两种状态脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的对比研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0470

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1395-1401.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0470

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

两种状态脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的对比研究

韩小改，李建斌，单泓，别立莉，王娇杰，刘英，戚正

河南省红十字血液中心成分室，河南省郑州市 450012

修回日期:2017-10-24 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 李建斌，硕士，主任医师，河南省红十字血液中心，河南省郑州市 450012
作者简介:韩小改，女，1981年生，河南省南阳市人，汉族，2008年新乡医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事间充质干细胞与中枢神经系统损伤疾病研究。
基金资助:
河南省科技攻关项目(201204120)

Transplantation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells at two states: comparison of neurological function recovery in cerebral infarction rats

Han Xiao-gai, Li Jian-bin, Shan Hong, Bie Li-li, Wang Jiao-jie, Liu Ying, Qi Zheng

Department of Blood Composition, Henan Red Cross Blood Center, Zhengzhou 450012, Henan Province, China

Revised:2017-10-24 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Li Jian-bin, Master, Chief physician, Department of Blood Composition, Henan Red Cross Blood Center, Zhengzhou 450012, Henan Province, China
About author:Han Xiao-gai, Master, Attending physician, Department of Blood Composition, Henan Red Cross Blood Center, Zhengzhou 450012, Henan Province, China
Supported by:
the Science and Technology Tackle Key Project of Henan Province, No. 201204120

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
间充质干细胞：作为一种多潜能干细胞，主要存在于脐血和骨髓中，在一定的条件下可分化为血管内皮祖细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞等，其“局部专一诱导性分化”现象为成体干细胞开辟了新的临床应用适应证。
局部专一诱导性分化：成体干细胞到达受损伤的部位后，在微环境下会使干细胞向损伤组织修复所需的组织细胞分化，从而促进损伤组织的修复，这种现象被称为局部专一诱导性分化。实验正是利用了间充质干细胞的这一特性，将脐血间充质干细胞输入脑梗大鼠体内，使大鼠脑梗部位炎症反应减轻，血供增加，受损伤细胞恢复功能，从而改善神经功能。

摘要
背景：脐血间充质干细胞对缺血缺氧引起的神经细胞损伤具有修复作用，而原代分离的和经过诱导分化的细胞，何种状态的治疗效果好未有定论。
目的：比较原代分离的和经过培养诱导分化的2种状态脐血间充质干细胞对大鼠脑梗死模型治疗效果。
方法：①取足月分娩的胎儿脐血，经四联袋梯度密度离心法分离脐血间充质干细胞；②通过含有碱性成纤维生长因子的培养基诱导分化脐血间充质干细胞；③将60只大鼠随机等分为4组：假手术组、模型组、原代细胞治疗组及诱导分化细胞治疗组，后3组建立脑梗死模型。原代细胞治疗组及诱导分化细胞治疗组分别在造模后7 d通过尾静脉注射原代分离的和经过培养诱导分化的2种状态脐血间充质干细胞。
结果与结论：移植原代分离的和经过培养诱导分化的2种状态脐血间充质干细胞的脑梗死模型大鼠平衡、行走、空间定位和学习记忆能力得到明显改善，且其中与原代分离的脐血间充质干细胞治疗的大鼠相比，经诱导分化的脐血间充质干细胞治疗的大鼠脑梗死体积接近，脑组织病理损伤改善更为明显，脑组织中CD34、Ki-67阳性细胞数量较高，神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量较低，脑组织中炎症因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子β表达减少，而白细胞介素6表达水平接近。说明经过培养诱导分化的脐血间充质干细胞对脑梗死模型大鼠神经功能的治疗效果更佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2371-3594(李建斌)

关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 脑梗死, 水迷宫, 平衡试验, 细胞治疗, 脐血间充质干细胞, 脑梗死模型

