载丹皮酚透钙磷石骨水泥的制备与表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0815

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (10): 1499-1505.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0815

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载丹皮酚透钙磷石骨水泥的制备与表征

李晓玉¹^，2，李光大²，赵三团³，李永凯²，赵朋超²，彭欢²

¹首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室，北京市 100038；河南科技大学，²医学技术与工程学院，³材料科学与工程学院，河南省洛阳市 471023

收稿日期:2017-11-23 出版日期:2018-04-08 发布日期:2018-04-08
通讯作者: 李光大，博士，副教授，硕士生导师，河南科技大学医学技术与工程学院，河南省洛阳市 471023
作者简介:李晓玉，男，1991年生，河南省新乡市人，汉族，研究实习员，2017年河南科技大学毕业，硕士，见习研究员，主要从事生物材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81402225，21461009)

Preparation and characterization of paeonol loaded brushite calcium phosphate cement

Li Xiao-yu^{1, 2}, Li Guang-da², Zhao San-tuan³, Li Yong-kai², Zhao Peng-chao², Peng Huan²

¹Central Lab, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; ²College of Medical Technology and Engineering, ³College of Material Science and Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan Province, China

Received:2017-11-23 Online:2018-04-08 Published:2018-04-08
Contact: Li Guang-da, Ph.D., Associate professor, Master’s supervisor, College of Medical Technology and Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan Province, China
About author:Li Xiao-yu, Master, Central Lab, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China College of Medical; Technology and Engineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81402225, 21461009

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

透钙磷石骨水泥：Mirtchi和Lemaitre于1989年发明，为磷酸钙水泥浆体的pH值低于4.2时产生。通常由水、磷酸二氢钙和β-磷酸三钙混合制备。透钙磷石骨水泥具有比其他磷酸钙基骨水泥更好的生物相容性，并能在生理条件下被机体较快吸收，但机械性能会有所降低，并且固化时间过快，可注射性差，不利于临床操作。

丹皮酚：中药丹皮和徐长卿草的主要活性成分，白色或微黄色的有光泽针状结晶，气味微辣，在紫外光区波长274 nm处有强吸收峰。丹皮酚具有镇痛、消炎、抗过敏、抗菌、调节免疫力等多种药理活性。临床常用于治疗风湿痛、胃痛、湿疹、过敏性皮炎等，具有较好疗效。近期研究表明丹皮酚还能促进软骨修复，消除骨折肿胀，缩短骨折愈合期。

背景：丹皮酚是传统骨科良药的活性成分，镇痛消肿，可促进受伤骨组织愈合。透钙磷石骨水泥生物相容性好，且可在体内完全降解，大量研究关注改性以使其更适合临床应用。

目的：在透钙磷石骨水泥中负载丹皮酚，制备丹皮酚/透钙磷石骨水泥可注射支架材料，研究丹皮酚的加入对骨水泥固化时间、可注射性、抗压强度、缓释性能、抗菌性能及细胞亲和性能的影响。

方法：以硝酸钙和磷酸氢二铵为原料湿法制备磷酸三钙，并1 000 ℃煅烧成β-磷酸三钙；将壳聚糖溶解于柠檬酸溶液制备固化液；将β-磷酸三钙、磷酸二氢钙和丹皮酚的混合粉末与固化液均匀调拌制备透钙磷石骨水泥。测试骨水泥的固化时间、可注射性、理化结构、抗溃散性、抗压强度、降解性能、药物缓释性能、抗菌性能和细胞亲和性。

结果与结论：随丹皮酚含量增加，骨水泥固化时间延长，均在12-17 min之间，但抗溃散性、可注射性、抗压强度和晶相与基团组成均不受显著影响；材料降解性增强，药物释放浓度增加。抑菌圈实验结果显示，复合骨水泥对大肠杆菌生长具有一定抑制作用，但对金黄色葡萄球菌不敏感。将HepG2细胞悬液滴加于材料表面并培养3 d后，通过扫描电镜可清晰观察到细胞伸出伪足，并能够在材料上黏附生长。

ORCID: 0000-0002-7862-4441(李光大)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 透钙磷石骨水泥, 丹皮酚, 可注射性, 抗溃散性, 药物缓释, 抗菌性能, 细胞亲和性, 骨生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Paeonol is an active ingredient of traditional orthopedic drugs, exhibiting pain easing, detumescence and promotion of bone healing. The brushite calcium phosphate cement possesses good biocompatibility, which can be completely degraded in the body. A large number of studies have addressed the modification of brushite calcium phosphate cement to make it more suitable for clinical applications.

