钛材料和纳米羟基磷灰石修复大鼠骨缺损：对免疫调控的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0707

摘要/Abstract

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文题释义：

理想的骨缺损修复材料：应该具备以下特性：具备良好的生物相容性；具有足够的力学性能及良好的生物学适应性；骨传导性能良好且具备诱导性；能为细胞提供足够的增殖空间，具有良好的骨组织界面；可塑性较好。

免疫调节：是指免疫系统中的免疫细胞和免疫分子之间，以及与其他系统如神经内分泌系统之间的相互作用，使得免疫应答以最恰当的形式维持在最适当的水平。免疫调节可比喻为机体的交响乐队，配合好—识别和清除抗原，对自身成分产生免疫耐受，维持内环境的稳定；配合差—病原微生物感染、肿瘤、自身免疫病、免疫缺陷病、超敏反应。

背景：研究表明，钛材料具有良好的生物学性能，能调控成骨细胞的黏附、增殖和分化，但有关钛材料在大鼠骨缺损中的修复效果及对机体免疫调控影响的研究较缺乏。

目的：探讨钛材料在大鼠骨质疏松性骨缺损中的修复效果及对机体免疫调控的影响。

方法：摘除30只Wistar大鼠双侧卵巢，建立骨质疏松模型。3个月后，在30只大鼠股骨远端制备直径为2.5 mm的穿通骨缺损，随机分3组干预，每组10只：阴性对照组不进行任何干预，羟基磷灰石组在骨缺损处填充纳米羟基磷灰石，钛材料组在骨缺损处填充钛材料。干预5 d后，采用酶联免疫吸附实验检测血清白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平，采用流式细胞仪检测血清T淋巴细胞亚群水平；干预5，10周后，苏木精-伊红染色观察缺损部位组织形态。

结果与结论：①干预5 d后，钛材料组白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平明显低于阴性对照组、羟基磷灰石组(P < 0.05)；②干预5 d后，钛材料组CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺比值均明显高于羟基磷灰石组、阴性对照组(P < 0.05)；③苏木精-伊红染色显示，阴性对照组干预5，10周后形成少量骨，被大量纤维组织、脂肪细胞充填；羟基磷灰石组干预5周后可见少许成骨细胞形成，干预10周后材料开始降解，被新生骨代替；钛材料组干预5周后可见少许连续骨小梁，排列规则，血管相对丰富，10周后骨小梁数量较多，缺损部位基本愈合；④结果表明，将钛板材料修复大鼠骨质疏松性骨缺损的效果理想，能调节骨缺损修复中引起的免疫反应。

ORCID: 0000-0002-2817-7356(刘锋)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 钛材料, 骨质疏松, 骨缺损修复, 纳米羟基磷灰石, 酶联免疫吸附实验, 修复效果, 免疫调控, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that titanium has good biological properties and regulate osteoblast adhesion, proliferation and differentiation, but there are few reports on the effect of titanium materials on bone defect repair and on immune regulation in rats.

OBJECTIVE: To investigate the effect of titanium materials in the repair of osteoporotic bone defect in rats and its effect on immune regulation.

METHODS: Bilateral ovaries were removed from 30 Wistar rats to establish osteoporosis models. Three months after modeling, a percutaneous bone defect with the diameter of 2.5 mm was prepared on the distal femur of all the 30 rats. These model rats were then randomly divided into three groups with 10 rats in each group: negative control group without any intervention, hydroxyapatite group filled with nano-hydroxyapatite, and titanium material group filled with titanium material. Serum interleukin-1, tumor necrosis factor-α and interleukin-6 levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay after 5 days of intervention, and meanwhile, serum T-lymphocyte subsets were detected by flow cytometry. After 5 and 10 weeks of intervention, hematoxylin-eosin staining was used for morphological observation of the defect site.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 5 days of intervention, the levels of interleukin-1, tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in the titanium material group were significantly lower than those in the negative control and hydroxyapatite groups (P < 0.05). (2) After 5 days of intervention, the levels of CD4⁺ and CD8⁺and the ratios of CD4⁺/CD8⁺in the titanium material group were significantly higher than those in the hydroxyapatite and negative control groups (P < 0.05). (3) Hematoxylin-eosin staining results showed that a small amount of bone tissues filled with a large amount of fibrous tissues and adipocytes formed in the negative control group at 5 and 10 weeks after intervention. A little bone formation was observed in the hydroxyapatite group at 5 weeks after intervention, and the implant began to degrade at 10 weeks and was gradually replaced by new bone tissues. A small amount of trabecular bones enriched with blood vessels arranged orderly in the titanium material group at 5 weeks after intervention; and at 10 weeks, the number of trabecular bone increased and the defect was basically healed. Taken together, the titanium plate can achieve good results in the repair of osteoporotic bone defects in rats, and moreover, it can control the immune response during the bone defect repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Titanium, Osteoporosis, Hydroxyapatites, T-Lymphocyte Subsets, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘锋，梁载明. 钛材料和纳米羟基磷灰石修复大鼠骨缺损：对免疫调控的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(10): 1506-1510.

