不同代数人脂肪干细胞分泌多种细胞因子水平的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0459

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂肪干细胞：是从脂肪组织中分离得到的一种能够多向分化的干细胞，能分泌多种细胞因子。
旁分泌：是指细胞产生的激素或调节因子通过细胞间隙对邻近的其他细胞(同种或异种)起调节作用。

摘要
背景：脂肪干细胞可分泌丰富的细胞因子，建立良好的损伤修复微环境，可成为细胞因子治疗各种缺血性疾病的良好的种子细胞来源。
目的：观察第2-10代(P2-P10)人脂肪干细胞分泌细胞因子水平的变化情况。
方法：从人脂肪组织中分离培养脂肪干细胞，显微镜下观察细胞形态特征，通过细胞免疫表型和细胞体外分化功能对细胞进行鉴定。
结果与结论：①细胞形态：脂肪干细胞形态呈长梭形或多角形，胞体丰满、胞浆均匀、核仁清晰，其生长增殖能力较强，体外诱导可进行成脂、成骨和成软骨分化；②流式细胞检测分析结果显示：P3代脂肪干细胞表达间充质表面标志物CD29(99.21%)、CD73(99.65%)和CD90(99.92%)，而几乎不表达造血干细胞表面标志CD34(2.25%)；③酶联免疫吸附试验结果显示：P5代脂肪干细胞分泌血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子水平最高，P3代脑源性神经营养因子的分泌水平最高。结果证实，脂肪组织来源的干细胞生物学特性稳定，表现出良好的生长和增殖潜能；不同代数的脂肪干细胞分泌的血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子浓度不同，P5代脂肪干细胞显示出较强的分泌血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子的能力，P3代脂肪干细胞显示出较强的分泌脑源性神经营养因子的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4638-4367(王倩)

关键词: 脂肪干细胞, 血管内皮细胞生长因子, 脑源性神经营养因子, 肝细胞生长因子, 免疫表型, 多向分化, 成脂细胞, 成骨细胞, 成软骨细胞, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells (ADSCs) can establish a favorable repair microenvironment by secreting abundant cytokines, which allows ADSCs to be a good source of seed cells for the treatment of ischemic diseases.
OBJECTIVE: To investigate the changes of cytokines secreted by human ADSCs at passages 2-10.
METHODS: After isolation and culture of ADSCs from human adipose tissue, the morphological features of cells were observed under inverted microscope. Human ADSCs were identified by the immunophenotypes and differentiation capability.
RESULTS AND CONCLUSION: ADSCs were fusiform or polygonal in shape, with buging cell body, homogenized cytoplasm and clear nuclei, and could differentiate into adipocytes, osteocytes and chondroblasts in vitro. ADSCs at passage 3 were positive for CD29 (99.21%), CD73 (99.65%) and CD90 (99.92%), but negative for hematopoietic marker CD34 (2.25%). ELISA results showed that ADSCs at passage 5 had the highest secretion levels of vascular endothelial growth factor and hepatocyte growth factor, while ADSCs at passage 3 had the highest secretion level of brain-derived neurotrophic factor. To conclude, ADSCs have steady biological features of stem cells and exhibit good growth and proliferation potentials. ADSCs at different passages have different capacities in the secretion of vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor and brain-derived neurotrophic factor. Passage 5 ADSCs show the highest ability to secrete vascular endothelial growth factor and hepatocyte growth factor, while passage 3 ADSCs show the strongest potential to secrete brain-derived neurotrophic factor.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

王倩，汤文燕，汪兆艳，杨印祥，栾佐. 不同代数人脂肪干细胞分泌多种细胞因子水平的比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1319-1324.

Wang Qian, Tang Wen-yan, Wang Zhao-yan, Yang Yin-xiang, Luan Zuo. A comparative study on the secretion of various cytokines by human adipose-derived stem cells at different passages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1319-1324.

