大麻素2型受体激活对钛颗粒诱导成骨细胞凋亡的干预作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
假体周围无菌性松动的治疗：主要分为药物治疗和基因治疗，按照作用机制可分为抑制炎症细胞因子释放，抑制破骨细胞分化成熟和促进成骨细胞生物活性，使得骨质溶解减少及骨质形成增多，最终提升骨量。但很少有研究者将研究重点放在假体周围骨溶解中成骨细胞增殖活性受抑制及成骨细胞凋亡的环节上，对于磨损颗粒抑制成骨细胞增殖活性并诱导其凋亡的机制并不十分清楚，且对于成骨细胞具有保护作用的药物及其保护机制的报道并不多。
HU-308：作为一种人工合成的高特异性的小分子大麻素2型受体激动剂，能够刺激新生小鼠颅骨成骨细胞和MC3T3-E1成骨细胞的增殖，同时伴随着碱性磷酸酶活性增强和细胞外矿化物质的积累。还有研究发现，大麻素2型受体激活能有效抑制来自绝经后骨质疏松性妇女的破骨细胞活性及成熟，并且对成骨细胞有促有丝分裂的作用。

背景：成骨细胞凋亡而导致的成骨减少是最终假体松动的重要原因，大麻素2型受体的激活可促进成骨细胞的增殖，减少细胞凋亡率的发生。
目的：探讨钛颗粒负荷下，大麻素2型受体激动剂HU-308对成骨细胞株MC3T3-E1凋亡的抑制作用及保护机制。
方法：将体外培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1分5组培养，空白对照组以常规细胞培养基培养；钛颗粒组以含2.5 g/L钛颗粒的细胞培养基培养；低浓度药物组以含2.5 g/L钛颗粒+10^-9 mol/L HU-308的细胞培养基培养；中浓度药物组以含2.5 g/L钛颗粒+10^-8 mol/L HU-308的细胞培养基培养；高浓度药物组以含2.5 g/L钛颗粒+10-⁷ mol/L HU-308的细胞培养基培养。培养48 h，检测各组细胞增殖活性、凋亡、细胞内活性氧水平、线粒体膜电位水平及Caspase-3活性。
结果与结论：①与空白对照组比较，钛颗粒组细胞增殖活性、线粒体膜电位水平明显下降(P < 0.01或P < 0.05)，凋亡率、细胞内活性氧水平、Caspase-3活性明显升高(P < 0.01或P < 0.05)；②与钛颗粒组比较，高浓度药物组细胞增殖活性、线粒体膜电位水平升高(P < 0.05)，中、高浓度药物组细胞凋亡率、细胞内活性氧水平、Caspase-3活性降低(P < 0.01或P < 0.05)；③结果表明，HU-308能有效逆转钛颗粒对MC3T3-E1成骨细胞活性的抑制及促凋亡作用，而这些保护作用可能是HU-308通过调节细胞内活性氧水平、提升线粒体膜电位水平及Caspase-3活性来实现的。

ORCID: 0000-0003-0788-6601(裴方)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 大麻素2型受体, 钛颗粒, MC3T3-E1细胞, 细胞凋亡, 细胞内活性氧水平, 线粒体膜电位, Caspase-3活性, 流式细胞, 酶联免疫吸附实验

Abstract:

BACKGROUND: Impaired osteogenesis caused by osteoblast apoptosis is a main reason of aseptic loosening. Type-2 cannabinoid receptor activation can promote osteoblast proliferation and reduce apoptosis.
OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effect of HU-308 (type-2 cannabinoid receptor agonist) on the osteoblastic MC3T3-E1 cells co-cultured with titanium particles and its relative mechanism.
METHODS: Mouse MC3T3-E1 cells were cultured in vitro and divided into five groups: cells were cultured in the normal medium as blank control group, cultured in the medium with 2.5 g/L titanium particles as titanium group, cultured in the medium containing 2.5 g/L titanium particles plus 10^-9, 10^-8 and 10-⁷ mol/L HU-308 as low-, medium- and high-concentration groups, respectively. Forty-eight hours later, cell proliferation, apoptosis, levels of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential as well as Caspase-3 activity were assessed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the black control group, the cell proliferation activity and the level of mitochondrial membrane potential were significantly reduced and the apoptosis rate, the level of reactive oxygen species and Caspase-3 activity were significantly increased in the titanium group (P < 0.01 or P < 0.05). Compared with the titanium group, the cell proliferation activity and the level of mitochondrial membrane potential significantly increased in the high-concentration group, and the apoptosis rate and Caspase-3 activity significantly decreased in the medium- and high-concentration groups (P < 0.05). These findings demonstrate that HU-308 can effectively improve the impaired osteogenesis induced by titanium particles, probably through modulating reactive oxygen species and elevating mitochondrial membrane potential and Caspase-3 activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Titanium, Osteoblasts, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