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) can repair the injury of nerve cells caused by ischemia and hypoxia, but which state of cells has a better therapeutic efficacy, primary isolation or induced differentiation is not yet known.
OBJECTIVE: To compare the therapeutic effects of hUC-MSCs primary cultured and differentiated in a rat model of cerebral infarction.
METHODS: After full-term delivery, fetal umbilical cord blood samples were obtained using quadruple bags by means of density gradient centrifugation. hUC-MSCS were induced in the medium containing basic fibroblast growth factor. Sixty rats were equivalently randomized into four groups: sham, model, primary culture and induced differentiation groups. Animal models of cerebral infarction were made in the rats in the latter three groups. Model rats in the primary culture and induced differentiation groups were subjected to tail vein transplantation of hUC-MSCs that were primary cultured or induced to differentiate in vitro at 7 days after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: A marked improvement in balance, walking, spatial orientation, and learning and memory abilities was found in the rats after transplantation of hUC-MSCs that were primary cultured or induced to differentiate. Moreover, compared with the primary culture group, a significant improvement was found in the induced differentiation group, including improved pathological injury of the brain, higher expression of CD34 and Ki-67, lower expression of glial fibrillary acidic protein, lower expression of interleukin 1β and tumor necrosis factor β. Compared with the primary culture group, similar infarction size and expression of interleukin-6 were also found in the induced differentiation group. These findings indicate that hUC-MSCs with induced differentiation exhibit better therapeutic outcomes in the recovery of neurological function of cerebral infarction rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cord Blood Stem Cell Transplantation, Infarction, Middle Cerebral Artery, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.

韩小改，李建斌，单泓，别立莉，王娇杰，刘英，戚正. 两种状态脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的对比研究[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1395-1401.

Han Xiao-gai, Li Jian-bin, Shan Hong, Bie Li-li, Wang Jiao-jie, Liu Ying, Qi Zheng. Transplantation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells at two states: comparison of neurological function recovery in cerebral infarction rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1395-1401.

图/表（结果） 3

2.1 脐血间充质干细胞诱导培养后鉴定 细胞培养1周后，大多数细胞形态发生明显变化，细胞核大，收缩呈典型的核周体形态(图1A)，2周后转变为类神经元形态，出现双极及复杂的多极细胞(图1B)，3周后突起末端出现一、二级分支，类似于树突形成纤维网状(图1C，D)。脐血间充质干细胞形成小的克隆团，细胞可见核仁，胞浆丰富，细胞呈纤维样形态，贴壁的细胞呈圆形和长梭形，培养细胞生长可达75%-90%融合，有的可呈克隆团样生长。原代细胞呈神经标志物Nestin、神经元特异烯醇化酶、神经胶质纤维酸性蛋白mRNA低表达。经诱导分化后呈现Nestin、神经元特异烯醇化酶、神经胶质纤维酸性蛋白mRNA高表达，2种细胞的表达水平差异有显著性(P < 0.05，图1)。

2.2 实验动物数量分析 各组大鼠均出现由于伤口感染、营养不良等问题导致的死亡，各组均补齐大鼠数量。

2.3 动物模型的鉴定结果 MRI结果显示正常大鼠脑实质未见明显异常信号。而脑梗死大鼠右侧额叶可见条片状T1略低T2高信号影，右侧顶叶白质可见班点状T1等T2高信号影，中线结构居中，脑室系统略扩张，表明大鼠脑梗死缺血灶形成，造模成功(图2)。

2.4 行为学结果

2.4.1 平衡木和平衡木行走实验 细胞移植前大鼠在平衡木上站立不稳，晃动，跌落，细胞移植后诱导分化细胞治疗组大鼠在平衡木上的时间增加，从第7天的3 s逐渐增加到第60天的50 s，从细胞移植后第14天开始，诱导分化细胞治疗组大鼠在平衡木上的时间比原代细胞治疗组明显增加。各组大鼠平衡木实验结果差异有显著性意义(F=40.13，P < 0.01)，其中脑梗死组大鼠平衡时间明显低于假手术组(P < 0.05)；采用原代细胞和诱导细胞治疗后，平衡功能得到改善(P < 0.05)；且诱导分化细胞治疗组平衡功能比原代细胞治疗组显著(P < 0.05；图3A)。

各组平衡木行走实验结果差异有显著性意义(F=35.56，P < 0.01)，其中脑梗死组大鼠平衡木行走花费时间明显长于假手术组(P < 0.05)；采用原代细胞和诱导细胞治疗后，行走能力得到改善(P < 0.05)；且诱导分化细胞治疗组改善比原代细胞治疗组显著(P < 0.05；图3B)。

