CD4+CD25+调节性T细胞与造血干细胞移植后移植物抗宿主病的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.026

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
移植物抗宿主病：异基因造血干细胞移植后发生在100 d以内移植物对受者的免疫攻击称为急性植物抗宿主病，病理表现为淋巴细胞广泛浸润致各正常组织细胞损伤，临床表现为皮疹、腹泻、肝功能异常。100 d以后发生的称为慢性植物抗宿主病。
CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的分类：在人类的外周血、胸腺、淋巴组织和脾内有5%-10%的CD4⁺T细胞表面持续带有CD25⁺抗原，它们主要是在胸腺内分化和发育，同时需要细胞因子和共刺激分子的维持。其中直接来源于胸腺髓质的一类称为天然CD4⁺CD25⁺调节性T细胞，而在有抗原和细胞因子存在的条件下，由成熟的T细胞转化而成的另一类则称为诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。

摘要

背景：自身反应性T细胞是一群通过某些机制发挥外周免疫抑制效应，以确保处于机体免疫耐受状态的特殊细胞群。天然CD4⁺CD25⁺调节性T细胞最新表面标志物的发现使外周T细胞调节或抑制的概念重新被重视起来，一些研究小组开始探讨异基因造血干细胞移植的动物模型中调节性T细胞的作用。

目的：通过对小鼠移植模型过继转移CD4⁺CD25⁺调节性T细胞，总结移植物抗宿主病预防的最新研究结果，同时探讨造血干细胞移植临床研究的最新发现。

方法：应用计算机检索2000至2015年CNKI数据库及PubMed/Medline数据库有关 CD4⁺CD25⁺调节性 T 细胞与移植物抗宿主病相关性研究的文献。对资料进行初审，按纳入和排除标准筛选后对其中46篇相关性强的文献进行进一步分析。

结果与结论：CD4⁺CD25⁺调节性T细胞表达的转录因子FOXP3是介导免疫调节功能、预防自身免疫性疾病发生的关键。诱导免疫耐受是异基因造血干细胞移植成功的前提，目前国内外许多实验室正在移植模型和临床试验中研究CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的功能。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞在造血干细胞移植后发生植物抗宿主病中起着重要作用，在有效预防和治疗移植物抗宿主病的同时还能保留移植物抗白血病效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-1164-9978(郭智)

关键词: 干细胞, 移植, 调节性T细胞, CD4⁺CD25⁺, 异基因造血干细胞移植, 免疫耐受, FOXP3, 移植物抗宿主病, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Autoreactive T cells are a group of specialized cells that exert a peripheral immunosuppressive effect through certain mechanisms ensuring self-tolerance within the adaptive immune system. The discovery of the latest surface markers for natural CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells has re-emphasized the concept of peripheral regulation or suppression of T cells. Several groups have begun to investigate the role of regulatory T cells in animal models of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

OBJECTIVE: To review the recent results regarding protection from graft-versus-host disease by adoptively transferred CD4⁺ CD25⁺ regulatory T cells in mice and to discuss the latest findings from clinical studies on hematopoietic stem cell transplantation.

METHODS: We retrieved CNKI, PubMed and Medline databases for articles concerning CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells and graft-versus-host disease published from 2000 to 2015. According to inclusion and exclusion criteria, 46 papers were included in result analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells expressing the transcriptional repressor FOXP3 mediate immunoregulatory functions and are critical for the prevention of autoimmune diseases. As peripheral tolerance induction is a prerequisite for successful allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, the role of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells in transplantation models and clinical trials is now under investigation in many laboratories. CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells play an important role in the development of graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells not only effectively prevent and treat graft-versus-host disease but also retain graft-versus-leukemia effect.

Key words: Stem Cells, Hematopoietic Stem Cell Transplantation, Immune Tolerance, Graft vs Host Disease, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郭智，童春，陈惠仁. CD4⁺CD25⁺调节性T细胞与造血干细胞移植后移植物抗宿主病的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1456-1462.

