富白细胞-血小板纤维蛋白促进创面愈合的优势

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0684

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (34): 5484-5489.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0684

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富白细胞-血小板纤维蛋白促进创面愈合的优势

武钰翔¹，司少艳²，许樟荣³，王爱红^1，3

¹安徽医科大学中国人民解放军第306医院临床学院内分泌科，北京市 100101；²特种医学实验研究中心，北京市 100101；³中国人民解放军第306医院内分泌科，北京市 100101

收稿日期:2018-06-29 出版日期:2018-12-08 发布日期:2018-12-08
通讯作者: 王爱红，博士，硕士生导师，中国人民解放军第306医院内分泌科，北京市 100101
作者简介:武钰翔，男，1991年生，安徽省六安市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事糖尿病及其慢性并发症研究。
基金资助:
全军医学科技青年培育计划拔尖项目(16QNP041)；首都临床特色应用研究(Z141107002514181)；中华医学会临床医学科研专项资金项目(12020580358)

Leukocyte- and platelet-rich fibrin promotes wound healing

Wu Yuxiang¹, Si Shaoyan², Xu Zhangrong³, Wang Aihong^{1, 3}

¹Department of Endocrinology, the 306^th Hospital of PLA, Clinical Medicine College of Anhui Medical University, Beijing 100101, China; ²Special Medical Laboratory and Research Center, Beijing 100101, China; ³Department of Endocrinology, the 306^th Hospital of PLA, Beijing 100101, China

Received:2018-06-29 Online:2018-12-08 Published:2018-12-08
Contact: Wang Aihong, MD, Master’s supervisor, Department of Endocrinology, the 306th Hospital of PLA, Clinical Medicine College of Anhui Medical University, Beijing 100101, China; Department of Endocrinology, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China
About author:Wu Yuxiang, Master candidate, Department of Endocrinology, the 306th Hospital of PLA, Clinical Medicine College of Anhui Medical University, Beijing 100101, China
Supported by:
the PLA Medical Science and Technology Project for Youth Cultivation, No. 16QNP041; a grant from Beijing Municipal Science & Technology Commission, No. Z141107002514181; the Clinical Medical Research Special Project of Chinese Medical Association, No. 12020580358

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

富白细胞-血小板血浆：1993年Hood等首先提出富血小板血浆概念，是全血经过2次离心后，加入激活剂后混匀，分离得到的血小板浓缩物。富白细胞-血小板血浆含有丰富的血小板，血小板的回收率为60%左右，血小板中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子、转化生长因子β、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子等。

富白细胞-血小板纤维蛋白：2001年由法国科学家Choukroun等发现，是继富血小板血浆后第2代血小板浓缩制品。在无外源性添加剂的情况下，全血经过1次离心后，直接分离得到的富含血小板和白细胞的凝胶。富白细胞-血小板纤维蛋白中血小板的回收率高达97%以上，纤维蛋白含量丰富，血小板中的细胞因子随着纤维蛋白的溶解逐渐释放，具有缓释作用。

背景：富白细胞-血小板血浆和富白细胞-血小板纤维蛋白是两种具有加快创面愈合功效的自体富血小板凝胶。

目的：比较富白细胞-血小板纤维蛋白及富白细胞-血小板血浆在组成成分、结构、释放生长因子方面的差异?

方法：抽取志愿者空腹静脉血，每份血样分别制备富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶与富白细胞-血小板血浆凝胶，采用光镜及扫描电镜观察凝胶的微观结构，计算白细胞、血小板的浓缩倍数及回收率。将两种凝胶保存于DMEM培养基中，1，3，7，14，21 d后收集含有渗出液的培养液，ELISA法检测血小板源性生长因子、转化生长因子β1、血管内皮细胞生长因子的浓度。