Liu Feng, Liang Zai-ming. Titanium and nano-hydroxyapatite for bone defect repair in rats: effects on immune regulation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(10): 1506-1510.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 30只Wistar大鼠全部进入结果分析，中途无脱落。

2.2 各组大鼠术后大体观察骨缺损术后7 d，阴性对照组切口部位未愈合完全，存在明显的切口印记，手术缝线自行脱落，爬行异常，2只大鼠发生骨折；羟基磷灰石组和钛材料组经相应措施处理切口愈合，切口印记模糊，大鼠能正常爬行，术后均未发生骨折。

2.3 各组大鼠炎症因子水平比较骨缺损前，3组白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)。骨缺损修复后5 d，阴性对照组白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平无明显变化 (P > 0.05)，钛材料组与羟基磷灰石组白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平均低于骨缺损前(P < 0.05)，钛材料组白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平低于羟基磷灰石组、阴性对照组(P < 0.05)，羟基磷灰石组白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平低于阴性对照组(P < 0.05)，见表1。

2.4 修复前后各组T淋巴细胞亚群水平的比较骨缺损前，3组CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺比值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。骨缺损修复后5 d，阴性对照组CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺比值明显低于骨缺损前(P < 0.05)，CD8⁺水平无明显变化(P > 0.05)；钛材料组CD4⁺水平无明显变化(P > 0.05)，CD8⁺水平高于骨缺损前(P <0.05)，CD4⁺/CD8⁺比值低于骨缺损前(P <0.05)；羟基磷灰石组CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺比值低于骨缺损前(P < 0.05)，CD8⁺水平高于骨缺损前(P < 0.05)；钛材料组CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺比值均高于羟基磷灰石组和阴性对照组(P < 0.05)；羟基磷灰石组CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺比值均高于阴性对照组 (P < 0.05)，见表2。

2.5 修复后各组骨缺损处苏木精-伊红染色结果阴性对照组修复5，10周后成形少量骨，被大量纤维组织、脂肪细胞充填；羟基磷灰石组修复后5周可见少许成骨细胞形成，修复10周后材料开始降解，被新生骨代替；钛材料组修复5周后可见少许连续骨小梁，排列规则，血管相对丰富，10周后骨小梁数量较多，缺损部位基本愈合，见图1。

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引言

骨质疏松症是一种以骨量下降、骨微结构破坏、骨脆性增强及骨折、骨缺损发生率增加的疾病^[1]。文献报道显示在女性中，骨质疏松症主要由于绝经后雌激素下降引起，临床表现为骨形成减少，再加上破骨细胞数目增加、雌激素减少，导致患者骨折后愈合时间较长^[2]。通常来说，对于小范围的骨缺损可通过机体自我修复实现机体愈合，但当骨缺损达到或超过临界缺损时，则需要植入生物材料进行辅助治疗^[3]。理想的骨缺损修复材料应该具备以下特性：具备良好的生物相容性；具有足够的力学性能及良好的生物学适应性；骨传导性能良好且具备诱导性；能为细胞提供足够的增殖空间，且具有良好的骨组织界面；可塑性较好^[4]。纳米羟基磷灰石是骨质疏松性骨缺损中常用的修复材料，虽然能满足骨质疏松性骨缺损修复的需要，但难以实现对机体的免疫调控作用，植入机体后免疫排斥反应严重，影响修复效果^[5]。

在再生医学领域中，炎症细胞所介导的免疫反应是决定材料、假肢植入成功且保持长期稳定的关键因素^[6]。理想的材料不宜限于生物惰性，还需要具备免疫调节作用，能影响机体免疫反应，促进组织再生^[7]。巨噬细胞是机体免疫反应的效应细胞之一，能显著影响机体对植入材料的长期免疫效应、炎症反应结果。钛及钛合金均为临床常用的植入材料，具有合适的强度、良好的生物相容性，多用于骨科、矫形外科中^[8]。研究表明钛材料具有良好的生物学性能，能调控成骨细胞的黏附、增殖和分化^[9]，但对于钛材料在大鼠骨质疏松性骨缺损中的修复效果及对机体免疫调控的影响比较缺乏。因此，课题以Wistar大鼠作为实验对象，探讨钛材料在大鼠骨质疏松性骨缺损中的修复效果及对机体免疫调控的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3月至2016年4月在西南医科大学附属医院完成。