OBJECTIVE: To study the setting time, syringeability, compressive strength, drug delivery ability, antibacterial property and cell affinity of brushite calcium phosphate cement with the addition of paeonol.

METHODS: The tricalcium phosphate was synthesized by calcium nitrate and diammonium hydrogen phosphate, followed by being calcined into β-tricalcium phosphate at 1 000 ℃. Chitosan was dissolved in citric acid solution to prepare the liquid phase. The composite bone cement was prepared by mixing paeonol, β-tricalcium phosphate and monocalcium phosphate with the liquid phase. The setting time, syringeability, phase composition, anti-collapsibility, compressive strength, degradation property, drug delivery ability, antibacterial property and cell affinity of the composite bone cement in vitro were evaluated.

RESULTS AND CONCLUSION: The setting time of bone cement was 12-17 minutes, which was prolonged with the increase of paeonol release. Moreover, the loaded paeonol showed no significant effect on the phase composition, syringeability, anti-collapsibility, and compressive strength of the compound. However, the degradation rate and drug release content were significantly enhanced with the increase of paeonol release. The inhibition zone experiments showed that the paeonol loaded cement inhibited the growth of Escherichia coli, but was not sensitive to Staphylococcus aureus. HepG2 cells could adhere and proliferate on the material surface after 3 days co-culture, with clear cell pseudopodia arising from the cell surface under the scanning electron microscope.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Paeonol, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李晓玉，李光大，赵三团，李永凯，赵朋超，彭欢. 载丹皮酚透钙磷石骨水泥的制备与表征[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(10): 1499-1505.

Li Xiao-yu, Li Guang-da, Zhao San-tuan, Li Yong-kai, Zhao Peng-chao, Peng Huan. Preparation and characterization of paeonol loaded brushite calcium phosphate cement[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(10): 1499-1505.

图/表（结果） 10

2.1 复合骨水泥的固化时间、可注射系数和物相组成图1为骨水泥固化时间及可注射系数，从中可见，随丹皮酚含量增加，骨水泥固化时间延长，从0%试样的13 min延长到5%试样的17 min，但均在20 min以内，符合临床使用要求^[24]。骨水泥的可注射系数均在95%左右，可见加入丹皮酚未对骨水泥可注射性造成显著影响。透钙磷石骨水泥固相粉末在水化时会发生如下化学反应生成透钙磷石^[13]：

在试样的X射线衍射仪谱图中，在2θ约12°、21°、29.2°、30.5°、34.1°和34.4°等处观察到透钙磷石(PDF#09-0077)典型的强衍射峰，说明骨水泥反应充分，丹皮酚的加入未对材料晶相产生显著影响(图2)。各试样的红外测试结果相似，均在3 540，3 485 cm^-1和3 289，3 165 cm^-1处出现结晶水O-H的吸收峰，在1 651 cm^-1处出现H-O-H的吸收峰，并在1 140，1 066和990 cm^-1处观察到PO₄基团的吸收峰^[25](图3)。

从图4可以看出，各试样超微结构存在明显差异。未加入丹皮酚的样品表面为纵横交错的片状结晶，大小均匀，由于表面应力取向及视觉原因，呈针状。随着丹皮酚含量增加，结晶体逐渐变大、增厚，且形态不规则。

2.2 复合骨水泥的抗溃散性能与抗压强度图5为各试样通过针管直接注射入37 ℃的Ringer’s模拟体液，并振荡10 min后的情况。结果显示，各培养皿中模拟液均保持清澈，未观察到试样周围溃散痕迹，说明丹皮酚掺入未对骨水泥抗溃散性能造成明显影响。

