干细胞转录因子OCT4、SOX2在食管鳞癌组织中表达及与预后的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.019

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
干细胞转录因子Sry相关HMG盒2(SOX2)：属于SOX(SRYlike HMG box)基因家族成员，包含DNA结合区HMG，协同Nanog、Oct3/4基因维持胚胎干细胞自我更新，联合klf4、c-Myc等基因能诱导成纤维细胞向多能干细胞转化，所编码的蛋白参与了早期胚胎形成、神经发育、性别决定、细胞命运决定乃至肿瘤发生等重要的生物学过程。
八聚体结合转录因子4(Oct4)：是POU转录因子家族中的一员，人Oct4基因位于6号染色体上(6p21.31)，长度16.40 kb，具有多个转录起始位点，转录不同的mRNA亚型(Isoform)，从而翻译成多种蛋白质，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。

摘要
背景：研究表明，OCT4、SOX2、HIWI等在肿瘤组织中有表达。
目的：分析干细胞转录因子SOX2、OCT4在食管鳞癌中的表达变化及与患者临床特征、预后的关系。
方法：采用免疫组织化学SP法检测77例手术后经病理学证实为食管鳞癌患者的手术标本(食管癌组)和40例癌旁组织标本(癌旁组织)中SOX2、Oct4蛋白的表达水平，并分析其与患者临床特征、预后的关系。
结果与结论：①食管癌组织中的SOX2蛋白、Oct4蛋白阳性表达率均显著的高于癌旁组织(P < 0.05)；②食管癌组织中的SOX2蛋白、Oct4蛋白在低分化、淋巴结转移患者中呈显著的高表达(P < 0.05)；③食管癌组织中的SOX2蛋白阳性表达患者的3年随访中位生存期24个月，显著低于阴性患者的30个月；Oct4蛋白阳性表达患者的中位生存时间21个月显著低于阴性患者33个月；④结果提示，SOX2、Oct4蛋白在食管癌组织中高表达，并且与患者的分化程度、转移及预后有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID:0000-0002-3751-035X(温子海)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 食管鳞癌, Sry相关HMG盒2, 八聚体结合转录因子4, 临床特征, 预后

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that OCT4, SOX2 and HIWI can express in tumor tissues.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between the expression of stem cell transcription factors SOX2 and OCT4 in esophageal squamous cell carcinoma and their clinical characteristics and prognosis.
METHODS: Expression levels of SOX2 and Oct4 were detected using immunohistochemical SP method in 77 cases of esophageal squamous cell carcinoma and 40 cases of adjacent cancer tissues confirmed by pathological examination, and then the their relationship with prognosis and clinical characteristics of the patients was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Significantly higher levels of SOX2 and Oct4 were found in the esophageal cancer tissues than the adjacent cancer tissues (P < 0.05). SOX2 and Oct4 were highly expressed in the esophageal cancer tissues isolated from poorly differentiated, lymph node metastasis patients (P < 0.05). During the 2-year follow-up, the median survival of patients positive for SOX2 and Oct4 was only 24 and 21 months, respectively, which was significantly lower than that of negative patients (30 and 33 months, respectively). These findings indicate that the highly expressed SOX2 and Oct4 in esophageal cancer tissues are associated with the differentiation, metastasis and prognosis of the patients with esophageal squamous cell carcinoma.

Key words: Transcription Factors, Esophageal Neoplasms, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 分组对照观察。

1.2 时间及地点 实验于2013年10月至2014年3月在唐山市工人医院完成。

1.3 对象 选取唐山市工人医院手术后经病理学证实为食管鳞癌的77例患者的癌组织手术标本(食管癌组)和40例癌旁组织标本(癌旁组织)。

食管癌组77例患者，年龄39-79岁，平均年龄(63.8±12.7)岁；其中男49例、女28例；分化程度：高分化14例、中分化17例、低分化46例；根据2009年美国癌症联合会(AJCC)TNM分期标准：Ⅰ期17例、Ⅱ期19例、Ⅲ期20例、Ⅳ期21例；发生淋巴结转移40例。癌旁组织40例患者，年龄41-75岁，平均年龄(64.8±10.5)岁；其中男29例、女11例。两组患者的年龄、性别构成差异无显著性意义(P > 0.05)。

1.3.1 诊断标准 手术切除后经病理学证实为食管癌组织或癌旁组织。

1.3.2 纳入标准 ①食管癌组织或癌旁组织标本；②患者术前未接受过放疗、化疗等治疗；③患者的各项临床病理特征、术后随访情况均具有良好的数据记录；④研究获得研究对象的知情同意。

1.3.3 排除标准 ①术前具有放化疗病史的患者；②合并其他恶性肿瘤性疾病的患者；③各项资料不完整的患者。

1.4 方法

1.4.1 免疫组织化学检测 首先采集组织标本，然后食管癌组织中SOX2、OCT4的表达用免疫组织化学方法检测。

1.4.2 组织标本采集 在标本离体后迅速进行组织标本的采集。首先观察大体标本并进行拍照，确认肿瘤的部位及范围，然后将癌及癌旁组织切成多块直径为0.5 cm左右的组织小块并分块装进带有编号的灭菌冻存管，立即放进液氮转移罐。