1.3 材料 ①钛片(陕西医用钛金属有限公司)：厚度0.1-0.5 mm，牌号TA1、标准含量，产地：美国；②羟基磷灰石骨粒(上海百特医疗用品有限公司)：化学名为羟磷灰石钙，型号：BC-130-66-6，用于骨替代原料，外观白色分泌，含量99%，纳米级，CAS：130-66-5，该材料熔点1 650 ℃，密度为3.16 g/cm³，溶解度为0.4 ppm，Ca/P为1.67^[10]。

实验动物：3月龄雌性Wistar大鼠30只，体质量210-230 g，平均(210.00±10.00)g，由西南医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK2014-0002。大鼠饲养时保持恒温(20±2)℃，恒湿50%-60%。实验过程中常规饲养Wistar大鼠，自由摄食、饮水，光照12 h，建模前12 h禁食。

实验用主要仪器和试剂：水合氯醛(上海国药集团化学试剂有限公司)；苏木精-伊红染色剂(Amresco)；包埋用石蜡(北京化学试剂公司)；10%EDTA脱钙液(石家庄杰克化工有限公司)；庆大霉素注射液(河南天方药业股份有限公司)；OLYMPUS BX51多功能显微镜(日本Olympus公司)；医用慢速直流电钻(美国史塞克医疗器械公司提供)；硬组织切片机(Leiea SM2500德国LEICA)；外科缝线(菏泽海希康医疗用品有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型的建立

骨质疏松模型：取30只Wistar大鼠，术前6 h禁食，腹腔注射50 mg/kg的2%戊巴比妥钠溶液进行麻醉，待麻醉生效后进行常规消毒、铺巾，大鼠保持仰卧位姿势，在背部中1/3部位完成剃毛处理，经背部中线距尾巴基底部3 cm部位作长为1.5 cm的手术切口，沿着肩胛线在两侧肋下降腰肌剪开，充分暴露卵巢、子宫角等组织，对卵巢、子宫角行手术进行结扎，将子宫角间断，完成两侧卵巢切除手术，手术后逐层缝合手术切口。将切除的组织进行组织学检查，确定切除组织为卵巢，采用骨密度测定仪测定大鼠骨密度判断建模是否成功。术后将大鼠俯卧在笼子中，每天肌肉注射8×10⁴ U庆大霉素，术后连续喂养3个月^[11]。

骨质疏松性骨缺损模型及干预：3个月后取建模成功的Wistar大鼠，术前称质量，根据50 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行全身麻醉，对手术切口两侧进行剃毛，对手术部位进行碘伏消毒、铺巾，在左膝关节内侧作长为1.5 cm的手术切口，完成肌肉分离，充分暴露股骨干骺端，尽可能减少肌肉、神经血管损伤，翻转髌骨，完成骨膜的剥离，充分暴露股骨踝，采用医用慢速直流电钻钻出直径为 2.5 mm的贯通性骨缺损模型，肉眼直视下可见贯通性骨缺损视为建模成功。钻孔过程中采用生理盐水进行冷却，术中做好手术部位止血。缺损建模后即刻，将大鼠随机分为阴性对照组(n=10)、羟基磷灰石组(n=10)和钛材料组(n=10)，采用生理盐水进行冲洗缺损部位，阴性对照组不采取任何处理；羟基磷灰石组，取购置的纳米羟基磷灰石，制成直径为1.5 mm圆柱状，经过消毒、灭菌后植入大鼠取缺损部位；钛材料组，取购置的钛材料，制成直径为1.5 mm圆柱状，经过消毒、灭菌后植入大鼠取缺损部位。术后将大鼠俯卧在干燥清洁的笼子中，连续5 d肌肉注射庆大霉素，预防感染^[12-13]。

1.5 主要观察指标

大体观察：观察术后各组大鼠运动、饮食、骨折情况。

炎症因子水平：3组骨缺损前、骨缺损修复后5 d，空腹状态下取尾静脉血3 mL，完成血清分离后采用酶联免疫吸附实验测定各组白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平，有关操作严格遵循仪器操作说明书完成^[14]。

T淋巴细胞亚群水平：取上述采集的静脉血，完成血清分离后采用流式细胞计数仪测定各组T淋巴细胞亚群水平，有关操作严格遵循仪器操作说明书完成。

苏木精-伊红染色：各组骨缺损修复后5，10周时，以断颈方式处死大鼠，每组每个时间点5只，取缺损部位组织，制备3 μm切片，行苏木精-伊红染色，观察缺损部位恢复情况^[15]。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件处理，计数资料采用n/%表示，行卡方检验；计量资料采用x(_)±s表示，行t 检验，P < 0.05提示差异有显著性意义。