裴方，周冰，郑伟，沈振宇，王琛，仇尚，郭开今. 大麻素2型受体激活对钛颗粒诱导成骨细胞凋亡的干预作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(43): 6431-6437.

Pei Fang, Zhou Bing, Zheng Wei, Shen Zhen-yu, Wang Chen, Qiu Shang, Guo Kai-jin.

Type-2 cannabinoid receptor agonist inhibits titanium particle-induced osteoblast apoptosis

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(43): 6431-6437.

图/表（结果） 3

2.1 HU-308对钛颗粒抑制MC3T3-E1细胞增殖活性的干预作用与空白对照组比较，钛颗粒组细胞增殖活性下降明显(P < 0.01)；高浓度药物组细胞增殖活性高于钛颗粒组(P < 0.05)，见图2。

2.2 DAPI染色计数各组细胞凋亡率钛颗粒组有部分细胞核呈现出凋亡形态改变，即明显的核固缩，核染色质浓染(凋亡的细胞核与DAPI染料结合，在荧光下呈现较为明亮的蓝色，而正常细胞由于仅有胞质的微观蛋白与DAPI结合，呈现的蓝色相对较暗)；空白对照组则近乎没有细胞凋亡；高浓度药物组也几乎观察不到典型的凋亡细胞核，见图3A。荧光显微镜下对凋亡细胞核计数分析，钛颗粒组细胞凋亡率为(37.26±5.76)%，明显高于空白对照组(P < 0.01)；中、高浓度药物组细胞凋亡率分别为(16.11±2.96)%、(6.73±0.91)%，均低于钛颗粒组(P < 0.01)，见图3B。

2.3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率流式细胞技术通过计数FITC/PI 双染结果对细胞凋亡定量分析。相比于空白对照组，钛颗粒组细胞凋亡率上升到(18.14± 3.02)% (P < 0.01)；较钛颗粒组，中、高浓度药物组细胞凋亡率分别下降到(5.94±1.21)%和(2.14±0.43)% (P < 0.01)，见图3C。

2.4 钛颗粒负荷下HU-308对MC3T3-E1细胞内活性氧水平的影响 DCFH-DA荧光染色及流式细胞仪检测结果显示，相比于空白对照组，钛颗粒组细胞内活性氧水平提升明显(P < 0.05)；与钛颗粒组比较，中、高浓度药物组细胞内活性氧水平降低(P < 0.05)，见图4A。

2.5 各组细胞线粒体膜电位水平流式细胞仪检测结果显示，钛颗粒组细胞线粒体膜电位水平较空白对照组显著减少(P < 0.05)；与钛颗粒组相比，高浓度药物组细胞线粒体膜电位水平显著增加(P < 0.05)，低、中浓度药物组则无明显变化(P > 0.05)，见图4B。

2.6 ELISA检测各组细胞Caspase-3表达水平与空白对照组比较，钛颗粒组细胞Caspase-3活性显著增高(P < 0.01)；相比于钛颗粒组，中、高浓度药物组细胞Caspase-3活性明显降低(P < 0.05)，见图4C。

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引言

自20世纪70年代以来，人工关节在基础研究、设计生产及临床应用等方面的迅速发展，使得人工关节置换被广泛开展，并已成为临床上治疗各类终末期关节疾病常用有效方法。人工关节置换在解除疼痛、保持关节活动度和稳定性、不影响肢体长度等方面有显著优势。尽管随着假体材料更新和手术技术的进步，假体使用寿命有所延长，但假体周围无菌性松动仍然是影响假体远期使用寿命的一个主要难题^[1]。目前针对假体周围无菌性松动的防治已成为研究热点，如何延长人工假体的使用寿命、避免或者延缓翻修的时间已成为众多学者研究的共同目标。