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图/表（结果） 1

2.1 T细胞耐受性 机体适应性免疫即后天获得性免疫，能够识别自身成分与异体成分，其免疫机制是针对外来病原体，而不是自身正常组织发挥免疫反应的关键。这种辨别自体与异体的能力是在免疫系统成熟过程中逐渐获得的。CD4^-CD8^-前体细胞起源于骨髓，在胸腺中分化、成熟为CD4⁺CD8⁺T细胞，并表达低水平的T细胞受体。其中只有5%的CD4⁺CD8⁺T细胞能够识别皮质上皮细胞的自身MHC，通过T细胞受体产生信号，95%的CD4⁺CD8⁺T细胞不会发挥任何效应，最终逐渐凋亡。阳性选择诱导T细胞针对特定MHC抗原做出反应，保护它们在胸腺及外周免于凋亡。重复识别自身MHC，是T细胞的存活和保持稳定的关键^[2]。根据MHC分子选择模式不同，CD4⁺CD8⁺T细胞进一步分化成熟，从双阳性状态变为单阳性状态，并胸腺皮质迁移至骨髓，在骨髓中与APC结合。这些APC通过诱导凋亡达到自身免疫耐受，那些高活性的单阳性细胞表达与自身MHC高亲和力的T细胞受体，而低至中等活性的单阳性细胞释放到外周。因此，胸腺中T细胞的成熟包括初始的自我识别，能够生成反应性克隆性T细胞。发生T细胞介导的自身免疫性疾病说明胸腺存在缺陷，会生成功能不正常的自身反应性T细胞，健康个体中也存在自身反应性T细胞，这表明额外的外周免疫耐受弥补中枢T细胞免疫耐受的不足^[3]。免疫耐受机制包括基因缺失或非缺失，基因缺失的免疫耐受机制指外周非淋巴器官中自身反应性T细胞激活并诱导细胞凋亡。非基因缺失的免疫耐受可以是反应性T细胞的内在特性所致，也可以是效应细胞自身无反应性，或者由其他抑制细胞群介导。

2.2 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞 在切除胸腺的小鼠模型中，术后第3天小鼠便发生组织特异性自身免疫损伤，但输注同系成年鼠外周血CD4⁺T细胞后可组织损伤可有所改善，发挥免疫效应的细胞能够表达白细胞介素2受体的α链CD25^[4]。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞介导的免疫保护作用在多种自身免疫性疾病模型中得到验证^[5]。调节性T细胞针对病原体、肿瘤及同种异体组织的免疫调节作用一直是研究的焦点^[6]。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞不同于非调节细胞或传统T细胞(Tconv)，区别表现在CD4⁺CD25⁺调节性T细胞细胞内不仅高表达CTLA-4，同时还表达其他细胞表面标志物，包括肿瘤坏死因子、淋巴细胞活化基因3、受体家族基因、神经纤维蛋白等。由于一些非调节性T细胞亚群激活后也能表达上述分子，所以这些分子均不能特异性地标记调节性T细胞，但是叉头/翼状螺旋转录因子(Foxp3)可特异性标记CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。体外CD4⁺CD25⁺调节性T细胞增殖活性极低，同时对CD4⁺CD25⁺ T细胞和CD8⁺T细胞具有强大的抑制效应。由于CD4⁺CD25⁺调节性T细胞缺乏充分的白细胞介素2启动子区域染色质，所以其生存依赖外源性白细胞介素2^[7]。调节性T细胞和传统的T细胞在对白细胞介素2的反应上也存在不同，调节性T细胞促进细胞增殖的信号传导通路是被阻断的，而促进JAK/STAT5通路是完整的。因此，在白细胞介素2和白细胞介素2受体敲除的小鼠体内不存在CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。相反，将CD4⁺CD25⁺调节性T细胞过继转移到淋巴细胞减少的野生型小鼠体内，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞可存活并增殖，达到稳定状态，这表明白细胞介素2与其他刺激因子联合作用可以克服CD4⁺CD25⁺调节性T细胞体外的免疫无能状态^[8]。