骨水泥植入后，代替骨组织行使功能，须具有一定力学强度。图6为各骨水泥的抗压强度。1%丹皮酚掺入时可以将骨水泥的抗压强度从约25 MPa提高到约27 MPa，但掺入量为3%和5%时影响则不明显。

2.3 复合骨水泥的可降解性能及药物缓释性能骨水泥材料在植入体内后，需要最终全部降解并且降解速率与骨组织新生速率相匹配，而透钙磷石骨水泥可以在体内全部降解^[26]。图7为骨水泥试样浸泡7 d和14 d后的失重率。浸泡7 d的试样失重率从0%试样的2.51%增加到5%试样的7.56%，而浸泡14 d的试样的失重率从0%试样的7.71%增加到5%试样的12.77%。

随着骨水泥试样中丹皮酚含量的增加，试样的降解速度加快，并且浸泡14 d的试样的失重率明显高于7 d组。

图8为骨水泥中丹皮酚的单日释放量拟合曲线，可见载丹皮酚透钙磷石骨水泥样品浸泡入介质溶液后，溶液中药物浓度逐渐上升，第3天时，丹皮酚单日释放量达到峰值，而后药物溶出逐渐稳定。

2.4 复合骨水泥的抗菌性能表征与细胞亲和性能从图9可看出，在培养18 h后，不负载丹皮酚的骨水泥对大肠杆菌和金色葡萄球菌的生长都不具有抑制作用。而随着丹皮酚含量的增加，骨水泥对大肠杆菌的抑制作用逐渐加强，1%、3%和5%试样的抑菌圈大小分别提高到约6 mm、8 mm和 10 mm。但各试样对金色葡萄球菌却未显示出抑制生长能力。

图10为材料与细胞复合培养3 d后的材料表面微观形貌，可见在浸泡入培养基中一段时间后，各骨水泥试样的表面形貌发生了显著变化，由以前的紧密排列片状晶粒转换成了许多疏松的细小球状颗粒。众所周知，透钙磷石骨水泥降解速度较快，细胞在其上黏附性差，较难在体外观察到材料上有细胞黏附，但实验中在材料与细胞共同培养3 d后可见细胞在各材料表面的黏附。

参考文献

[1]Sarkar SK, Lee BY, Padalhin AR, et al. Brushite-based calcium phosphate cement with multichannel hydroxyapatite granule loading for improved bone regeneration. J Biomater Appl. 2016;30(6):823-837.

[2]Saleh AT, Ling LS, Hussain R. Injectable magnesium-doped brushite cement for controlled drug release application. J Mater Sci. 2016;51(16):7427-7439.

[3]白波,吴显培,卢伟杰,等.新型可注射可降解磷酸钙骨水泥的生物相容性的实验研究[J].广州医学院学报,2006,34(1):21-25.

[4]张慧勇.磷酸钙骨水泥制备方法的改进及其性能研究[J].化工科技,2015,23(6):48-52.

[5]耿帅,赵育林,曾凯,等.丹皮酚的研究进展[J].中国新药与临床杂志,2016,35(5):310-313.

[6]高立民,满其倩.丹皮酚抗肿瘤作用及作用机制研究进展[J].药物评价研究,2016,39(2):296-299.

[7]姚瑶,冯伟红,王岚,等.活血止痛纳米凝胶贴膏经皮渗透特性及药效评价[J].中国中医药信息杂志,2017,24(2):70-75.

[8]邢佰颖,朱明珠,郑浩,等.丹皮酚主要药理研究进展[J].科研,2016(11):00223.

[9]吴琪,胡华,熊昌源.丹皮酚关节内注射对关节软骨影响的实验研究[J].湖北中医药大学学报,2013,15(2):18-20.

[10]刘春云,武廷章,周大喜,等.丹皮酚抗菌作用的研究[J].生物学杂志,2000,17(3):23-24.

[11]吴琪,任婕.丹皮酚对兔膝关节软骨细胞凋亡及相关基因的影响[J].湖北中医药大学学报,2016,18(2):11-14.

[12]吴琪,何敢想,胡燕芬,等.丹皮酚致兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Bax mRNA表达的时间与剂量效应研究[J].中国药房,2016,27(10):1337-1340.