在人工全关节置换后，由于置入假体部分与周围骨的相互磨损而产生磨损颗粒，在假体周围骨质溶解中起关键作用^[1]。骨质溶解是由于细胞吞噬磨损颗粒后产生无菌性炎症反应而引发的，磨损颗粒能够显著损害成骨细胞的活性及分化功能，同时刺激破骨细胞并引起破骨细胞活化^[2-4]。研究发现，钛金属颗粒能够显著损害成骨细胞的活性并诱导其凋亡^[5]，增加成骨细胞Caspase-3活性^[6]，同时刺激破骨细胞并引起破骨细胞活化^[6]。当破骨细胞介导的骨溶解超过成骨细胞介导的骨形成时，这种由磨损颗粒引起的骨重塑不平衡将导致骨量的丢失，最终导致全关节置换的失败^[7]。目前较多的研究集中在破骨细胞活化、增殖等过程，而对于成骨细胞的成骨环节研究相对较少。因此，通过抑制成骨细胞凋亡来增加骨质形成，是药物预防人工关节置换后假体无菌性松动的又一个重要思路。

近年来，有研究发现大麻素受体还表达于骨骼系统中，在调节骨细胞活性、骨重塑和骨量中起重要作用^[7-10]。Ofek等^[11]发现HU-308作为一种人工合成的高特异性的小分子大麻素2型受体激动剂，能够刺激新生小鼠颅骨成骨细胞和MC3T3-E1成骨细胞的增殖，同时伴随着碱性磷酸酶活性增强和细胞外矿化物质的积累。还有研究发现，大麻素2型受体激活能有效抑制来自绝经后骨质疏松性妇女的破骨细胞活性及成熟，并且对成骨细胞有促有丝分裂的作用^[12]。综上，HU-308对成骨细胞增殖及分化有一定积极促进作用，并且可能通过抑制骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值来抑制破骨细胞的活化，最终而对骨溶解起到抑制作用。前期实验已发现大麻素2型受体激活能够有效抑制钛颗粒引起的成骨细胞凋亡^[13]，但对于大麻素2型受体激活后的这种保护作用机制尚不清楚。

实验将MC3T3-E1细胞与钛颗粒于体外环境共培养，模拟体内假体周围界面细胞环境，利用HU-308激活大麻素2型受体来探讨钛颗粒负荷下大麻素2型受体激活对成骨细胞凋亡的干预作用，希望能为药物防治节置换后假体周围松动提供新的思路。

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材料方法

1.1 设计对比观察细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年12月在徐州医学院神经生物实验室、麻醉实验室、药理学实验室完成。

1.3 材料

1.4 实验方法

钛颗粒电镜观察及内毒素的处理：使用透射电镜观察并拍摄钛颗粒，见图1。钛颗粒置于180 ℃持续6 h进行烘干，后用体积分数75%乙醇进一步处理48 h，以此来去除可能存在的内毒素。使用鲎试剂盒检测，确保钛颗粒无内毒素。用ME3T3-E1生长培养基悬浮颗粒，并配成质量浓度为10 g/L的储存溶液，每次实验前用培养基稀释储存溶液，以便提供实验所需颗粒浓度。钛溶液在添加到细胞中之前进行30 min超声处理，以防止聚合。

细胞培养及实验分组：将MC3T3-E1细胞常规培养于含89 mL α-DMEM高糖培养基，胎牛血清10 mL和青链霉素混合液1 mL的完全培养基中。细胞培养条件为 37 ℃、体积分数5%CO₂饱和度。

实验分5组：空白对照组以常规细胞培养基培养；钛颗粒组以含2.5 g/L钛颗粒的细胞培养基培养；低浓度药物组以含2.5 g/L钛颗粒+10^-9 mol/L HU-308的细胞培养基培养；中浓度药物组以含2.5 g/L钛颗粒+10^-8 mol/L HU-308的细胞培养基培养；高浓度药物组以含2.5 g/L钛颗粒+10^-7 mol/L HU-308的细胞培养基培养。