图/表（结果） 1

2.1 脂肪干细胞的形态学特征 原代培养24 h后可见细胞贴壁，可见有少量细胞贴壁生长，呈短小梭形，培养48 h首次细胞换液，随着培养时间的延长，呈长梭形生长，3 d后细胞融合达80%-90%传代后细胞增殖速度明显加快，四五天即长满瓶底，细胞形态呈长梭形、多角形或不规则形态，核质比大，呈漩涡状生长，见图1。细胞可稳定传代至第10代。

2.2 脂肪干细胞的生长增殖情况 第3，5，9代脂肪干细胞的生长增殖情况，保持了良好的生长趋势，见图2。P3，P5和P9脂肪干细胞的生长增殖能力均差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 脂肪干细胞鉴定情况 流式细胞仪检测脂肪干细胞的细胞表面分子，其表达阳性细胞比例分别为CD29 (99.21%)、CD73(99.65%)和CD90(99.92%)，而几乎不表达造血干细胞表面标志CD34(2.25%)，见图3。

2.4 脂肪干细胞的分化潜能鉴定 取生长状态良好的第3代脂肪干细胞，加入成脂诱导完全培养基进行诱导第7天时可见少许细胞表面出现葡萄串珠样脂滴形成大小不一，到14 d时明显增多，21 d可见大部分细胞表面均有葡萄串珠样脂滴形成。使用油红O染色可见大量红色大小不一的圆形脂滴，边界清楚，位于细胞的一侧，呈葡萄串珠样脂滴，见图4A。由大约2.5×10⁵个细胞离心后形成的细胞团在离心管中进行软骨分化诱导液诱导，诱导分化两三周后，进行甲苯胺蓝染色液浸染后可见有部分细胞被染成蓝色，且细胞中有许多小孔具有软骨特征，见图4B。成骨诱导14 d以后用冯库萨试剂盒染色可见黑褐色颗粒状钙节的形成，见图4C。

2.5 脂肪干细胞分泌血管内皮细胞生长因子，脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子水平变化 酶联免疫吸附实验显示，随着代数的逐渐增加，脂肪干细胞分泌的血管内皮细胞生长因子和肝细胞生长因子水平逐渐增加。当细胞代数为P5时，血管内皮细胞生长因子的分泌水平最高，与其他代数相比差异有显著性意义(P < 0.05)，此后，其分泌水平逐渐下降，见图5A，B。而P3代脂肪干细胞分泌的脑源性神经营养因子最高，其与P2和P4分泌水平相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，而与P5-P10分泌水平相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5C，D。肝细胞生长因子的分泌水平于P5最高，且与其他代数相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，图5E，F。

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引言

脂肪干细胞(adipose-deprived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种能够多向分化的干细胞，具有体内储存量大、容易获取及增殖能力较强的特点，是理想的细胞治疗的种子细胞来源。同时，脂肪干细胞具有强大的旁分泌作用，可分泌多种细胞因子包括血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子及肝细胞生长因子等^[1-4]。这些因子对促进血管生成^[5]、促进皮肤创面愈合^[6]、免疫调节及造血刺激具有重要的作用^[7-8]，从而改善损伤或缺血性机体的生理和病理功能。因此，脂肪干细胞强大的细胞因子分泌功能，给各种缺血性或损伤性疾病带来了新的希望^[9]。

目前，国内外已有研究对比不同条件下脂肪干细胞的细胞因子分泌水平，如低氧条件下可上调血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及肝细胞生长因子的分泌水平^[10-12]。然而，低氧条件也许会改变脂肪干细胞的生物学和功能特征，从而影响移植脂肪干细胞的疗效。因此，实验在不改变脂肪干细胞培养条件下，从培养细胞不同的代数出发，摸索出最佳的细胞代数，从而为细胞移植治疗提供一定的理论基础支持。

随着脂肪干细胞不断的传代培养，其分泌的细胞因子也会随之变化，因此，探讨不同代数的脂肪干细胞分泌的细胞因子水平具有非常重要的意义。实验通过酶联免疫吸附实验检测P2-P10代的脂肪干细胞其分泌的细胞因子的水平，有利于明确脂肪干细胞分泌细胞因子的最佳细胞代数，为细胞因子应用于治疗各种损伤和缺血性疾病提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年2月至10月在海军总医院儿科实验室进行。

