咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.008

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (40): 5979-5985.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.008

• 脑及脊髓损伤动物模型 Animal models of brain and spinal cord injuries • 上一篇下一篇

咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的保护

邱实¹，李军果¹，邱倩²，陈辉¹，相子民³

¹解放军陆军总医院，北京市 100068；²解放军第155医院呼吸肾病科，河南省开封市 475003；³解放军南京军区福州总医院骨一科，福建省福州市 350025

修回日期:2016-07-08 出版日期:2016-09-30 发布日期:2016-09-30
通讯作者: 相子民，副主任医师，解放军南京军区福州总医院骨一科，福建省福州市 350025
作者简介:邱实，女，1982年生，吉林省长春市人，汉族，博士，技师，主要从事基础医学研究。并列第一作者：李军果，女，1970年生，河北省邯郸市人，汉族，博士，主治医师，主要从事不孕不育、优生优育及辅助生殖技术研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81501024)

Caffeic acid phenethyl ester against cellular injuries in the rotenone-induced Parkinson’s disease model

Qiu Shi¹, Li Jun-guo¹, Qiu Qian², Chen Hui¹, Xiang Zi-min³

¹Land Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100068, China; ²Department of Pneumology and Nephrology, 155 Military Hospital of Chinese PLA, Kaifeng 475003, Henan Province, China; ³First Department of Orthopedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China

Revised:2016-07-08 Online:2016-09-30 Published:2016-09-30
Contact: Xiang Zi-min, Associate chief physician, First Department of Orthopedics, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China
About author:Qiu Shi, M.D., Technician, Land Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100068, China Li Jun-guo, M.D., Attending physician, Land Force General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100068, China Qiu Shi and Li Jun-guo contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81501024

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

鱼藤酮：作为一种植物来源的杀虫剂，能激活脑内行使炎症反应功能的小胶质细胞，形态上变为阿米巴样并释放炎症因子，造成多巴胺能神经元的特异性损伤，诱发帕金森病样症状，因此可用于模拟帕金森病病理过程的动物和细胞模型。

咖啡酸苯乙酯：具有抗氧化和抗癌作用，是蜂胶中的主要活性成分，已成为近年来国内外蜂胶活性成分研究的一大热点。另外，咖啡酸苯乙酯可抑制大鼠脑损伤后的脂质过氧化和脑损伤，Michaluar等研究表明，咖啡酸苯乙酯还可抑制炎症递质白三烯的合成，而5-脂氧酶是合成主要炎症递质-白三烯类的关键限速酶。但在帕金森细胞模型中，5-脂氧酶和白三烯的变化规律，以及咖啡酸苯乙酯是否通过抑制鱼藤酮诱导的5-脂氧酶和白三烯变化而发挥对帕金森样损伤的保护作用，仍有待进一步研究。

摘要

背景：咖啡酸苯乙酯可抑制大鼠脑损伤后的脂质过氧化和脑损伤，但是在帕金森细胞模型中，5-脂氧酶和白三烯的变化规律，以及咖啡酸苯乙酯是否通过抑制鱼藤酮诱导的5-脂氧酶和白三烯变化而发挥对帕金森样损伤的保护作用，仍有待进一步研究。

目的：探讨咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的保护作用，同时观察5-脂氧酶是否参与帕金森细胞模型的损伤。

方法：①取生长状态良好的PC12细胞，分5组培养，分别以0，0.01，0.1，1，10 μmol/L鱼藤酮干预，24，48 h后，观察细胞形态及活性变化，选择最佳诱导帕金森细胞模型的鱼藤酮浓度；24 h后，Western法检测5-脂氧酶表达，ELISA法检测半胱氨酰白三烯生成释放量；②取生长状态良好的PC12细胞，分6组培养，以正常培养的细胞为空白对照，其余5分别加入0，0.01，0.1，1，10 μmol/L咖啡酸苯乙酯预处理30 min，之后加入1 μmol/L鱼藤酮，24 h后，检测细胞活性，ELISA法检测半胱氨酰白三烯生成释放量。

结果与结论：①0.1-10 μmol/L鱼藤酮可诱导PC12细胞损伤，1 μmol/L鱼藤酮处理24 h后的细胞形态和细胞存活率变化适度明显，所以选择该条件作为鱼藤酮诱导PC12细胞帕金森样损伤的细胞模型；②鱼藤酮呈浓度依赖性增加5-脂氧酶的表达与半胱氨酰白三烯的生成释放；③1-10 μmol/L 咖啡酸苯乙酯可降低鱼藤酮诱导的PC12细胞半胱氨酰白三烯生成释放量增加，呈浓度依赖性抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞存活率降低；④结果表明，5-脂氧酶参与鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的损伤作用，咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的损伤有明显保护作用。