结果与结论：①光镜下显示，富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶内的血小板?白细胞与红细胞分界清晰，可见大量白细胞及纤维蛋白簇集；富白细胞-血小板血浆凝胶的血小板、白细胞较少，散在红细胞中；②电镜下显示，富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶中含有大量纤维蛋白，形成致密的特殊3D结构，交界处血小板叠加结构清晰；富白细胞-血小板血浆凝胶交界处纤维较少且夹杂大量血小板，部分血小板已裂解；③与富白细胞-血小板血浆凝胶比较，富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶具有更高的血小板回收率(P=0)、白细胞回收率(P=0)及淋巴细胞回收率(P=0)；④除血管内皮细胞生长因子外，富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶保存3，7，14，21 d的转化生长因子β1、血小板源性生长因子浓度高于富白细胞-血小板血浆凝胶；⑤结果表明与富白细胞-血小板血浆凝胶相比，富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶制备更简单、结构更优、生长因子释放更缓慢，在治疗创面中更有优势。

ORCID: 0000-0001-8605-3645(武钰翔)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 富白细胞-血小板纤维蛋白, 富白细胞-血小板血浆, 富血小板凝胶, 机制, 生长因子, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Leukocyte- and platelet-rich plasma (L-PRP) and leukocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF) are two kinds of autologous platelet rich gels that can accelerate wound healing.

OBJECTIVE: To compare the differences in the composition, structure and release of growth factors between L-PRP and L-PRF.

METHODS: Fasting blood samples were collected from healthy volunteers to prepare L-PRP and L-PRF gels. The microstructure of the gels was observed by light microscope and scanning electron microscope, and the concentration times and recovery rates of leukocytes and platelets were calculated. The two gels were stored in DMEM medium. After 1, 3, 7, 14 and 21 days, the culture fluid containing exudate was collected. The platelet-derived growth factor, transforming growth factor β1, and vascular endothelial growth factor were detected by ELISA.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the light microscope, platelet, leukocytes and erythrocytes were clearly demarcated, and leukocytes and fibrin aggregated in cluster. The platelets and leukocytes in the L-PRP gel were less in number and dispersed among erythrocytes. (2) Under the electron microscope, a large amount of fibrins were in the L-PRF gel, to form a dense special 3D structure, and the platelet superposition structure at the junction was clear. There were less fibers and a large number of platelets at the junction of L-PRP gel, and some of the platelets were cleaved. (3) Compared with the L-PRP gel, the L-PRF had a higher platelet recovery rate (P=0), leukocyte recovery rate (P=0) and lymphocyte recovery rate (P=0). (4) In addition to the vascular endothelial cell growth factor, the levels of transforming growth factor β1 and platelet-derived growth factor in the L-PRF gel stored for 3, 7, 14 and 21 days were higher than those in the L-PRP gel. These findings indicate that compared with the L-PRP gel, the L-PRF gel is easier to prepare, has better structure and slower release of growth factors, which have more advantages in the treatment of wounds.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Platelet-Rich Plasma, Fibrin, Wound Healing, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

武钰翔，司少艳，许樟荣，王爱红. 富白细胞-血小板纤维蛋白促进创面愈合的优势[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(34): 5484-5489.

Wu Yuxiang, Si Shaoyan, Xu Zhangrong, Wang Aihong. Leukocyte- and platelet-rich fibrin promotes wound healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(34): 5484-5489.

图/表（结果） 8

2.1 光镜下观察凝胶结构富白细胞-血小板纤维蛋白内的血小板、白细胞与红细胞分界清晰(图1A)，可见大量的白细胞及纤维蛋白簇集(图1B，C)；富白细胞-血小板血浆的血小板、白细胞少，散在红细胞中(图2)?

2.2 电镜下观察凝胶结构电镜下观察发现富白细胞-血小板纤维蛋白中含有大量纤维蛋白，形成致密的特殊3D结构，交界处血小板叠加结构清晰(图3)；富白细胞-血小板血浆交界处纤维较少夹杂大量血小板，部分血小板已裂解(图4)。

2.3 两种凝胶成分的比较两种凝胶内血小板浓缩倍数比较无差异，但富白细胞-血小板纤维蛋白内有更高的血小板、白细胞及淋巴细胞回收率(P < 0.01)，见表1。

2.4 两种凝胶释放生长因子的比较在富白细胞-血小板纤维蛋白中，血管内皮细胞生长因子质量浓度在第3天达高峰，转化生长因子β1质量浓度在第7天达高峰，血小板源性生长因子质量浓度在第14天达到高峰；在富白细胞-血小板血浆中，血管内皮细胞生长因子质量浓度在第7天达高峰，转化生长因子β1质量浓度在第1天达高峰，血小板源性生长因子质量浓度在第1天达高峰。