2.4.2 水迷宫实验 定位巡航试验10-14 d时，各组大鼠寻找到平台的潜伏期逐渐缩短，且诱导分化细胞治疗组大鼠潜伏期小于原代细胞治疗组(P < 0.05)。54-58 d时的结果与早期相一致，说明诱导分化细胞治疗能够明显改善大鼠的学习能力(图4A，B)。

空间探索试验14，60 d时，各组大鼠在目标象限探索的时间百分比差异有显著性意义(F=26.30，P < 0.01；F=10.06，P < 0.01)(图4C)。其中14，60 d时脑梗死组、原代细胞治疗组和诱导分化细胞治疗组大鼠在目标象限探索的时间百分比明显少于假手术组(F=6.50，P < 0.05； F =12.39，P < 0.05)；且3组大鼠在目标象限探索的时间百分比在14 d时接近(P > 0.05)，60 d时诱导分化细胞治疗组大鼠在目标象限探索的时间百分比长于原代细胞治疗组 (P < 0.05；图4D)。

2.4.3 神经功能评分 细胞移植7 d时，与脑梗死组相比，原代细胞治疗组和诱导分化细胞治疗组大鼠NSS评分较低(P < 0.05)，且细胞移植14，60 d时诱导分化细胞治疗组大鼠NSS评分低于原代细胞治疗组(P < 0.05；表1)。

2.5 梗死体积 造模14 d后，TTC染色结果显示，原代细胞治疗组和诱导分化细胞治疗组脑梗死体积接近(P > 0.05；图5)。

2.6 神经元生存情况 细胞移植后60 d，Nissl染色发现原代细胞治疗组细胞空泡细胞，细胞稀疏，失去完整性，细胞质皱缩，可见椭圆形或三角形神经核，细胞肿胀，完整饱满细胞少，而诱导分化细胞治疗组细胞形态规则，排列整齐，胞浆饱满，染色正常，偶见空泡细胞，周围无水肿。原代细胞治疗组Nissl阳性细胞数量明显少于诱导分化细胞治疗组(P < 0.05；图6)。

2.7 CD34、神经胶质纤维酸性蛋白和ki-67阳性细胞数量 CD34是血管新生标志物^[13]，ki-67是细胞增殖标志物^[14]。免疫组化检测结果显示，细胞移植后14 d，CD34、神经胶质纤维酸性蛋白和ki-67阳性细胞数量接近。细胞植入后60d时原代细胞治疗组CD34和ki-67的表达少于诱导分化细胞治疗组(P < 0.05)，而神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量高于诱导分化细胞治疗组(P < 0.05；图7)。

2.8 脑组织炎症因子的表达变化 14 d时，各组大鼠脑组织白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子β表达水平接近(P > 0.05)。60 d时诱导分化细胞治疗组大鼠脑组织白细胞介素1β和肿瘤坏死因子β表达水平明显低于脑梗死组和原代细胞治疗组(P < 0.05)，而白细胞介素6表达水平与脑梗死组和原代细胞治疗组接近(P > 0.05；图8)。

参考文献

[1] 王志敏,王雷,徐程华.卒中单元超早期康复治疗对急性脑出血患者的疗效观察及治疗费用评价[J].中华老年医学杂志,2009,28(11):908-911.

[2] 吕莹.卒中单元超早期康复治疗对急性脑梗死患者的临床疗效分析[J].黑龙江医学,2017,41(5):397-399.

[3] Przybyt E, Harmsen MC. Mesenchymal stem cells: promising for myocardial regeneration? Curr Stem Cell Res Ther. 2013;8(4): 270-277.

[4] 张丹,秦书俭.脐血间充质干细胞多向分化能力的研究进展[J].河北联合大学学报(医学版),2006,8(4):457-459.

[5] Zhang Y, Yu LK, Xia N. Evaluation of serum and pleural levels of endostatin and vascular epithelial growth factor in lung cancer patients with pleural effusion. Asian Pac J Trop Med. 2012;5(3): 239-242.

[6] 陈津,郭子宽,王立生,等.大规模间充质干细胞培养技术评估报告[J].中国医药生物技术,2013,8(4):274-284.