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ORCID: 0000-0002-0402-139X(邱实)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 咖啡酸苯乙酯, 帕金森病, 鱼藤酮, PC12细胞, 5-脂氧酶, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) can inhibit lipid peroxidation after rat brain injury. However, the trend of 5-lipoxygenaseis (5-LOX) and cysteinyl leukotrienes (CysLTs) in model of Parkinson’s disease, and whether CAPE protects against rotenone-induced cellular injuries by inhibiting the levels of 5-LOX and CysLTs still need further research.

OBJECTIVE: To investigate the protective effect of CAPE on the rotenone-induced Parkinson-like injury, and to determine whether 5-LOX involved.

METHODS: (1) PC12 cells in good-growth were collected and divided into five groups cultured with different concentrations of rotenone (0, 0.01, 0.1, 1, 10 μmol/L). 24 and 48 hours later, changes of cellular morphology and activity were observed to single out the optimum concentration of rotenone; at 24 hours, the levels of 5-LOX and CysLTs were detected by western blotting and ELISA, respectively. (2) PC12 cells were pretreated with different concentrations of CAPE (0, 0.01, 0.1, 1, 10 µmol/L) for 30 minutes, and 1 µmol/L rotenone was then added. The other cells received no intervention as blank control group. Subsequently, the cell activity was detected, and the CysLTs production was detected by ELISA at 24 hours.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Rotenone (0.1-10 μmol/L) could induce PC12 cell injury with overt morphological and cell activity changes at 24 hours, especially the 1 µmol/L rotenone. (2) Rotenone also significantly increased the 5-LOX expression and CysLTs production in a concentration-dependant manner. (3) CAPE (1-10 μmo/L) significantly attenuated rotenone-induced CysLTs production and cell viability reduction in a concentration-dependant manner. (4) These results suggest that CAPE protects against PC12 cell injuries in the model rat with Parkinson’s disease induced by rotenone involving 5-Lox.

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Key words: Rotenone, Parkinson Disease, PC12 Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

邱实，李军果，邱倩，陈辉，相子民. 咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的保护[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 5979-5985.

Qiu Shi1, Li Jun-guo1, Qiu Qian2, Chen Hui1, Xiang Zi-min3. Caffeic acid phenethyl ester against cellular injuries in the rotenone-induced Parkinson’s disease model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(40): 5979-5985.

图/表（结果） 5

2.1 鱼藤酮诱导后PC12细胞形态的变化 光镜下观察正常贴壁培养的PC12细胞大小均一，长梭形细胞样，可见细胞分裂增殖。将细胞接种于96孔板，贴壁培养 24 h后，用鱼藤酮处理PC12细胞24，48 h，倒置显微镜普通光可见，随着鱼藤酮浓度的逐渐升高，PC12细胞逐渐出现了包括细胞突起缩短和包体变圆的形态学变化，并且细胞增殖速度减慢，高浓度鱼藤酮(10 μmol/L)作用后，PC12细胞出现了较多细胞核固缩、细胞边缘不规则、甚至坏死漂起，并且在同一浓度下，处理时间越长细胞形态变化越明显，见图1。因此，鱼藤酮作用后PC12细胞有不同程度的形态学损伤。

2.2 鱼藤酮诱导PC12细胞活性的变化 MTT结果显示不同浓度鱼藤酮处理后，PC12存活率逐渐降低，并且这种趋势呈现出时间和浓度依赖性。在鱼藤酮作用24 h后，PC12存活率在0.1 μmol/L这个浓度开始出现明显下降(P < 0.05)，0.01，0.1，1，10 μmol/L这4个浓度的PC12细胞存活率依次降低至对照组的94%、89%﹑74%﹑68%；鱼藤酮处理48 h后，PC12细胞存活率则从0.01 μmol/L开始就明显下降(P < 0.01)，0.01，0.1，1，10 μmol/L这4个浓度的PC12细胞存活率分别降至对照组的89%﹑71%﹑58%﹑51%，见图2。
经反复验证综合考虑，实验认为鱼藤酮1 μmol/L处理24 h后的PC12细胞形态和细胞存活率变化适度明显，所以选择该条件作为鱼藤酮诱导的PC12细胞帕金森样损伤的细胞模型。