CD4⁺CD25⁺调节性T细胞介导的免疫抑制机制尚不明确。调节性T细胞的体内外免疫抑制活性必须在T细胞受体被激活后才能获得。在体外，调节性T细胞的抑制效应主要靠细胞间的直接接触，不依赖细胞因子，最终导致调节性T细胞活化、增殖和/或靶细胞产生细胞因子的能力减弱。膜结合转化生长因子β是免疫抑制功能的介质，但小鼠转化生长因子β存在缺陷，因而不能产生CD4⁺CD25⁺调节性T细胞^[9]。在体内，调节性T细胞介导的免疫抑制过程似乎是更为复杂。白细胞介素10的作用在一些试验疾病模型中已被证实。同样，CD8⁺T细胞表达的转化生长因子β受体Ⅱ对CD4⁺CD25⁺调节性T细胞介导的免疫抑制作用无反应^[10]。转化生长因子β是调节性T细胞自身产生还是由APC分泌还有待证实。下调的MHC分子作用于APC表面的共刺激分子，诱导吲哚胺2，3-双加氧酶形成，导致色氨酸代谢增加，最终抑制T细胞的活化^[11-12]。总之，这些结果表明，在多个抑制模型中都存在CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的作用，然后根据体内局部微环境和自身的激活状态，对多个靶细胞群发挥作用。特有的Foxp3作为识别CD4⁺CD25⁺调节性T细胞发育和发挥功能的关键调节因子。FOXP3基因突变导致含突变基因小鼠的皮屑病最终发展为淋巴组织增生性疾病和严重的自身免疫性疾病^[13]。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞特异性表达FOXP3，如果将FOXP3过继转移到患皮屑病野生型(WT)小鼠体内，小鼠可存活^[14]。FOXP3的表达使部分外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞成为抑制性细胞。研究表明，FOXP3是产生调节性T细胞和调节性T细胞发挥免疫抑制功能的必要细胞因子^[15]。

人体外周血、外周淋巴器官及胸腺中存在天然CD4⁺调节性T细胞；这些细胞首先停留在CD25高表达区域，显现出与对照小鼠相同的表型、功能和分子特征及FOXP3的表达^[16]。正常状态下FOXP3表达极低和/或受到T细胞刺激后CD25表达明显增加。外周T细胞发挥免疫调节功能不仅依赖胸腺来源的抑制性T细胞，还依赖外周非调节性T细胞及其产生的细胞^[17]。为了进一步探讨FOXP3与CD25表达之间的关系，通过制备绿色荧光蛋白–FOXP3基因敲除小鼠模型的实验结果显示，在这些动物模型中大部分CD4⁺ T细胞既表达FOXP3、也表达CD25，这提示少数产生FOXP3的细胞存在于CD4⁺CD25⁺调节性T细胞池中^[18]。产生FOXP3的T细胞中未发现多克隆或抗原特异性FOXP3，提示外周调节性T细胞上调FOXP3 mRNA及蛋白表达是一个罕见事件。在单个核细胞水平检测FOXP3技术的改进使体外诱导调节性T细胞这一问题得到有效解决。

FOXP3在调节性T细胞生长、发育中具有重要作用的观点已经被广泛接受，但很少有人知道FOXP3在诱导胸腺细胞成熟过程中的作用。调节性T细胞的生成依赖类皮质上皮细胞表达的MHCⅡ类分子^[19]，对T细胞受体有较强的亲和力，使得FOXP3在外周错误地识别自身抗原，产生免疫反应。此外，胸腺上皮细胞产生的信号也尚未确定^[20]。其他调节性T细胞的生成和维持稳定所需的辅助因子包括转化生长因子β、白细胞介素2和CD28。早期的试验主要研究FOXP3直接识别的分子靶点、FOXP3与核因子κB的相互作用、活化T细胞的核因子(NF-AT)以及如何抑制这些因子的转录活性，最终产生如白细胞介素2、白细胞介素4、γ-干扰素和肿瘤坏死因子α等细胞因子^[21]。目前，人们普遍认为维持外周免疫耐受主要是CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ T细胞，但其抑制途径及抑制机制仍不完全清楚。

2.3 小鼠模型中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的移植物抗宿主病和移植物抗白血病效应 小剂量供体Tconv过继转移到去除T细胞的小鼠骨髓中或致死剂量照射的MHC不匹配小鼠体内可诱发急性移植物抗宿主病。相反，大剂量纯化的供体CD4⁺CD25⁺调节性T细胞过继转移到TCD-BM小鼠体内反而不引起移植物抗宿主病^[22]。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞在体内是发挥一定效应的，它们能够促进异基因骨髓移植中骨髓的植入，加速造血重建以及嵌合体的稳定^[23]。更为重要的是，当CD4⁺CD25⁺调节性T细胞与CD4⁺CD25^-T细胞或CD8⁺T细胞按1∶1或1∶2同时输注到受者体内时，可以起到预防移植物抗宿主病的作用。无论是未经处理的还是在体外经过活化和扩增的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞都能起到保护作用。在供受体MHC部分或完全不匹配模型中都能观察到CD4⁺CD25⁺调节性T细胞抑制移植物抗宿主病的效应，其保护受体的作用涉及减少体质量下降、延长平均生存时间，甚至能够缓解致命移植物抗宿主病发生^[24]。