1.3 材料 人脂肪组织收集自海军总医院美容科提供的吸脂术后的脂肪组织混悬液，女性，年龄30-60岁，供者健康状况良好，无其他系统性疾病，术前均签订知情同意书，试验经海军总医院伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 人脂肪干细胞的分离与培养^[13] 用PBS洗涤脂肪组织3次。离心机(日本KUBOTA公司)2 000 r/min离心5 min，弃上清留取脂肪组织沉淀，再用PBS洗涤2次，尽量去除脂肪组织中的红细胞。Ⅰ型胶原酶(美国Worthington公司)消化，离心收集细胞沉淀。细胞沉淀用PBS重悬，然后分别用100 μm和40 μm细胞筛(美国Corning公司)过滤，去除未充分消化的残余组织块，再次以1 800 r/min离心5 min，收集细胞沉淀用2 mL PBS重悬；加入红细胞裂解液，室温15 min，充分裂解红细胞，用PBS洗涤细胞2次，计数，用无血清培养基(北京东铭源科技有限公司)以细胞浓度10⁹ L^-¹取10 mL接种于T75的培养瓶中，记为P0代，放入体积分数5%二氧化碳培养箱(日本Sanyo公司)中培养48 h后首次全量换液，待细胞长满达90%融合后，体积分数0.25%胰蛋白酶消化，按照细胞浓度1×10⁶每T75培养瓶的比例传代培养。倒置显微镜(日本Olympus公司)下观察细胞形态并拍照记录。

1.4.2 绘制脂肪干细胞生长曲线

绘制脂肪干细胞标准曲线：选取生长状态良好的第3代(P3)，P5和P9脂肪干细胞，体积分数0.25%胰蛋白酶/EDTA(美国Gibco公司)消化收集细胞，用无血清培养基混匀重悬为1.2×10⁸ L^-¹单细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μL(2.4×10⁴/孔)，以2.4×10⁴/孔为最高细胞浓度依次倍比稀释细胞浓度为1.2×10⁴/孔、0.6×10⁴/孔、0.3×10⁴/孔、0.15×10⁴/孔、0.075×10⁴/孔，各设5个复孔，无血清培养基做空白对照，测定吸光度值后取其均值，接种后37 ℃培养箱培养6 h，待细胞完全贴壁伸展，弃上清，加入含CCK-8培养基，继续37 ℃培养箱培养2 h测定吸光度值，制作以细胞数量为横坐标，吸光度值为纵坐标的标准曲线。

绘制脂肪干细胞生长曲线：将上述P3，P5和P9代脂肪干细胞分别用无血清培养基重悬为6×10⁶ L^-¹单细胞悬液，接种于5块96孔培养板中，每孔200 μL(2.4×10⁴/孔)每板设5个复孔，无血清培养基做空白对照，测定吸光度值后取其均值。在培养6，24，48，72，96 h，分别更换培养液后加入CCK-8试剂继续培养2 h，用酶标仪测定吸光度值，将吸光度值代入标准曲线获得细胞数后，绘制细胞生长增殖曲线。

1.4.3 流式细胞分析检测免疫表型 用体积分数0.25%的胰蛋白酶消化收集P3代CD31⁺细胞，取2×10⁶个细胞于流式管中，PBS洗涤2次，将荧光标记单克隆抗体CD29，CD73，CD90和CD34(美国Bioscience公司)加入到流式管中，鼠同型对照抗体作为参照。轻轻混匀，4 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪(英国BD公司)行表面抗原标记鉴定。

1.4.4 脂肪干细胞的诱导分化及染色鉴定

向脂肪细胞诱导分化：取生长良好的P3代细胞，接种于6孔板，待细胞浓度融合至80%，加入成脂细胞诱导液2 mL (高糖DMEM、体积分数10%胎牛血清、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、100 μmol/L 吲哚美辛、10 mg/L胰岛素、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，每隔三四天换液，并且镜下观察分化情况。成脂特性染色：40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗2次，体积分数0.3%油红O染色(美国Sigma公司)15 min，PBS洗2次，避光密封，倒置显微镜下观察拍照。