[7] 何津,张毅,江小霞,等.人骨髓间充质干细胞对脐血T淋巴细胞转化的影响[J].中国实验血液学杂志,2003,11(1):11-14.

[8] 鞠秀丽,黄志伟,时庆,等.体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和诱导分化能力的研究[J].中华儿科杂志,2005,43(7):499-502.

[9] 赵林娜,李建斌,单泓,等.四联袋分离脐血干细胞效果的初步研究[J].中国现代医生,2008,46(17):70-71.

[10] 薛静,高培毅,孙崇然,等,用于神经干细胞移植的大鼠脑梗死模型的建立[J].中国脑血管病杂志,2006,3(1):34-37.

[11] 金成日,姜奥,张小卿.电针对脑缺血再灌注大鼠行为学影响实验研究[J].辽宁中医药大学学报,2017,(8):108-110.

[12] Hara H, Friedlander RM, Gagliardini V, et al. Inhibition of interleukin 1beta converting enzyme family proteases reduces ischemic and excitotoxic neuronal damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(5): 2007-2012.

[13] 向军,王西樵,刘英开,等.烧伤后瘢痕组织中成纤维细胞ET-1表达及血管新生和胶原分布研究[J].上海交通大学学报(医学版),2010,30(7): 839-842.

[14] 贾明,胡波飞,魏素菊.细胞增殖标志物Ki-67与乳腺癌[J].国际肿瘤学杂志,2011,38(5):364-366.

[15] 刘军朋,姜文学.骨髓间充质干细胞旁分泌促血管生成的研究进展[J].天津医科大学学报,2011,17(1):130-133,139.

[16] Welzel M, Appari M, Bramswig N, et al. Transcriptional response of peripheral blood mononuclear cells to recombinant human growth hormone in a routine four-days IGF-I generation test. Growth Horm IGF Res. 2011;21(6):336-342.

[17] Haiyan W, Qi Z, Huo F. General anesthesia-associated DNA damage in peripheral blood mononuclear cells of surgical patients. Asian Pac J Trop Med. 2011;4(9):686-688.

[18] Shin SW, Oh TJ, Park SM, et al. Asthma-predictive genetic markers in gene expression profiling of peripheral blood mononuclear cells. Allergy Asthma Immunol Res. 2011;3(4):265-272.

[19] [Costa-Rodrigues J, Fernandes A, Fernandes MH. Spontaneous and induced osteoclastogenic behaviour of human peripheral blood mononuclear cells and their CD14(+) and CD14(-) cell fractions. Cell Prolif. 2011;44(5):410-419.

[20] 支中文,杨龙,杜波,等.Necrostatin-1对大鼠脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞和炎症因子的影响[J].中华神经医学杂志,2015,14(8):757-763.

[21] França CM, Barros FM, Lotufo MA, et al. Response of peripheral blood mononuclear cells to conditioned medium from cultured oral squamous cell carcinomas. Braz Oral Res. 2011;25(5):414-420.

[22] Ji J, Kinders RJ, Zhang Y, et al. Modeling pharmacodynamic response to the poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 in human peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 2011;6(10): e26152.

[23] Parekh VS, Joglekar MV, Hardikar AA. Differentiation of human umbilical cord blood-derived mononuclear cells to endocrine pancreatic lineage. Differentiation. 2009;78(4):232-240.

[24] Yan X, Yang Y, Liu W, et al. Differentiation of neuron-like cells from mouse parthenogenetic embryonic stem cells. Neural Regen Res. 2013;8(4):293-300.

[25] [Gnecchi M, Danieli P, Cervio E. Mesenchymal stem cell therapy for heart disease. Vascul Pharmacol. 2012;57(1):48-55.

[26] Chen BY, Wang X, Wang ZY, et al. Brain-derived neurotrophic factor stimulates proliferation and differentiation of neural stem cells, possibly by triggering the Wnt/β-catenin signaling pathway. J Neurosci Res. 2013;91(1):30-41.

[27] 曹勇,杨波,宋来君,等.脐血间质干细胞移植对肌萎缩侧索硬化患者血浆和脑脊液中谷氨酸浓度的影响[J].郑州大学学报(医学版),2006,41(2): 236-238.