在疾病进展缓慢的移植模型中，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞延迟输注可以改善急性移植物抗宿主病。与供体来源的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞相比，将受体来源的调节性T细胞回输到经致死剂量照射后的小鼠体内，移植物抗宿主病仍然发生^[25]。免疫抑制因子在体内也具有保护作用，如供体调节性T细胞分泌的白细胞介素10是抑制移植物抗宿主病发生必不可少的^[26]，同种异型抗原是由来源于骨髓的APC产生的，而不是移植物抗宿主病靶器官的上皮细胞产生的，这是发生移植物抗宿主病的关键^[27]。在体外，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞CD62L和CD62L亚群包含相似的水平的Foxp3^[28]，都不释放针对T细胞受体的白细胞介素2，并且在多克隆或同种异体特异性抗原刺激下，都同样被抑制^[29]。在同种异体移植中只有调节性T细胞的CD62L亚群能够起到保护受体免受移植物抗宿主病损害的作用^[30]。CD62L和CD62L亚群具有不同的迁移和增殖能力，因为输注供者CD62L后，受者体内的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞显著减少，这也就解释了为什么移植后早期移植物抗宿主病主要发生在淋巴结中^[31]。这些研究结果表明，受者次级淋巴器官中APC的激对机体活存在潜在危害，因为它保护了供体T细胞免受破坏。

调节性T细胞是在接近靶器官时获得免疫抑制活性，在发生移植物抗宿主病的靶器官中可以检测出一些供者来源的调节性T细胞，供者来源的成熟T细胞是产生移植物抗宿主病主要原因，但另一方面也是移植后造血系统恶性肿瘤患者体内发挥移植物抗白血病效应的主要细胞^[32]。移植物抗宿主病是由于供受者间广泛表达的主要和/或次要组织相容性抗原不同引起的，这恰恰也是移植物抗白血病效应效应的作用靶点。对造血干细胞移植后复发的患者进行供者淋巴细胞输注可显著减少疾病复发，但移植物抗宿主病发生率也随之增加。因此，供者T细胞介导的移植物抗宿主病和移植物抗白血病效应在很大程度上是相互制约的。小鼠模型中发现CD4⁺CD25⁺调节性T细胞可以抑制移植物抗宿主病的产生, 但是却不能减弱移植物抗白血病效应的作用，说明 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞可能是一种能够有效减低移植物抗宿主病并且保留移植物抗白血病效应效应的调节细胞。

造血系统恶性肿瘤是造血干细胞移植的主要适应症，动物实验中，通过体内成像方法来定位和量化移植前小鼠体内的肿瘤负荷。移植物抗宿主病相关致死率和肿瘤相关致死率进行比较表明，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞没有介导移植物抗白血病效应的效应。向肿瘤患者体内输注供者Tconv可使受者不发生移植物抗宿主病。后植入的调节性T细胞不能阻止Tconv介导移植物抗白血病效应效应，因为受者原本的白血病和淋巴瘤疾病本身就足以破坏受者肝、脾、淋巴结和骨髓等器官。因此保留移植物抗白血病效应效应去除移植物抗宿主病效应似乎由来自供体T细胞扩增或迁移的差异引起的。当将CD4⁺CD25⁺调节性T细胞同时输注到受者体内时，体内肿瘤的消除以及受到刺激后分泌细胞因子并发挥细胞毒性效应，供体调节性T细胞并没有破坏Tconv的功能，但是限制了其早期的扩增，最终导致移植物抗宿主病的发生^[33]。总之，这些体内外试验数据表明调节性T细胞迁移到淋巴器官并识别受者APC同种异体抗原。