富白细胞-血小板血浆第7天释放的血管内皮细胞生长因子质量浓度显著高于富白细胞-血小板纤维蛋白[(947.79±303.18)，(1 692.75±781.2) ng/L，P=0.008]，两种凝胶第1，21天释放的转化生长因子ß1质量浓度比较差异有显著性意义[(14 369.77±12 489.34)，(382 32.18± 314 65.05) ng/L，P=0.028；(19 295.26±22 477.88)， (4 391.95± 4 113.73) ng/L，P=0.044]，两种凝胶各个时间段释放血小板源性生长因子的质量浓度比较差异有显著性意义[(2 529.37±915.16)，(16 835.82±9 523.03) ng/L，P < 0.001；(3 528.50±2 098.38)，(1 271.38±382.94) ng/L，P=0.003；(3 220.56±1 417.73)，(1 105.31±349.06) ng/L，P < 0.001；(5 393.52±3 480.30)，(1 166.80±767.82) ng/L，P=0.001；(2 808.66±2 081.65)，(726.12±259.29) ng/L，P=0.005]。两种凝胶中上述生长因子释放随时间变化的情况，见图5-7。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2013年6月至2017年6月在中国人民解放军第306医院特种医学实验研究中心完成。

1.3 材料血样来源于13名志愿者，其中男6名，女7名；年龄24-29岁，平均年龄26.1岁?

纳入标准：①年龄在20-30岁之间，性别不限；②符合《中华人民共和国献血法》的要求，白细胞数> 4×10⁹ L^-1且白细胞数< 10×10⁹ L^-1，血小板数> 100×10⁹ L^-1；③采血前1周内不吸烟、不饮酒，不服用任何影响血小板和凝血系统功能的药物；④签署实验知情同意书。

排除标准：①患有严重心脏病、结核、肝炎、肾脏疾病、糖尿病、恶性肿瘤等；②需要长期或近期内服用影响血小板和凝血系统功能的药物而近1周内不能停用者；③哺乳期、孕期的妇女；④依从性差或拒绝签署知情同意书者。

实验用主要试剂和仪器：血小板源性生长因子、转化生长因子β1、血管内皮细胞生长因子ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；2 000单位凝血酶冻干粉(长春国奥药业公司)；10%葡萄糖酸钙注射液(天津药业公司)；Gibco无酚红DMEM培养液(美国英杰公司)；H2050R型台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；XS-800i型全自动血细胞分析仪(日本Sysmex株式会社)；MR-96A型酶标测试仪(深圳迈瑞公司)；RS232型CO₂培养箱(德国Herareus公司)；MDF-U32V型-80 ℃冰箱(日本SANYO公司)；BCD-265CR型4 ℃冰箱(合肥荣事达冰箱有限公司)；BX50型光镜显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 凝胶的制备用一次性采血针抽取12名志愿者静脉血各15.5 mL，4.5 mL装入不含抗凝剂的真空采血管，用于制备富白细胞-血小板纤维蛋白；剩余11 mL装入含有体积分数3.2%枸橼酸钠的真空采血管，用于制备富白细胞-血小板血浆和全血血小板、白细胞、淋巴细胞计数。

制备富白细胞-血小板纤维蛋白：为防止采血后血液凝集，应将采集的4.5 mL静脉血立即以400×g离心10 min，离心后管内分3层，静止5 min后直接分离中间层，即为富白细胞-血小板纤维蛋白。

制备富白细胞-血小板血浆：从11 mL静脉血中取 4.5 mL，先以160×g离心20 min，离心后分为3层，即上清、淡黄色中层及红细胞层，取上清、中层及红细胞层1 mL，转移至离心管中，再以400×g离心15 min，弃去3/4上清液，剩余1/4混匀即得富白细胞-血小板血浆，然后以10∶1比例加入激活剂后混匀，静止30 min得富白细胞-血小板血浆凝

胶。剩余血液用于全血血小板、白细胞、淋巴细胞计数。

1.4.2 光镜?电镜结构观察采集1名志愿者空腹外周静脉血10 mL，分为2管(5 mL/管)，分别制备得富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶、富白细胞-血小板血浆凝胶，每个凝胶体积约0.8 mL。取每种凝胶各2个，分别转移至4只含有 4 mL无菌DMEM培养基的试管中，放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中保存。取两种凝胶各1个，经体积分数10%甲醛固定，石蜡包埋后切片，厚度5-7 μm，常规苏木精-伊红染色，分别光镜、电镜下观察并拍照记录?

