的表达，可见TSC-1蛋白呈现出明显的规律性。TSC1和TSC2是肿瘤综合征TSC(结节性硬化症复合体)中突变的肿瘤抑制基   因^[30-31]。总之，TSC1通过ICOS依赖性和非依赖性机制抑制mTORC1信号传导，对T细胞无反应性是至关重要的^[32]。TSC1-TSC2(hamartin-tuberin)复合物通过GAP(GTP酶活化蛋白)调节小G蛋白Rheb(重组人富集于脑Ras同系物)的活性，是mTORC1的关键负调节因子^[33]。研究发现，MYC通过转录激活TSC1启动子和减弱miR-15a的抑制作用，诱导TSC1表达^[34]。由TSC1或TSC2突变导致的错构瘤综合征，其中约60%的患者出现心脏横纹肌瘤^[35]。在软骨骨化过程中，软骨细胞中mTORC1信号过度激活会导致明显的脊柱畸形，软骨细胞可能是导致先天性脊柱畸形的细胞类型^[36]。研究结果表明，心脏中TSC1的缺失会引起心脏扩大，这是由于心肌细胞增殖增加所致^[37-40]。这与该研究一致：TSC-1的下调可以引起心肌细胞数量增加。

综上所述，miRNA-673-5p(+)-TSC1/2(-)途径是    BMSCs^GATA-4-exosome促进BMSCs向心肌样细胞分化、修复心肌损伤的关键途径。

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文题释义：

外泌体：是小的膜性囊泡，从20世纪90年代起受到极大关注。此词于1981年首先提出，是从细胞上产生的鳞片状脱落的囊泡，具有胞外酶的活性。外泌体所含的蛋白及miRNA可能是其生物学功能的主要部分。

小分子RNA：是一大类长度为18-25个核苷酸的小分子非编码RNA，在哺乳动物基因组中已经发现200多种小分子RNA。

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冠心病导致的心肌梗死是疾病谱中主要致死因素，骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗心肌梗死的机制不详，使其应用受到限制。课题组前期实验证明，过表达心脏基因转录因子GATA-4的BMSCs分泌的外泌体(BMSCs^GATA-4-exosome)可以促进BMSCs向心肌细胞分化，提示BMSCs^GATA-4-exosome 可以修复心肌梗死，同时发现BMSCs^GATA-4-exosome中及心肌梗死局部心肌组织中的miR-673-5p明显高表达且功能涉及细胞分化，可能是BMSCs^GATA-4-exosome修复心肌梗死的关键分子。因此，该课题将BMSCs过表达miR-673-5p，然后提取其分泌的外泌体，通过体外免疫荧光及western blot检测BMSCs^GATA-4‑exosome通过miRNA-673-5p抑制TSC-1蛋白表达促进BMSCs向心肌样细胞分化。

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