[13]Pina S, Olhero SM, Gheduzzi S, et al. Influence of setting liquid composition and liquid-to-powder ratio on properties of a Mg-substituted calcium phosphate cement. Acta Biomater. 2009;5(4):1233-1240.

[14]李光大,常乔婉,赵三团,等.纳米Fe3O4对透钙磷石骨水泥的理化性能影响研究[J].功能材料,2013,44(16):2379-2383.

[15]Han B, Ma PW, Zhang LL, et al. beta-TCP/MCPM-based premixed calcium phosphate cements. Acta Biomater. 2009; 5(8):3165-3177.

[16]Loca D, Sokolova M, Locs J, et al. Calcium phosphate bone cements for local vancomycin delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2015;49:106-113.

[17]Gao CX, Liu HL, Yang HL, et al. Fabrication and Characterization of Injectable Calcium Phosphate-based Cements for Kyphoplasty. Mater Technol. 2016:1-8.

[18]Bohner M, Merkle HP, Landuyt PV, et al. Effect of several additives and their admixtures on the physico-chemical properties of a calcium phosphate cement. J Mater Sci Mater Med. 2000;11(2):111-116.

[19]Laurentin A, Edwards CA. A microtiter modification of the anthrone-sulfuric acid colorimetric assay for glucose-based carbohydrates. Anal Biochem. 2003;315(1):143-145.

[20]Vlad MD, del Valle LJ, Poeata I, et al. Injectable iron-modified apatitic bone cement intended for kyphoplasty: cytocompatibility study. J Mater Sci Mater Med. 2008;19(12): 3575-3583.

[21]吴爱武.临床微生物学与检验[M].3版.北京:人民卫生出版社, 2011:88-96.

[22]Montesi M, Panseri S, Dapporto M, et al. Sr-substituted bone cements direct mesenchymal stem cells, osteoblasts and osteoclasts fate. PLoS One. 2017;12(2):e0172100.

[23]Mestres G, Abdolhosseini M, Bowles W, et al. Antimicrobial properties and dentin bonding strength of magnesium phosphate cements. Acta Biomater. 2013;9(9):8384-8393.

[24]Ginebra MP, Fernández E, De Maeyer EA, et al. Setting reaction and hardening of an apatitic calcium phosphate cement. J Dent Res. 1997;76(4):905-912.

[25]Cama G, Barberis F, Botter R, et al. Preparation and properties of macroporous brushite bone cements. Acta Biomater. 2009;5(6):2161-2168.

[26]Engstrand J, Persson C, Engqvist H. The effect of composition on mechanical properties of brushite cements. J Mech Behav Biomed Mater. 2014;29:81-90.

[27]高昊辰,吴鉴今,曹志中.磷酸钙骨水泥生物学特性及在口腔学应用中的研究进展[J].医学研究生学报,2015,28(8):880-884.

[28]陈威,吴清平,张菊梅,等.壳聚糖抑菌机制的初步研究[J].微生物学报,2008,48(2):164-168.

[29]卢亢,陈泽楚,李婷,等.壳聚糖的制备及其抑菌性能的研究[J].离子交换与吸附,2015,31(2):178-186.

[30]刘晶,胡杨,沈玉凤,等.壳聚糖与海藻酸钙双相陶瓷骨支架的机械性能及细胞相容性[J].中国组织工程研究,2016,20(8):

1104-1110.

[31]杨迪诚,钟建,刘涛,等.透钙磷石骨水泥制备及其载药性能[J].中国组织工程研究,2015,19(3):427-433.

[32]Tamimi F, Sheikh Z, Barralet J. Dicalcium phosphate cements: brushite and monetite. Acta Biomater. 2012;8(2):474-487.

[33]Kawashita M, Kawamura K, Li Z. PMMA-based bone cements containing magnetite particles for the hyperthermia of cancer. Acta Biomater. 2010;6(8):3187-3192.

[34]Wu F, Wei J, Guo H, et al. Self-setting bioactive calcium-magnesium phosphate cement with high strength and degradability for bone regeneration. Acta Biomater. 2008; 4(6):1873-1884.