[28] 刘玉府,王利红,尚闯,等.人脐带血衍生间质干细胞改善大鼠急性期缺血性脑卒中模型神经功能[J].中华实验外科杂志,2015,32(3):534-537.

[29] Alaimo G, Cozzoli E, Marfe G, et al. Blood-derived stem cells (BDSCs) plasticity: in vitro hepatic differentiation. J Cell Physiol. 2013;228(6):1249-1254.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年12月至2016年12月在郑州大学生命科学学院实验室及河南省实验动物中心完成。

1.3 材料 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，鼠龄2个月，购于河南省实验动物中心，动物许可证号：SYXK(豫)2011- 0001。实验经过相关河南省动物伦理委员会批准。

脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿脐带，取标本前征得产妇及家属同意，产妇体健，无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，胎儿无先天性异常，ADA-A抗凝，血量在66-140mL，平均体积90mL。脐血分离前按卫生部血液检测标准进行检测。

实验用主要试剂及仪器：DMEM/F12 培养基、标准胎牛血清购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶、EDTA联合消化液、淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司；兔抗鼠CD34抗体、兔抗鼠CD44抗体、兔IgG SABC免疫组化试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司；重组人表皮细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、鼠抗人神经胶质纤维酸性蛋白、鼠抗人CD34鼠抗人Ki67购自美国Santa Cruz公司；CO2培养箱购自SHELLAB公司；倒置显微镜购自OLYMPUS公司；台式离心机购自日本久保田公司；无菌接口机购自日本泰尔茂公司；KX-21型血细胞计数仪购自日本东亚公司；细胞培养瓶购自美国Corning公司；酶标仪购自bioTeK公司。

1.4 方法

1.4.1 脐血间充质干细胞的分离、培养、鉴定及诱导 脐血加入抗凝剂，2 500 r/min低温离心5 min，取血浆，加入生理盐水充分混匀。缓慢加入预先加有密度为1.077 g/mL的人淋巴细胞分离液的空血袋中。1 900 r/min离心25 min，将上清液和中间的白膜层转移至空袋中，加入生理盐水，1 000 r/min离心5 min，洗涤2次，弃上清，所得细胞即为脐血间充质干细胞^[7-9]。

用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，加20 g/L碱性成纤维生长因子，将细胞分装于75 mL培养瓶中，置于37 ℃，饱和湿度体积分数为5%的CO₂培养箱中培养48-72 h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3 d或4 d全量换液1次。待细胞达到80%-90%融合时，用25 g/L的胰酶消化。消化过程中，用倒置显微镜观察细胞消化情况，待细胞大部分胞体回缩，变圆，即终止消化，加体积分数为20%的胎牛血清，加入生理盐水离心后，分为2份进行传代培养，并标记P1代。在传代培养过程中每3 d全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为P2代，其余类推。

免疫组化检测nestin表达。吸除培养液后以PBS冲洗3次，每次5 min。40 g/L多聚甲醛固定30 min。PBS洗5 min×3次，以体积分数3%H₂O₂孵育5-10 min。正常山羊血清封闭10-15 min；适当比例的一抗37 ℃孵育2.0-3.0 h或4 ℃过夜。PBS洗3 min×3次。生物素化二抗工作液室温或37 ℃孵育10-15 min。PBS洗3 min×3次。辣根酶标记链酶卵白素工作液室温或37 ℃孵育10-15 min。PBS洗3 min×3次。DAB显色。自来水充分冲洗。苏木精复染。中性树胶封固，光镜观察。

采用RT-PCR检测神经细胞基因Nestin、神经元特异烯醇化酶及神经胶质纤维酸性蛋白基因表达情况。

脐血间充质干细胞诱导用含体积分数10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基，加20 g/L碱性成纤维生长因子，将细胞分装于75 mL培养瓶中，置于37 ℃，饱和湿度体积分数为5%的CO₂培养箱中培养3周。