1.5 主要观察指标

CCK-8检测细胞增殖活性：将MC3T3-E1细胞以4×10³/孔的密度接种在96孔板，根据实验分组加入颗粒与药物，收集细胞于48 h。每孔加入900 µL新的细胞培养基和10 µL CCK-8试剂，96孔板于37 ℃ 条件下反应 1 h。酶标仪在450 nm波长下测量吸光度(A)值。

DAPI染色及凋亡细胞核计数：将MC3T3-E1细胞以4×10³/孔的密度接种于24孔板过夜，显微镜下观察细胞单层铺满并贴壁于孔底，根据实验设计分别加入含有钛颗粒及不同浓度药物的新鲜培养基。培养48 h后收集细胞，用40 g/L多聚甲醛在室温下固定15 min，用含有0.3%Triton-X-100的PBS在室温下反应5 min，加入DAPI染色液室温、避光下作用10 min。荧光显微镜下观察，随机选取5个高倍视野(×200)拍照并计数核。

流式细胞仪检测细胞凋亡率：将MC3T3-E1细胞以4×10³/孔的密度接种于6孔板块，待细胞细胞单层铺满并贴壁于孔底后，根据实验分组加入颗粒与药物。培养48 h后收集细胞，根据试剂盒说明操作，每孔先后加入Binding Buffer、Annexin V-FITC和Propidium Iodide (PI)，室温下避光反应30 min。于1 h内进行流式细胞仪检测。

细胞活性氧水平的检测：将MC3T3-E1细胞以4×10³/孔的密度接种于6孔板块，待细胞细胞单层铺满并贴壁于孔底后，根据实验分组加入颗粒与药物。培养48 h后加入活性氧荧光探针DCFH-D(20 µmol/L)， 37 ℃下孵育30 min。收集细胞，离心弃上清，PBS重悬细胞，随即上流式细胞仪进行检测。

线粒体膜电位的测量：将MC3T3-E1细胞仪4×10³/孔的密度接种于6孔板块，待细胞细胞单层铺满并贴壁于孔底后，根据实验分组加入颗粒与药物。培养48 h后收集细胞，加入罗丹明123(RH123)溶液100 µL，37 ℃下孵育30 min，离心，弃上清，PBS洗涤重悬，移至流式管，上流式细胞仪检测。

Caspase-3活性检测：将MC3T3-E1细胞以4×10³/孔的密度接种于6孔板块，待细胞细胞单层铺满并贴壁于孔底后，根据实验分组加入颗粒与药物。培养48 h后收集细胞，根据试剂盒说明操作，配置反应体系100 μL(缓冲液80 μL，Ac-DEVD-pNA 10 μL及待测样品10 μL)， 37 ℃下孵育4 h。酶标仪在405 nm波长下测量吸光度。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计分析。所有数据均采用x(_)±s表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用q 检验。检验水准α=0.05，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

在人工全关节置换后，由于置入假体部分与周围骨的相互磨损而产生的磨损颗粒，在假体周围骨质溶解中起关键作用，并最终可能导致假体无菌性松动而需要翻修^[1]。导致无菌性松动的机制基本可以归纳为2类原因：一类为生物学因素，即松动是由磨损颗粒引起；另一类为机械因素，即由于压力、微动和应力遮挡等引起。而其中生物学因素是假体后期松动的主要原因。

目前针对假体周围无菌性松动的治疗根据方式主要分为药物治疗和基因治疗，按照作用机制可分为抑制炎症细胞因子释放，抑制破骨细胞分化成熟和促进成骨细胞生物活性，使得骨质溶解减少及骨质形成增多，最终提升骨量。但很少有研究者将研究重点放在假体周围骨溶解中成骨细胞增殖活性受抑制及成骨细胞凋亡的环节上，对于磨损颗粒抑制成骨细胞增殖活性并诱导其凋亡的机制并不十分清楚，且对于成骨细胞具有保护作用的药物及其保护机制的报道并不多。所以，理论上能有效干预磨损颗粒引起成骨细胞增殖活性下降及细胞凋亡的药物将具有较大优势。