[35]司南,王宏洁,边宝林.六味地黄处方饮片和不同粉碎条件下微粉水提物中丹皮酚含量的比较[J].中国实验方剂学杂志,2005, 11(6):28-29.

[36]蒋丽丽,张彦龙,王春杰,等.牡丹皮中有效成分丹皮酚的药理活性研究进展[J].现代诊断与治疗,2016,27(22):4223-4224.

[37]刘强,刘文彬,张玉芳,等.丹皮酚的酮基衍生物及其药理活性研究进展[J].湖南中医药大学学报,2015,35(2):56-59.

[38]肖坚,毛兆光,朱慧华,等.抗生素骨水泥联合外固定支架在下肢开放性骨折骨缺损中的早期应用[J].中国骨伤,2017,30(3):

270-273.

[39]胡必军,黄志明,熊涛.手术治疗胫骨平台骨折27例临床分析[J].检验医学与临床,2015,12(z2):180-182.

[40]李涛,史占军,王健,等.两种抗生素复合骨水泥的材料学性能及抗菌活性研究[J].中华关节外科杂志:电子版,2016,10(4):407-412.

[41]宋丹.丹皮酚体外抑菌作用研究[J].医药导报,2012,31(9): 1135-1137.

引言

材料方法

1.1 设计材料学研究。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2017年4月在河南科技大学医学技术与工程学院实验室完成。

1.3 材料丹皮酚(含量≥99.8%)购自四川博兴化工有限公司；Ca(NO₃)₂·4H₂O(分析纯)购自天津市大茂化学试剂厂；(NH₄)₂HPO₄(分析纯)购自天津市博迪化工股份有限公司；Ca(H₂PO₄)₂·H₂O(分析纯)购自天津市标准科技有限公司；C₆H₈O₇·H₂O(分析纯)购自烟台市双双化工有限公司；壳聚糖(脱乙酰度大于90%)购自上海展云化工有限公司；万能力学试验机(AGX-1000)购自Shimadzu公司；X射线衍射仪购自Panalytical公司；红外光谱仪(Nicolet IS5)购自Thermofisher公司；扫描电子显微镜购自Tescan公司；紫外可见分光光度计(TU-1901)购自北京普析通用仪器有限责任公司；细胞培养箱中(热电3111)购自Thermofisher公司。

1.4 方法

1.4.1 β-磷酸三钙的制备将Ca(NO₃)₂·4H₂O和(NH₄)₂HPO₄按摩尔量1.5∶1分别配置成浓度为0.1 mol/L的溶液，在充分搅拌的条件下，将Ca(NO₃)₂·4H₂O溶液逐滴加入到(NH₄)₂HPO₄溶液中，用氨水调节溶液pH值至7.0-8.0之间，反应4 h后40 ℃水浴陈化36 h，抽滤后烘干研磨，过200目筛，于硅钼炉(1 600 ℃，洛阳恒立窑炉有限公司)中1 000 ℃ 煅烧2 h成β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate，β-TCP)^[13]，过筛200目，密封保存。

1.4.2 磷酸钙骨水泥固相粉体及固化液配制称取相等物质的量的β-磷酸三钙和Ca(H₂PO₄)₂·H₂O(过筛200目)，混合研磨，制成骨水泥基质固相粉体，按丹皮酚占总质量分数为1%、3%和5%的比例，将丹皮酚与骨水泥基质粉体混合，研磨均匀，作为复合骨水泥固相粉体。在0.5 mol/L的柠檬酸溶液中加入质量分数1%的壳聚糖配制成固化液。为便于后续标识及描述，将基质中丹皮酚含量分别为0%，1%，3%和5%的试样分别命名为0%，1%，3%和5%。