1.4.3 计算血小板、白细胞的浓缩倍数和回收率血小板浓缩倍数(%)=富白细胞-血小板血浆(或富白细胞-血小板纤维蛋白)中血小板浓度/全血中血小板浓度×100%；白细胞浓缩倍数(%)=富白细胞-血小板血浆(或富白细胞-血小板纤维蛋白)中白细胞浓度/全血中白细胞浓度×100%；血小板回收率(%)=富白细胞-血小板血浆(或富白细胞-血小板纤维蛋白)中血小板总数/全血中血小板总数×100%；白细胞回收率(%)=富白细胞-血小板血浆(富白细胞-血小板纤维蛋白)中白细胞总数/全血中白细胞总数×100%；淋巴细胞回收率(%)=富白细胞-血小板血浆(或富白细胞-血小板纤维蛋白)中淋巴细胞总数/全血淋巴细胞总数×100%。

1.4.4 酶联免疫吸附分析细胞因子浓度将制备好的2种凝胶分别转移至4 mL DMEM培养液中，放入37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱内保存。在培养的第1，3，7，14，21天，取出两组凝胶，转移至另两组新DEME培养基中，继续放入37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱内保存，搜集含有渗出液的DEME培养液，于-80 ℃保存。采用ELISA法检测两种凝胶在第1，3，7，14，21天的血小板源性生长因子、转化生长因子β1、血管内皮细胞生长因子的浓度，按试剂盒说明书操作。

1.5 主要观察指标两种凝胶的微观结构，白细胞、血小板回收率，以及保存于DMEM培养基中的生长因子释放情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件包进行分析，计量资料用x(_)±s表示，计数资料用率表示。将不符合正态分布的计量资料经对数转换后使之基本符合正态分布，两样本均数的比较用t 检验，多个样本均数的比较用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义?

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

慢性难愈合创面危害患者身体健康的同时，也给患者带来沉重的经济负担。加快创面愈合，不仅可提高患者生活质量，而且能够降低医疗费用^[17]。富白细胞-血小板血浆和富白细胞-血小板纤维蛋白内含有大量的血小板?白细胞等，其中血小板中储存着大量的生长因子，包括血管内皮细胞生长因子、转化生长因子β1、血小板源性生长因子等，这些生长因子不仅可促进细胞的迁移、增殖、分化，还能够促进血管、神经的修复^[18-22]，这些都有利于创面的愈合。作者根据实验结果，分别从制备过程、超微结构和生长因子释放3个方面进行讨论?

首先两种凝胶制备过程有着很大区别，第1代凝胶取自外周静脉血，经2次离心、分离、浓缩制得的富白细胞-血小板血浆，将其按10∶1比例与凝血酶-钙剂混合凝固形成富白细胞-血小板血浆凝胶。富白细胞-血小板纤维蛋白的基本制备流程是静脉血在无抗凝剂存在的情况下，经1次离心后，全血分为3层：上层为血浆层，中间凝胶状物质即为富白细胞-血小板纤维蛋白，下层为红细胞层，弃去血清，将凝胶层与红细胞层分离，得到自然形成的富白细胞-血小板纤维蛋白。从制备过程中发现，与富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶相比，第1代富白细胞-血小板血浆凝胶存在以下几个问题：①国内外目前没有富白细胞-血小板血浆的统一制备标准，使用的设备、离心力、离心时间等指标各不相同，不同的制备方法得到的凝胶所含血小板、白细胞等的含量和活性不一，无法确定最适方案^[23-25]；②牛凝血酶和氯化钙是制备富白细胞-血小板血浆最常使用的激活剂，使用牛凝血酶的过程中可能伴有凝血因子Ⅴ、Ⅺ抗体的形成，可能发生凝血紊乱，同时加入的生物制剂存在引起过敏反应、交叉感染的风险，威胁患者的生命^[26]；③在体外，因为抽血时间、储血器皿、放置时间等因素，可能使血小板因外源性的刺激而被破坏。基于以上问题可见，富白细胞-血小板纤维蛋白的制备更为简单，制备过程中不需要添加任何外源性的化学物质，得到接近生理状态血凝胶?