1.4.2 实验动物分组 大鼠随机分为4组，每组15只：假手术组、模型组、原代细胞治疗组及诱导分化细胞治疗组。

1.4.3 大鼠脑梗死模型的构建及鉴定 大鼠乙醚吸入麻醉，仰卧位固定，切开颈部皮肤及皮下组织，分离右侧颈总动脉，用无菌线结扎、缝合，整个手术过程在15 min内完成。实验动物完全苏醒后，出现惊厥发作、左侧肢体瘫痪、夹尾右旋等表现说明模型制作成功^[10]。假手术组仅分离右侧颈总动脉，不结扎。

对脑梗模型大鼠采用MRI观察大脑梗死部位。采用美国GE公司Discovery MR 750 3.0T高场磁共振仪和大鼠专用线圈进行扫描。每组大鼠分别行横轴位T1加权成像和T2加权成像、矢状位、冠状位T2加权成像、PWI序列扫描。

1.4.4 细胞移植治疗 造模后7 d通过尾静脉，分别注射0.3 mL生理盐水或1×10⁹ L^-1的细胞悬液0.3 mL，均换用生理盐水缓慢注射直到残留在留置针中的液体全部进入大鼠血管内，注射过程中注意大鼠心率及呼吸变化。原代细胞治疗组用分离的原代细胞治疗；诱导分化细胞治疗组用经过诱导分化的细胞治疗。

1.4.5 行为学评价 细胞植入后7，14，30，60，90 d时进行平衡木平衡实验以及平衡木行走实验。在细胞移植后早期(7 d)和晚期(60 d)进行水迷宫检测大鼠空间记忆及学习能力，水迷宫实验定位巡航实验在细胞植入后14 d和58 d时进行。

平衡木平衡实验：细胞植入后7 d时，把大鼠置于一宽1.5 cm的木条上。木条一端悬空，另一端固定于一块40 cm× 40 cm的平板中心，以防止大鼠从木条上爬到桌面上使实验失败。木条下备有软垫以防大鼠掉下时跌伤。正常大鼠的平衡能力在1 min，测量各组大鼠在平衡木站立时间^[11]。

平衡木行走实验：细胞植入后7 d时，测试大鼠运动整合和协调能力。采用长宽为2 cm×100 cm的平衡木，放置离地面约1 m高度，平衡木一端放置以黑箱子；记录大鼠穿行于平衡木到达黑箱子的时间，并记录前后肢发生错误的次数，错误定义是任何肢体滑落平衡木表面或紧靠平衡木侧面行走；在记录正式结果之前测试4次，目的是为了让大鼠适应测试环境并让其知道平衡木远端黑箱子的存在，测试间隔时间为5 min^[12]。

水迷宫实验：将适应训练后的大鼠以组为单位依次从4个不同象限放入水池中，观察记录大鼠游泳轨迹。利用摄像采集器记录下：游泳速度、穿越平台次数、逃避潜伏期(从入水开始到找到平台所用时间)以及在平台所在象限停留时间。反向探索测试阶段，将平台位置对调放置于第四象限中心位置。测试方法同空间探索测试，依次将每只鼠从4个不同象限放入水池中，观察小鼠游泳轨迹。记录上述4个参数。

NSS评分：移植后7，14，60 d，按照Masao Shmiizu- Sasamata的方法对所有大鼠进行神经行为评分，评分标准包括：①自主活动的程度；②左前肢偏瘫；③提尾时左前肢伸不直；抗侧推能力；⑤向左倾斜度；⑥向左环行度；⑦对触须的反应。以上指标无异常为0分，中等异常为1分，严重异常为2分，结果为各项评分之和^[12]。

1.4.6 TTC染色 细胞移植后14 d时，各组实验大鼠在10%水合氯醛麻醉后，经生理盐水和40 g/L多聚甲醛心脏灌注，断头处死取材，-20 ℃冰箱中速冻20 min左右，切片，每隔2 mm切一片，片厚1 mm。将切片置于2%TTC溶液中，锡箔纸盖住后，放入37 ℃温箱15-30 min，蒸馏水冲洗、40 g/L 多聚甲醛固定后数码相机照相，测各层梗死面积，计算梗死体积。梗死体积=各层梗死面积之和×层间隔。