1.4.3 骨水泥浆体的制备按照固液比例为3 g/mL的比例，将固化液与复合骨水泥固相粉末均匀混合，调拌50 s后制成复合骨水泥浆体^[¹⁴^]。

1.4.4 固化时间及可注射性测定运用类似吉尔摩针压痕法来测定各骨水泥试样的固化时间^[15]，实验重复5次。取规格为2 mL的注射器，质量记为m₀，将骨水泥浆体填入注射器中，此时注射器总质量记为m₁，2 min后以150 mm/min的恒定速率挤出上述浆体，直到所用推力大于200 N时停止，称量此时注射器的质量为m₂，实验重复5次。样品的可注射系数(injection coefficient，IC)可以通过下式求出^[16]：

1.4.5 抗溃散性实验将适量的骨水泥浆体填充到5 mL注射器中，在3 min内注入37 ℃的Ringer’s模拟液(自制)中，120 r/min振荡10 min，观察溶液是否澄清，材料是否有溃散，并用数码相机拍照^[17]。

1.4.6 抗压强度测定将骨水泥浆体填入Φ10 mm×5 mm的模具中，0.5 h后取出，置于37 ℃水浴锅中养护72 h，利用万能力学试验机进行测试，载荷900 N，加压速度为 1 mm/min^[18]，计算抗压强度。各组分骨水泥均采用5个平行样，计算结果取平均值。

1.4.7 降解性能测试将骨水泥制成大小为Φ19 mm× 2 mm的圆柱体，称其质量为m₁，按照固液比为1 g/50 mL的比例，将试样置于37 ℃的Ringer’s模拟液中，振荡7 d和14 d后取出置于37 ℃烘干，称其质量为m₂。材料的可降解性能使用材料浸泡前后的失重率(weight loss ratio，L)表示^[15]，即：

1.4.8 骨水泥物相及微观形貌检测将固化后的试样分别用玛瑙研钵研磨粉碎，使用X射线衍射仪来检测空白试样和5%试样，测试条件为：Cu靶K_ɑ，入射波长为0.154 nm，扫描步长0.06 (°)/s，扫描角度5°-80°。采用溴化钾压片法^[¹⁴^]，运用红外光谱仪检测试样基团组成。将固化后各试样黏附于贴有导电胶的铜台上，表面喷金后采用扫描电子显微镜观察材料的微观形貌。

1.4.9 丹皮酚的体外释放测定用纯丹皮酚配置浓度为17.6 mg/L的标准母液(环境温度35 ℃，丹皮酚溶于温水)，稀释成2.9、4.4、5.0、7.0、8.8、9.9等不同倍数后，用紫外可见分光光度计于275 nm波长测定其吸光度值，回归处理后得到回归方程为Abs=0.079 35(C)−0.000 43(相关性R=0.999 0)，平均回收率在98.96%-102.82%之间。

将骨水泥浆体制成大小为Φ19 mm×2 mm的圆片，用Ringer’s模拟液作为介质，按照固液比为1 g/50 mL的比例，将试样悬吊于37 ℃的Ringer’s模拟液中，振荡。每间隔24 h取各材料的浸泡液5 mL，并加回等量Ringer’s模拟液。将取出的浸泡液稀释后于275 nm处测其吸光度值，通过回归方程计算丹皮酚浓度，进而得药物释放曲线^[19]。每组3个平行样。

1.4.10 骨水泥抗菌性能检测将骨水泥浆体制成 Φ5 mm×2 mm的圆柱体，参照文献[20]的方法进行灭菌。购自ATCC的大肠杆菌(35218)和金黄色葡萄球菌(25923)作为菌种，采用平板抑菌圈法测试各试样的抑菌性能^[21-23]。实验重复3次。

1.4.11 细胞亲和性实验将1.4.10中制备的无菌试样浸泡到培养基中，3 d后更换新的培养基，然后将购自ATCC的HepG2细胞按1×10⁷L^-1的细胞浓度接种到材料表面，置于细胞培养箱中培养3 d后(每天换液)，100 g/L多聚甲醛固定过夜，体积分数30%-100%乙醇梯度脱水，乙腈干燥，使用扫描电镜观测材料表面细胞的生长情况^[²²^]。

1.5 主要观察指标负载丹皮酚的透钙磷石骨水泥的固化时间、可注射系数、抗溃散性能、抗压强度、降解性能、物相结构及基团组成、丹皮酚体外释放性能、抗菌性能和细胞亲和性。