向软骨细胞诱导分化：取生长良好的P3代细胞，接种于6孔板，待细胞融合至80%，将细胞消化下来，离心后加入诱导液2 mL(高糖DMEM、质量浓度1.25 mg/L牛血清白蛋白、6.25 mg/L转铁蛋白、10 μg/L 转化生长因子β1、50 mg/L抗坏酸、1 mmol/L丙酮酸钠、6.25 mg/L胰岛素、5.35 mg/L亚油酸、0.1 μmol/L地塞米松、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素)重悬，细胞悬液于15 mL离心管中500 r/min低速离心15 min，使细胞形成微团，每隔两三天半量换液，共诱导3周，细胞分化好后，冰冻切片并染色鉴定。成软骨特性染色：40 g/L多聚甲醛固定30 min，阿尔辛蓝染液37 ℃孵育30 min，PBS洗2次，倒置显微镜下观拍照。

向骨细胞诱导分化：取生长良好的P3细胞，接种于6孔板，待细胞浓度融合至80%，加入诱导液2 mL(低糖DMEM、体积分数10%胎牛血清、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.1 μmol/L地塞米松、质量浓度50 mg/L抗坏血酸、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)培养，每隔三四天换液并且镜下观察分化情况，诱导2周后，冯库萨试剂盒染色(美国Sigma公司)，倒置显微镜下观察拍照。

1.4.5 酶联免疫吸附实验(ELISA) 收集P2-P10代脂肪干细胞条件培养基，将细胞接种于T25培养瓶中，待细胞浓度融合至80%后，吸弃原来的培养基，用PBS洗涤2次，再每瓶加入1.6 mL BME基础培养基(北京中科迈晨生物科技有限公司)继续培养24 h后，收集各代的细胞代谢条件培养基，使用ELISA试剂盒(美国R＆D公司)测定条件培养基中血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子水平。①脑源性神经营养因子的测定：50 μL标准品及样品加入已包被好的反应杯中，室温下孵育2 h，不洗板直接加入脑源性神经营养因子结合液，室温孵育1 h，洗板后加入底物室温30 min，然后再加终止液，30 min内，在450 nm处测吸光度；②血管内皮细胞生长因子的测定：200 μL标准品及样品加入已包被好的反应杯中，室温下孵育2 h，洗板后加入血管内皮细胞生长因子结合液，室温孵育2 h，洗板后加入底物室温20 min，然后再加终止液，30 min内在450 nm处测吸光度；③肝细胞生长因子的测定：50 μL标准品及样品加入已包被好的反应杯中，室温下孵育2 h，洗板后加入肝细胞生长因子结合液，室温孵育1.75 h，洗板后加入底物室温30 min，然后再加终止液，30 min内在450 nm处测吸光度。根据标准曲线计算相应血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子水平。

1.5 主要观察指标 脂肪干细胞的细胞形态特征，生长增殖能力，免疫表型特征，体外诱导分化能力，以及不同代数脂肪干细胞多种细胞因子的分泌水平。

1.6 统计学分析 用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以x(_)±s表示，组间数据差异的比较采用单因素方差分析和LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

脂肪干细胞是理想的组织工程和干细胞研究的种子细胞，其可分泌多种细胞因子，对血管新生和组织恢复具有非常重要的作用。Zuk等^[14]在2001年成功从脂肪组织中分离培养出具有多向分化潜能的干细胞。同年，Gronthos等^[15]发现，脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞的细胞表面标志具有相似的表达标志，证实了脂肪干细胞的确存在。

脂肪干细胞具有多向分化潜能，且免疫原性较低，是组织工程和干细胞研究的种子细胞，因此，脂肪干细胞迅速成为干细胞研究的热点之一。研究证实，脂肪干细胞在缺血性疾病中具有促进血管新生，并保护缺血性组织的作用。研究发现，移植脂肪干细胞可分化为心肌细胞和内皮细胞，并改善心肌重构，进而提高机体心梗后心功能^[16]。然而，不少研究认为移植的脂肪干细胞并不能分化为心肌细胞和血管细胞，其治疗作用主要是通过旁分泌作用完成的。这提示了干细胞可能是机体潜在的旁分泌/自分泌系统，特别是干细胞的分泌功能不仅直接影响植入干细胞自身的存活和分化，而且是干细胞移植发挥治疗效应的重要机制之一^[17]。