最近研究发现，大麻素2型受体的激活能通过直接刺激成骨细胞和抑制破骨细胞，直接或间接通过下调RANKL表达来抑制破骨细胞生成，最终维持骨量^[11]。还有人发现，大麻素2型受体激活能有效抑制来自绝经后骨质疏松性妇女的破骨细胞的活性及成熟，并且对成骨细胞有促有丝分裂的作用^[12]。课题组前期研究发现，HU-308作为一种大麻素2型受体选择性受体激动剂，能有效逆转钛颗粒引起的成骨细胞增殖活性下降及细胞凋亡率的增高，但对于大麻素2型受体激活后的细胞保护作用机制还不清楚^[13]。因此实验将成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)与钛颗粒进行体外共培养，进一步研究钛颗粒负荷下大麻素2型受体激活对成骨细胞保护作用机制。

据报道，钛颗粒能明显降低成骨细胞活性并诱导其凋亡^[5]，也能增加成骨细胞Caspase-3活性^[6]。之前研究也发现，钛颗粒负荷下MC3T3-E1细胞增殖会减少和细胞凋亡率会相应增加，而HU-308能有效逆转钛颗粒引起的细胞增殖下降和细胞凋亡率增高^[13]。实验首先确认一个合适的粒子质量浓度，结果发现钛粒子质量浓度为2.5 g/L时能够明显减少细胞活性，同时不会产生过度的细胞死亡，以保证有足够数量的活细胞呈现需要观察的反应，所以被选择用于后面的实验^[13]。在研究细胞凋亡的实验中发现，DAPI染色和流式细胞仪分别计数每组细胞凋亡率，两者的结果显示钛颗粒组的细胞凋亡率分别为(37.26±5.76)%和(18.14±3.02)%，两者之间统计差别较大的原因应该是两种方法检测的分别为细胞凋亡率及早期细胞凋亡率，但中、高浓度药物组均能有效抑制钛颗粒引起的细胞凋亡。从这点来看，两种检测方法的结果是一致的。相比于Ofek等^[11]的实验，尽管Sophocleous等^[14]实验中HU-308药物保护作用时间更长(10-12 d)且药物浓度更高(10-30 nmol/L)，也未能发现HU-308对来自于大麻素2型受体基因野生型小鼠成骨细胞增殖的影响，仅发现当小鼠卵巢切除后HU-308能显著增加成骨细胞数量。根据现有的知识，其中的原因还不清楚。

实验还通过检测各组细胞内活性氧水平、线粒体膜电位水平及细胞Caspase-3活性，来研究钛颗粒对MC3T3-E1细胞的毒性机制及钛颗粒负荷下HU-308对MC3T3-E1细胞的保护机制。在线粒体损伤引起的细胞氧化应激反应，细胞内活性氧水平的增高可引起细胞增殖受抑制、细胞凋亡甚至坏死，引起活性氧水平增高是导致细胞毒性的一个重要原因。而线粒体跨膜电位的改变可反映线粒体膜通透性变化，线粒体膜通透性的改变可能引起细胞凋亡，线粒体膜电位也是反映细胞早期凋亡的一个指标。作者此次实验结果显示，钛颗粒能够显著提升细胞内活性氧水平及降低线粒体膜电位，进而引起细胞增殖活性降低及细胞凋亡的发生；而在加入HU-308的药物保护组，随着药物剂量的增加保护作用随之增强，细胞内活性氧水平及降低线粒体膜电位水平分别有不同程度降低及升高。线粒体的损伤也会引起Caspase-3含量的改变，Caspase-3的激活是细胞发生凋亡的很重要的一个环节，Caspase-3活性下降能够抑制细胞凋亡的发生^[15-22]。实验发现HU-308能显著降低由钛颗粒刺激引起的MC3T3-E1细胞Caspase-3活性升高。

综上所述，研究发现，钛颗粒通过引起成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)内的活性氧水平的增高及改变线粒体通透性，并提升Caspase-3活性来对MC3T3-E1细胞产生毒性，抑制细胞增殖并引起细胞凋亡的发生，而HU-308呈剂量依赖性抑制钛颗粒引起的细胞毒性，并通过降低细胞内活性氧水平的增高、保护线粒体通透性及降低Caspase-3活性对MC3T3-E1细胞起保护作用。

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