1.6 统计学分析运用Origin 9.0(Origin Lab公司)进行作图，采用SPSS 22.0(IBM公司)进行数据分析，统计学数据以x(_)±s形式表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

透钙磷石骨水泥体系中，当固化液为柠檬酸时，骨水泥的固化时间只有4 min左右，而可注射系数约为33%，不利于临床操作^[²⁷^]，当固化液中加入壳聚糖后，透钙磷石骨水泥的固化时间被明显延长，约为13 min，可注射系数为95%。实验所用固化液中加入了壳聚糖，壳聚糖分子链上存在着-OH，-NH₂，-O-等基团，分子间存在氢键^[^28-30^]，会吸附在新生成的透钙磷石表面和新相的晶胚上，致使其稳定，阻止透钙磷石晶体结构的形成和生长，减缓凝胶物质的水化和硬化过程^[31]。另外，实验负载的药物会填充在固体颗粒之间，从而延长固化时间，各掺丹皮酚试样的固化时间均大于10 min，可注射系数在95%左右，可实现临床微创注射治疗^[32]。另外，骨水泥中丹皮酚掺入前后的X射线衍射和红外光谱图像均无明显区别，均能看到明显的透钙磷石特征基团，丹皮酚的掺入未对透钙磷石骨水泥基团组成造成显著影响。

丹皮酚不溶于冷水，在骨水泥水化过程中在晶体间形成位阻，同时丹皮酚分子中的-OH、-CO-等活性基团，亦有可能会与基质或者固化液等发生反应，延缓骨水泥水化进程，从而使水化反应更充分，结晶体增大、变厚。抗溃散性是骨水泥在血液、水或水溶液的静水压力下抗渗防溃散的能力^[7]。良好的抗溃散性可使骨水泥在固化前后的短时间内，经受住液体的浸润、冲洗而不稀散，提升疗效。壳聚糖的水溶液黏稠度高，与柠檬酸同时存在时，由于柠檬酸的交联作用，黏稠度会进一步提高，从而增强了试样的抗水能力^[33]。

骨水泥中掺入的丹皮酚弥散分布于骨水泥基质中，发挥充填作用，提高了试样的抗压强度^[34]，随着丹皮酚掺入量的增加，会在晶体间形成团聚、位阻等，且丹皮酚吸附固化液中的水，减弱骨水泥水化过程，使抗压强度降低^[³⁵^]。所以，从目前实验结果来看，载丹皮酚透钙磷石骨水泥存在一个抗压强度的极值，且在丹皮酚掺入量约为1%时取得。实验中各骨水泥试样的抗压强度均在25 MPa左右，满足临床上松质骨修复需求^[7]。

从试样的失重率和药物单日释放曲线可以明显看出，该复合骨水泥具有良好的降解能力和药物释放性能。试样中丹皮酚的掺入对骨水泥网络结构造成一定影响，加快试样的降解，并且随着降解速率的加快，药物的溶出也增加，反过来进一步促进材料降解。在浸泡第3天后丹皮酚的单日释放量达到峰值，而后药物溶出逐渐稳定，说明将丹皮酚负载在骨水泥上能实现丹皮酚的长期释放。