2.4 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞在临床造血干细胞移植中的应用 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞是一种重要的免疫调节细胞，具有诱导免疫耐受的作用，从而维持体内内环境的稳定，和许多效应细胞之间的平衡将左右体内的免疫应答。临床造血干细胞移植是治疗许多血液及非血液疾病的最有效方法，但是因为移植物抗宿主病的存在限制了此方法的广泛进展，临床上解决移植物抗宿主病的问题基本都是应用免疫抑制剂诱导免疫耐受，因此，研究CD4⁺CD25⁺调节性T细胞为解决这一问题提供了可行的治疗模式。

IPEX症候群患者中致死性自身免疫性疾病的发生证明自身反应性T细胞的抑制活性是由特定的调节性T细胞产生的，同时是维持自身免疫耐受必不可少的。调节性T细胞可能有助于异基因造血干细胞移植后诱导免疫耐受，从而减轻移植物抗宿主病。有限的临床研究比较了有无移植物抗宿主病患者外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞细胞数，结果显示移植物抗宿主病的发生和移植物中CD25⁺T细胞数呈正相关。然而，将非调节性T细胞与调节性T细胞区分开仍是冻存干细胞技术的难点。通过量化FOXP3的表达监测造血干细胞移植后调节性T细胞重建，与未发生移植物抗宿主病的患者相比，移植物抗宿主病患者外周血单个核细胞FOXP3水平明显降低^[34]。此外，FOXP3是T细胞从胸腺迁移出来后才表达的新标记。基于这种关系，移植物抗宿主病损伤胸腺使生成的T细胞存在缺陷或调节性T细胞保护胸腺免受供体T细胞的攻击，从而促进移植后免疫功能重建。其他体外试验中，环孢素阻止了同种异体反应性T细胞CD25表达的上调，而调节性T细胞表达的CD25彻底耗尽的这些毒素。调节性T细胞发育或激活状态的转变，胸腺的选择以及在外周组织的分布均可能影响其在体内的调节功能^[35]。这可能受造血干细胞移植过程多个变量影响如预处理方案的强度、组织相容性差异、受者年龄和胸腺功能、移植后药物维持治疗及合并感染等，近年来国内相关移植中心探讨CD4⁺CD25⁺调节性T细胞与移植物抗宿主病的相关性研究结果见表1。

2.5 CD4⁺CD25⁺调节性T细胞与移植物抗宿主病的相关性研究展望 造血干细胞移植目前已广泛应用于恶性或者良性血液系统疾病的治疗^[39-41]，如再生障碍性贫血、白血病等，但移植后合并移植物抗宿主病会极大的影响治疗效果^[42]。移植物抗宿主病发生机制与T淋巴细胞相关，移植后受者移植物中会有供者的T淋巴细胞，这些T淋巴细胞会引起免疫反应最终出现移植物抗宿主病来攻击宿主靶器官，导致组织功能或脏器功能损伤^[43]。移植物抗宿主病主要累及肝脏、消化道、皮肤等器官或组织，轻度移植物抗宿主病表现为腹泻、肝肾轻度功能异常、皮疹等，调整免疫抑制剂用法用量后症状可得到控制，重度移植物抗宿主病表现为大片皮肤剥脱、肝肾功能衰竭、严重水样腹泻、伴黏液浓血便、肠道黏膜剥脱等，若不能有效控制其发展，通常会在短时间内死于多器官功能衰竭^[44]。临床使用免疫抑制剂抗移植物抗宿主病治疗有一定局限性，相关研究表明属于CD4⁺T细胞亚群的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞具有抗移植物抗宿主病这种功效，因为CD4⁺CD25⁺调节性T细胞水平与急性移植物抗宿主病的密切相关，没有急性移植物抗宿主病的患者CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例随着移植后的时间的延长而增加，最终达到正常水平，而合并急性移植物抗宿主病的患者，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的表达相对较低减少^[45]。通过定期监测移植后患者外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞细胞水平，可先于临床症状出现前及时发现并预防急性移植物抗宿主病来提高长期生存率，因此，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞可作为一种有意义的生物学标记物来预测急性移植物抗宿主病的发生及判断其预后^[46]。总之，CD4⁺CD25⁺调节性T细胞在造血干细胞移植术后产生的移植物抗宿主病中起着重要作用，可能通过调控移植后患者体内CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的水平来预测、预防、监测、治疗急性移植物抗宿主病，从而减少了异基因移植后移植物抗宿主病的发生率及有效的控制了移植物抗宿主病，为其提供了新的治疗方向。

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