1.4.7 尼氏染色 移植后14，60 d，各组实验大鼠在10%水合氯醛麻醉后，经生理盐水和40 g/L多聚甲醛心脏灌注，断头处死取材，体积分数为10%的甲醛固定3 d，作冠状位石蜡切片，片厚4 μm，行尼氏染色，每张切片在1%甲苯胺蓝溶液染色20 min，50 ℃，常规脱水，中性树胶封固。于普通光学显微镜下观察病理损伤区域及海马CA3区细胞变化，采用Imaging-Pro-Plus软件对切片进行定量分析。每张切片随机观察6个视野。高倍镜下对染色细胞进行计数。

1.4.8 免疫组化检测 细胞移植后14和60 d时，取大鼠脑组织，以PBS冲洗3次，每次5 min。40 g/L多聚甲醛固定30 min。消除内源性过氧化物酶：再次PBS冲洗3次，每次5 min，体积分数3%H₂O₂去离子水孵育5-10 min。滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育10-15 min，倾去，不洗。滴加适当比例稀释的一抗(神经胶质纤维酸性蛋白、CD34、ki-67)，37 ℃孵育2.0-3.0 h或4 ℃过夜。PBS冲洗，3 min×3次。滴加生物素化二抗工作液，室温或37 ℃孵育10-15 min。PBS冲洗，3 min×3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温或37 ℃孵育10-15 min。PBS冲洗，3 min×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗。苏木精显色。中性树胶封固后置于光镜下观察。阳性细胞的胞浆呈棕褐色或棕黄色。

1.4.9 Elisa分析 细胞移植后14和60 d时，取大鼠脑组织匀浆，抗体包被后，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min；加一定稀释的待检样品0.1 mL于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1 h，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1 mL。37 ℃孵育0.5-1.0 h，洗涤。加底物液显色后终止反应，酶标仪检测脑组织炎症因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子β的表达水平。

1.5 主要观察指标 ①细胞形态学观察；②平衡木试验，平衡木行走实验；③水迷宫；④尼氏染色观察神经元细胞生存情况；⑤免疫组化检测CD34、神经胶质纤维酸性蛋白、ki-67阳性细胞表达情况；⑥Elisa测定白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子β水平。

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0对所得样品数据进行统计学分析。数据采用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LNK法。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

脐血间充质干细胞是一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞、和神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞，具有免疫原性弱、增殖分化能力强及独特的来源优势成为近几年干细胞研究的热点，是细胞治疗的理想种子细胞^[15-17]。脑卒中后遗症患者大多有肢体瘫痪、失语等表现，严重影响患者的日常生活，给家庭和社会带来沉重的负担。临床上脑梗死的治疗除了药物对症治疗和康复理疗外，并未有其他更为确切有效的疗法，而且治疗花费巨大，疗程过长，很多需要终身服药，社会和家庭的人力物力财力投入巨大，因此，脐血间充质干细胞移植将是更为理想的治疗手段。国内外有许多专家学者对脐血间充质干细胞治疗神经系统疾病做了大量研究，但具体采用何种状态的脐血间充质干细胞治疗却未有报道。

美国科学家采用大鼠脐血干细胞加入维甲酸和生长激素后，诱导脐血干细胞转变为神经细胞，然后将其注入60只脑卒中大鼠静脉血中，4周后80%的鼠康复，而对照组仅20%康复^[3^，^18-25]。Chen等^[26-28]将脐血有核细胞注入大鼠卒中模型的尾静脉，在7，14 d时其运动功能明显改善。移植后14或35 d时，存活的脐血细胞分布于整个受损脑组织中，其中绝大多数位于缺血区域的边缘；而未受损半球极少，部分脐血细胞表达神经特异性核蛋白、微管相关蛋白2及胶质纤维酸性蛋白，大鼠活动能力恢复到卒中前的50%-80%。在脑梗死方面，将富含CD34⁺细胞(77%-95%)的脐血细胞移植于短暂大脑中动脉闭塞大鼠体内，发现仅有一小部分细胞表达神经细胞表型，而神经功能恢复在移植后几天就可以出现，提示脐血间充质干细胞还可能通过刺激内源性大脑修复机制而发挥作用^[29]。