其次，光镜、电镜下观察到富白细胞-血小板血浆内的纤维蛋白稀疏结构杂乱；富白细胞-血小板纤维蛋白则具有3D结构的纤维蛋白基质网络，其中富含大量的血小板和白细胞，这种3D结构类似于人类天然形成的组织结构，使富白细胞-血小板纤维蛋白作用于创面后，一方面能够诱导细胞的迁移增殖^[27-28]，另一方面血小板激活后释放的生长因子，能够储存在纤维蛋白结构中或呈递给靶细胞^[29]，缓慢释放生长因子。此外，富白细胞-血小板纤维蛋白还可黏合创缘，降低创口张力，使创面免于暴露，减少进一步损伤和污染的机会^[30-32]?根据此次实验结果可以发现，富白细胞-血小板纤维蛋白较富白细胞-血小板血浆有更高的血小板回收率及淋巴细胞回收率，其中两种凝胶中白细胞回收率和淋巴细胞回收率存在显著差异。目前已有研究显示两种凝胶具有一定的抗菌作用，富白细胞-血小板血浆和富白细胞-血小板纤维蛋白能够抗菌主要是源自血小板中的血小板杀菌蛋白，血小板杀菌蛋白通过抑制细菌体内的蛋白质合成发挥抗菌作用^[33-34]?两种凝胶中含有的大量的白细胞，也是其发挥抗菌作用的重要因素。由此可见，富白细胞-血小板纤维蛋白含有更高的血小板、白细胞和淋巴细胞浓度，可能有更好的抗炎作用?

最后对比两种凝胶中转化生长因子β1、血管内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子等3种生长因子释放情况，发现在富白细胞-血小板纤维蛋白中，血管内皮细胞生长因子质量浓度在第3天达高峰，转化生长因子β1质量浓度在第7天达高峰，血小板源性生长因子质量浓度在第14天达到高峰；在富白细胞-血小板血浆中，血管内皮细胞生长因子质量浓度在第7天达高峰，转化生长因子β1质量浓度在第1天达高峰，血小板源性生长因子质量浓度在第1天达高峰。由于富白细胞-血小板血浆制备过程中添加了牛凝血酶和氯化钙，富白细胞-血小板血浆中的血小板被激活后，大量血小板脱颗粒释放出生长因子。从此次研究结果来看，富白细胞-血小板血浆中除血管内皮细胞生长因子外，另外两种生长因子都在第1天达高峰，随后下降到一个较低水平，导致生长因子仅作用于创面愈合的前期。而富白细胞-血小板纤维蛋白制备过程中不需要添加外来物质，以及富白细胞-血小板纤维蛋白特殊的纤维结构，使血小板无法被立即激活，随着富白细胞-血小板纤维蛋白中纤维蛋白的降解，血小板逐渐被激活并释放生长因子，3种生长因子出现不同程度的升高，分别在第3，7，14 天达高峰，延长了生长因子在创面的作用时间^[35]。从此次研究结果看，相比于富白细胞-血小板血浆，富白细胞-血小板纤维蛋白释放生长因子的高峰靠后，能够在较长时间内维持较高生长因子浓度，表现出缓慢释放现象。

综上所述，富白细胞-血小板纤维蛋白是在不添加化学物质的情况下，由全血分离提取的富含白细胞和血小板的纤维蛋白成分，具有制备程序较规范、工艺简单，独特的三维结构、生长因子释放缓慢等特点。相比之下，富白细胞-血小板纤维蛋白在治疗慢性难愈合创面方面具有更好的潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

富白细胞-血小板纤维蛋白促进创面愈合的优势

Leukocyte- and platelet-rich fibrin promotes wound healing

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