研究表明，丹皮酚是一款独特的植物抗菌剂，既能增强机体的免疫功能，同时又对革兰阴性菌、阳性菌和多种真菌具有抑制作用^[³⁶^-³⁷^]。植骨手术是一个创伤过程，通常在术后需要辅以大剂量的抗生素以防感染^[^38-40^]。宋丹等^[41]的研究表明，丹皮酚对大肠杆菌和金色葡萄球菌的体外最低抑菌浓度均约为62.5 mg/mL，且丹皮酚对金色葡萄球菌的敏感性更强。药物释放曲线结果表明，将丹皮酚负载到骨水泥上后，药物的释放浓度远远未能达到62.5 mg/mL的浓度。但抑菌实验结果则显示将丹皮酚加入到透钙磷石骨水泥中达到3%和5%后，材料对大肠杆菌的生长出现抑制作用，但对金色葡萄球菌却仍然不敏感。可能由于透钙磷石骨水泥的降解环境略微偏酸性，同时骨水泥体系还会释放出钙磷离子，形成新的微环境，从而增强了丹皮酚对大肠杆菌的敏感性，致使在丹皮酚浓度很低的情况下即对大肠杆菌的生长起到了抑制作用。而由于丹皮酚含量达到5%后骨水泥的抗压强度呈现下降趋势，且降解速率快速增加，14 d的失重率已经达高达13%。而众所周知，材料过快的降解速率将不利于细胞黏附，所以实验未将丹皮酚的含量进一步提高，以提高其释放率。但在复合骨水泥试样与HepG2细胞复合培养3 d后，在丹皮酚含量为5%的材料上也观察到了细胞的黏附，在未来的研究中可以尝试寻找更加合适的方法，既提高丹皮酚含量，增加丹皮酚的释放率，又控制住骨水泥的降解速率，使细胞能黏附的同时进一步研究其抗菌性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

载丹皮酚透钙磷石骨水泥的制备与表征

Preparation and characterization of paeonol loaded brushite calcium phosphate cement

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[1]	甘丽莉, 熊娜, 刘燕飞. 水凝胶药物支架修复皮肤创面：临床应用可能性的挑战[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3578-3583.
[2]	张利兴, 田昂, 李锡, 白希壮. TiO₂纳米管/羟基磷灰石载万古霉素涂层的释药性及生物毒性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1500-1506.
[3]	邢玉莹, 贺玉迎, 蒋宁宁, 朱瑞杰, 何冉, 齐阳坤, 王珂静, 李光大. 可注射载钽透钙磷石制备及其显影增强性能[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(34): 5552-5558.
[4]	王乐, 惠敏, 董西玲, 周晗, 董洪亮, 张晓明, 刘童斌. 缓释阿托伐他汀钙纳米纤维支架对细胞黏附增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4492-4497.
[5]	邱皓, 陈诗谋, 翁政, 朱云, 刘盾, 陈渝. 富血小板血浆干预膝关节骨性关节炎模型兔关节软骨和滑膜的改变[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(14): 2205-2210.
[6]	罗旭江, 鲜海, 彭礼庆, 沈师, 张彬, 高超, 王振勇, 眭翔, 黄靖香, 韩刚, 刘舒云, 郭全义, 鲁晓波. 超临界二氧化碳萃取的猪松质骨[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(10): 1508-1514.
[7]	黄群，盛晓磊，严飞，周志平，朱现玮. Quadrant通道下经椎间孔微创置入椎体间融合器治疗腰椎退行性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(36): 5818-5823.
[8]	刁兆峰，李晓亮，艾力麦尔旦•艾尼瓦尔，林成，周梅，潘晓玲，李鹏. 上颌窦提升中羟基磷灰石/β-磷酸三钙/壳聚糖/甲基纤维素组织工程骨的成骨效应[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(22): 3456-3462.
[9]	路文超，王宇鹏，湛川. 椎体后凸成形治疗Kummell病过程中发生的骨水泥渗漏[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(2): 172-177.
[10]	张磊，张杭州，Allieu Kamara. 钛铜合金纳米管形貌能够降低细菌活性并促进成骨细胞功能[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(2): 165-171.
[11]	高山，周方，吕扬，袁亮，李爱玲，邱东. 新型多孔聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的制备及性能分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(2): 204-210.
[12]	薛鹏，杜斌，王礼宁，曹良权，孙光权，刘锌，于恒恒. 可控释淫羊藿苷-β-磷酸三钙复合支架的制备[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(6): 865-870.
[13]	杨犇，何东宁，秦博恒，张保平. 载锌功能化多壁碳纳米管/壳聚糖复合支架的制备与性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(6): 889-895.
[14]	李志君，慈元，郑玉鹏，张光宇. 聚对苯二甲酸乙二醇酯囊袋加压椎体后凸成形治疗Kummell病[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(34): 5433-5438.
[15]	李季，赵维彪，何子微，李毅. 经皮穿刺椎体成形同期与非同期联合唑来膦酸治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的1年随访比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(30): 4788-4793.