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讨论

骨质疏松是临床上常见的疾病，且随着人口老龄化的日益加剧，导致疾病发生率呈上升及年轻化趋势，并且由骨质疏松引起的骨折、骨缺损发生率也呈上升趋势，发病后如果得不到及时有效的治疗、干预，将会引起骨延迟愈合，影响患肢功能^[16]。以摘除卵巢诱导骨质疏松是动物模型中常用的建模方法，该建模方法相对简单，建模成功率相对较高，能为课题的后续研究奠定基础^[17]。本课题中，30只大鼠采用去除卵巢方法建立骨质疏松动物模型，并且完成骨缺损模型的建立。阴性对照组大鼠建模后未经任何措施处理，切口部位未愈合完全，存在明显的切口印记，手术缝线自行脱落，术后大鼠爬行异常，实验过程中2只大鼠发生骨折；羟基磷灰石组和钛材料组建模后经相应措施处理，切口愈合，切口印记模糊，术后大鼠能正常爬行，两组术后均未发生骨折。由此看出：课题中使用的建模方法、安全、可靠，能降低实验中大鼠的死亡率，保证课题的顺利完成。

文献报道显示对于小面积骨缺损，机体能自行愈合，但对于大面积缺损则需要植入支架辅助修复^[18-19]。而人工骨材料是骨缺损手术的重要元素之一，常用的骨缺损材料包括羟基磷灰石、氧化铝生物陶瓷及磷酸三钙等，这些材料与骨组织具备相似的理化性能，并且具有一定的成骨能力，生物相容性较好，能在机体内自行降解而在骨缺损中被广泛使用。但骨质疏松性骨缺损相对特殊，骨缺损修复过程中对于材料的性能、免疫调控等提出了更高的要求^[20]。钛是目前使用最为广泛的生物金属材料，具备良好的生物相容性、机械强度和耐腐蚀性，在骨缺损修复、骨折固定及硬组织替换中得到应用^[21]。文献报道显示，金属钛属于生物惰性材料，力学性能良好，植入机体后能与骨组织紧密连接，不会引起进行性骨流失^[22-23]。异物反应是机体伤口愈合相对正常的反应，一般发生在生物材料植入机体后。巨噬细胞在机体异物反应中发挥了重要作用。文献报道显示，材料表面异物巨噬细胞的过度形成、活化会形成相对较厚的纤维包囊，阻碍材料功能的正常发挥，引起植入失败^[24]。此次研究中，钛材料组建模处理后的白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平均低于羟基磷灰石组和阴性对照组(P < 0.05)。由此看出钛材料性能相对优良，具有良好的生物相容性，植入机体后不会引起炎症反应，有助于降低炎症因子水平。由于巨噬细胞在骨代谢过程中发挥了重要作用，骨修复生物材料与巨噬细胞之间的相互作用引起了医学界的关注。免疫调控能力是验证材料形貌的重要特点。文献报道显示，将钛材料用于大鼠缺损修复中能控制细胞的形态，调控巨噬细胞的极化分型，在材料表面存在诸多巨噬细胞。

在骨骼的发育和代谢过程中，巨噬细胞通过分泌多种细胞因子而参与调控此过程，包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等。肿瘤坏死因子α是骨缺损修复中相对重要的调控细胞因子，能抑制间充质干细胞的骨分化，并且能活化核因子kB，增强RANKL介导破骨细胞分化，有助于增强转化生长因子β1，促进纤维化^[25-26]。白细胞介素10属于经典的抑炎因子，能抑制破骨细胞的活性和分化。此次研究中，钛材料组建模处理后CD4⁺、CD8⁺水平高于羟基磷灰石组和阴性对照组(P < 0.05)，建模处理后CD4⁺/CD8⁺比值高于羟基磷灰石组和阴性对照组(P < 0.05)。由此看出，钛材料的使用有助于提高机体免疫水平，发挥良好的免疫调控作用，有助于促进骨缺损部位愈合^[27-28]。同时，巨噬细胞具有高度的弹性空间，能根据自身所处的环境实现不同功能表型的转化，有助于降低炎症因子水平。为了进一步验证钛材料在大鼠骨质疏松性骨缺损中的修复效果，课题中对缺损组织进行苏木精-伊红染色，结果表明，阴性对照组建模后5，10周成形少量骨，被大量纤维组织、脂肪细胞充填；羟基磷灰石组修复后5周可见少许成骨细胞形成；修复10周后材料开始材料降解，被新生骨代替；钛材料组修复5周后可见少许连续骨小梁，排列规则，血管相对丰富，10周后骨小梁数量较多，缺损部位基本愈合。由此看出，钛材料的使用有助于促进骨缺损部位愈合。

综上所述，将钛板材料用于大鼠骨质疏松性骨缺损修复中效果理想，能调节骨缺损修复中引起的免疫反应，提高骨修复治疗及修复效果，具有广泛的应用前景。

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