作者将研究重点放在对比两种状态的细胞对脑梗死大鼠模型神经功能恢复效果上，旨在今后的脐血间充质干细胞应用中，选择合适的细胞状态。结果表明，经过细胞治疗后的脑梗死大鼠模型与模型组相比在神经功能评分、平衡木试验、平衡木行走试验、水迷宫实验中，脑梗死大鼠模型在进行细胞治疗后的平衡能力、行走能力、学习记忆能力以及空间定位能力得到改善，而经过诱导分化的细胞治疗组以上各项指标改善更加明显，与原代细胞治疗组相比，差异有显著性意义。实验在细胞治疗中使用的细胞数量都是一样的，因此是否可以推论，经过诱导分化的细胞已经接近于神经细胞的某些特性？但是，由于脐血间充质干细胞的定向分化功能，理论上未经培养诱导分化的细胞在脑梗死大鼠模型体内也可以定向分化为所需要修复神经损伤区域的细胞，所以运用免疫组化试剂盒检测CD34、神经胶质纤维酸性蛋白、ki-67阳性细胞表达情况，结果表明，在诱导分化细胞治疗组，神经胶质纤维酸性蛋白呈现低表达，CD34、ki-67高表达，这说明经过诱导分化细胞治疗后的脑梗死大鼠模型，损伤部位的炎症反应减轻，而新生血管标志物CD34的高表达说明大鼠体内有新生毛细血管增生，ki-67的高表达表明大鼠大脑损伤部位的细胞增殖活跃，因此可以推论，用诱导分化的脐血间充质干细胞的脑梗死大鼠模型，其体内炎症反应减轻，体内新生毛细血管增生，损伤部位细胞增殖活跃，因此，大鼠的运动协调能力、学习记忆能力和空间定位能力得到明显改善。

然而，实验只是做了60 d的动物实验模型，至于长期的效果，由于实验的局限没有追踪，对于细胞治疗的原理，也只是通过一些手段粗浅的推论。原代分离的细胞治疗组，对脑梗死大鼠模型远期的神经功能恢复会不会优于近期？如果细胞治疗加入脐血血浆，脐血血浆中的细胞因子，血浆蛋白会不会对神经损伤部位的恢复更有效？这值得进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

两种状态脐血间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的对比研究

Transplantation of umbilical cord blood mesenchymal stem cells at two states: comparison of neurological function recovery in cerebral infarction rats

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	麦丽萍, 何国东, 陈少贤, 朱杰宁, 侯兴华, 张梦珍, 李晓红. 乙醛脱氢酶3B1在人骨髓间充质干细胞自然衰老过程中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 40-44.
[2]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[3]	孟德峰, 李长仔, 吴春涛. LINC02532靶向miR-145影响胰腺癌干细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 52-58.
[4]	黄涛, 程志坚, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 翟文静, 周永新. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 70-75.
[5]	刘璐, 杨宇明, 商艾晨, 刘翠, 孙策, 王静. CD44⁺膀胱癌干细胞中角蛋白6B的表达和调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 76-83.
[6]	孙孟军, 郭建美, 周更苏, 董泽飞, 郑春贵, 曹翠丽. DNA拓扑异构酶Ⅱ在ICR小鼠神经干细胞中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 84-89.
[7]	敬劲, 赵珊笛, 陈龙, 彭双麟, 唐辉, 郭代金, 曾馨仪, 肖金刚. 骨质疏松症小鼠脂肪干细胞结合双相磷酸钙陶瓷修复骨质疏松症小鼠颅骨缺损#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 90-95.
[8]	胥雪玲, 刘军, 杨爱华, 王惠芳, 郭丹丹, 刘雪梅, 徐岩. 高糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 96-100.
[9]	崔帅帅, 杨晓红. miRNA在骨髓间充质干细胞自我更新、多向分化及命运和功能调控中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 101-106.
[10]	康悦, 刘洁. 环状RNA在间充质干细胞成骨分化中的生物学作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 107-112.
[11]	冯志国, 孙海飚, 韩晓强. 长链非编码RNA对骨相关细胞增殖、分化、凋亡的调控[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 113-120.
[12]	刘小刚, 李甜, 张舵. 中药有效成分促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 121-126.
[13]	魏珊, 李勤, 苏怡. 人乳牙牙髓干细胞的研究热点及应用潜能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 127-131.
[14]	赵旭, 毛鑫, 李春天, 王峰. 间充质干细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 132-137.
[15]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.