脂肪干细胞可分泌多种促血管生长和抗细胞凋亡的细胞因子，这对于促进新生血管的形成具有非常重要的作用。因此，探讨影响脂肪干细胞分泌细胞因子水平的因素有非常重要的意义，实验从细胞代数这个基点出发，探讨脂肪干细胞分泌细胞因子最佳细胞代数，为脂肪干细胞用于细胞治疗提供重要的依据。脂肪干细胞可分泌多种不同的细胞因子^[18-19]，如血管内皮细胞生长因子，脑源性神经营养因子及肝细胞生长因子等，这些细胞因子对调节机体生理和病理过程具有重要的作用。通过前期的实验发现，脂肪干细胞具有较高的血管内皮细胞生长因子，脑源性神经营养因子，肝细胞生长因子的分泌水平，并且这3种细胞因子对机体血管新生和损伤修复具有重要的意义，而转化生长因子等其他细胞因子分泌水平较低，因此，实验选取血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子及肝细胞生长因子作为研究的对象。其中，血管内皮细胞生长因子是生理性或病理性血管发生和血管生成过程中重要的调控因子，在血管内皮细胞的增殖、存活、迁移及渗透过程中发挥着重要的调控作用^[20-21]。

脑源性神经营养因子广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活^[22]、分化、生长发育起重要作用^[23]，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。脑源性神经营养因子表达水平的变化与各种神经系统性疾病密切相关，如抑郁症、癫痫、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈症和帕金森病^[24-28]。肝细胞生长因子是一种作用广泛的因子，除对肝细胞作用之外，还对多种组织和细胞具有调控作用。还具有启动肝再生、促细胞分裂作用、细胞运动作用及肿瘤坏死作用等生理功能^[29-31]。因此，实验比较不同代数的脂肪干细胞其血管内皮细胞生长因子、脑源性神经营养因子及肝细胞生长因子的分泌水平，探讨脂肪干细胞分泌细胞因子的最佳生长的细胞代数，为脂肪干细胞应用于细胞移植治疗各种中枢神经系统疾病提供良好的种子细胞代数。

实验分离培养的脂肪干细胞形态呈长梭形、多角形或不规则形，类似成纤维细胞，排列紧密呈漩涡状生长。并且，脂肪干细胞的生物学特性较稳定，具有较强的生长增殖能力，可连续稳定传代至10代，无明显老化现象。通过体外诱导分化，实验发现人脂肪干细胞体外诱导可进行成脂、成骨和成软骨分化。流式分析结果表明，脂肪干细胞表达间充质表面标志CD29，CD73和CD90，而几乎不表达CD34，而CD34主要表达于造血干细胞/祖细胞以及内皮细胞。酶联免疫吸附实验结果表明，P3代脂肪干细胞分泌的脑源性神经营养因子水平最高，达132.43 μg/L；P5代脂肪干细胞分泌的血管内皮细胞生长因子(2 150.75 μg/L)和肝细胞生长因子(2 447.05 μg/L)最多。并且，随着代数的增加，第10代脂肪干细胞血管内皮细胞生长因子，脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子的分泌水平均降低。实验结果给细胞因子治疗各种损伤性或缺血性疾病提供了重要的信息提示。

综上所述，实验初步探讨了脂肪干细胞的生物学特性及其最佳细胞因子分泌水平的细胞代数，为细胞治疗的临床转化研究提供了新的思路。实验仅探讨了第2-10代细胞因子的分泌水平，后续代数细胞因子的分泌水平需继续明确；以及脂肪干细胞应用到临床时还需要明确患者适应证及禁忌证等相关问题，此类问题逐步解决后临床上应用脂肪干细胞进行疾病的细胞治疗指日可待。并且，进一步研究脂肪干细胞的旁分泌确切机制和旁分泌功能的影响因素；以及如何合理有效应用干细胞这一潜在功能，是目前亟需解决的问题。

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