1.4.3 免疫组织化学法 ①切片，烤片；②脱蜡及复水；③1份体积分数30%H₂O₂加10份蒸馏水，室温10 min，蒸馏水洗3次，每次3 min；④微波修复；⑤将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次；⑥封闭，5%BSA，室温20 min，甩去多余液体；⑦滴加一抗，37 ℃，1 h，或者4 ℃过夜；⑧PBS洗涤3次，每次3 min；⑨滴加二抗，37 ℃，15-30 min；⑩PBS洗涤3次，每次3 min；?滴加SABC，37 ℃， 30 min；?PBS洗涤3次，每次5 min；?1 mL蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；?DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间(约5 min)；?自来水冲洗干净，过蒸馏水；?苏木精复染2 min，自来水冲洗；?脱水；?树胶封固，镜检。

1.4.4 免疫组织化学判断标准 SOX2、Oct4蛋白的阳性着色表达于细胞核，呈黄色、棕黄色、褐色颗粒，本研究采用光镜下度每一张切片每一个视野中的阳性着色细胞数、着色强度进行评分的半定量方法进行评价；①根据着色强度：0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为褐色、黑色；②根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例<10%为1分、阳性细胞所占比例10%-50%为2分、阳性细胞数51%-75%为3分、阳性细胞数所占比例> 75%为4分，两种积分相乘总分≤3分为阴性、>3分为阳性。

1.5 主要观察指标 ①2种组织中SOX2蛋白、Oct4蛋白阳性表达情况；②食管癌患者SOX2蛋白、Oct4蛋白阳性表达与患者的临床病理特征关系；③食管癌患者SOX2蛋白、Oct4蛋白阳性表达与患者预后生存的关系。

1.6 统计学分析 数据分析在SAS 9.0软件包中处理，正态分布的计量指标用x(_)±s表示，百分或构成比率比较用卡方检验；生存分析采用kaplan-meier法，生存中位时间比较采用log-rank秩检验法； P 表示差异有显著性意义。 < 0.05

讨论

在中国每年大约有25万人新确诊为食管癌，食管癌因此越来越受到人们的关注和研究^[14]。食管癌的组织学分型包括鳞状细胞癌、腺癌、未分化癌^[15]，其中以鳞状细胞癌最为多见，未分化癌虽较少见但恶性程度最高，以腺癌最为少见^[16]。食管癌的病因包括食物中亚硝酸盐刺激、身体的创伤和炎症、环境的污染及食品的污染等^[17]。近年来越来越多的研究显示吸烟、饮酒也是引起食管癌的常见原因^[18]，患者类型呈男性多于女性，且40岁以上男性是高发人群^[19]。由于食管癌早期症状不明显，不易被发现，所以在临床中患者一旦确诊为食管癌往往已是中晚期，已失去最佳治疗时机，手术效果并不理想，复发率非常高，使食管癌患者术后五年存活率往往不足10%^[20]。故食管癌早期发现早期治疗是非常重要的步骤，但是由于目前常用肿瘤标志物对食管癌缺乏特异性及敏感性，导致食管癌的早期发现陷入困难^[21]。因此寻找新的对食管癌有特异性和敏感性的肿瘤标志物、了解食管癌生物特点将有利于食管癌的早期发现和有利于探寻新的生物治疗靶点，为提高食管癌患者的生存时间和生活质量带来巨大的影响^[22]。

在自然界中，生物所表现出独特的形状都是由于基因转录和翻译的结果。转录和翻译可以使基因控制蛋白质合成，毫无误差的完成基因的表达，整个过程中任何一点细微偏差，都将导致不可预知的缺陷或疾病^[23]。真核生物转录过程中有多重蛋白质因子协助参与，转录因子定位于细胞核中，不仅参与机体器官及血管生成，还对细胞凋亡起到调控作用，更可对癌基因、抑癌基因及细胞凋亡的相关分子进行调节，从始至终干预细胞生长发育，最终导致肿瘤的发生及转移^[24-25]。相关研究表明，肿瘤组织一般具有以下的表型特征^[26-28]：具有向正常组织侵袭和转移的能力；可持续性促进肿瘤血管生成；复制潜力有限性；可程序性逃避细胞凋亡；对生长抑制信号不敏感性；呈自给自足性生长。SXO2和OCT4基因是维持胚胎干细胞特性的核心物质，与干细胞各种状态息息相关，已经成为胚胎干细胞分化发育成为各种功能细胞不可缺少的因子，并且目前已经证实，二者在多种肿瘤发生发展中起到了重要作用^[29]。

作者实验中发现，食管癌组织中的SOX2蛋白、Oct4蛋白阳性表达率均显著的高于癌旁组织，并且食管癌组织中的SOX2蛋白、Oct4蛋白在低分化、淋巴结转移患者中呈显著的高表达。食管癌患者出院后的随访中发现：食管癌组织中的SOX2蛋白阳性表达患者的3年随访中位生存期显著的低于阴性患者，Oct4蛋白阳性表达患者的中位生存时间显著的低于阴性患者。纵观作者的研究可以得出SXO2 和OCT4基因在食管癌干细胞生物学特性维持及肿瘤转移中有重要的作用，进一步深入研究SXO2 和OCT4基因与食管癌发生发展的关系，将有助于清楚食管癌的发生及复发机制^[30]，具有巨大的临床意义，为食管癌的早期发现早期治疗做出巨大贡献。

综上所述，SOX2、Oct4蛋白在食管癌组织中高表达，并且与患者的分化程度、转移及预后有关。