2.3 咖啡苯乙酯的保护作用 不高于10 μmol/L的咖啡酸苯乙酯对正常PC12细胞的形态、活性和增殖能力没有显著影响(实验结果未在文中显示)。MTT结果表明：咖啡酸苯乙酯在1-10 μmol/L范围内呈浓度依赖性减轻鱼藤酮诱导的PC12细胞存活率降低，但不能完全恢复细胞存活性，见图3。

2.4 鱼藤酮诱导PC12细胞5-脂氧酶蛋白表达的变化 PC12细胞表达5-脂氧酶且条带在72 000与大鼠脑组织的条带位置一致；在1，10 μmol/L 鱼藤酮处理24 h后，PC12细胞5-脂氧酶蛋白表达与对照组相比明显升高 (P < 0.01)并有浓度依赖性，见图4。

2.5 鱼藤酮诱导PC12细胞半胱氨酰白三烯生成释放的变化 0，1，10 μmol/L鱼藤酮作用24 h后，PC12细胞生成的半胱氨酰白三烯分别为130，286，357 ng/g。经统计学分析，1，10 μmol/L鱼藤酮可使PC12细胞生成的半胱氨酰白三烯量较对照组明显增加(P < 0.01)，且半胱氨酰白三烯生成释放的增加与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤呈正相关。

2.6 咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导的PC12细胞半胱氨酰白三烯生成释放的作用 0，1，10 μmol/L咖啡酸本乙酯预处理30 min后加1 μmol/L鱼藤酮作用24 h，PC12细胞生成的半胱氨酰白三烯分别为(286±32)，(165± 14)，(209±31) ng/g。咖啡酸苯乙酯 1，10 µmol/L预给药30 min可明显降低鱼藤酮诱导的PC12细胞半胱氨酰白三烯生成释放量的增高(P < 0.01)，但不能降低至空白对照组的水平(130±21) ng/g(P < 0.05，P < 0.01)。

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引言

帕金森病常见于中老年人，在中国65岁以上的人群中发病率约为2%，是第二大常见神经系统退行性疾病。随着中国老龄化进程的加快，帕金森患病率的逐年增高，依据流行病调查的结果中国已有超过200万帕金森病患者，给家庭和社会造成了巨大的负担^[1-5]。帕金森病主要的病理改变为黑质纹状体多巴胺能神经元逐渐死亡和丢失，胞质内出现路易小体，产生运动迟缓、强直、持续震颤等不同程度的临床表现^[6-9]。目前帕金森病主要采用左旋多巴替代治疗方案，这种方案不仅不能阻止帕金森病的进展，反过来却降低了患者自身的多巴胺能神经元分泌能力，使病情进一步恶化^[10-12]。越来越多的学者发现，除氧化应激、兴奋毒性、氧自由基、神经营养缺乏等因素外，神经性炎症可明显促进帕金森病的进展，抑制神经炎症、保护帕金森病患者的多巴胺神经元丢失，已成为帕金森病治疗的新方向^[13-15]。

鱼藤酮作为一种植物来源的杀虫剂，能激活脑内行使炎症反应功能的小胶质细胞，形态上变为阿米巴样并释放炎症因子，造成多巴胺能神经元的特异性损伤，诱发帕金森病样症状，因此可用于模拟帕金森病病理过程的动物和细胞模型^[16]。高分化PC12细胞是一种来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞的细胞株，它能分泌多巴胺并具有神经元的特性，因此被广泛用于神经药理学等研究^[17]。文献报道，体内研究发现鱼藤酮可导致实验动物出现帕金森病样改变，体外研究发现用适量浓度的鱼藤酮处理PC12细胞，也可明显降低细胞络氨酸羟化酶表达^[18-20]。

咖啡酸苯乙酯具有抗氧化和抗癌作用，是蜂胶中的主要活性成分，已成为近年来国内外蜂胶活性成分研究的一大热点^[21]。另外，咖啡酸苯乙酯可抑制大鼠脑损伤后的脂质过氧化和脑损伤^[22]，Michaluar等研究表明，咖啡酸苯乙酯还可抑制炎症递质白三烯的合成，而5-脂氧酶是合成主要炎症递质白三烯类的关键限速酶^[23]。但在帕金森细胞模型中，5-脂氧酶和白三烯的变化规律，以及咖啡酸苯乙酯是否通过抑制鱼藤酮诱导的5-脂氧酶和白三烯变化而发挥对帕金森样损伤的保护作用，仍有待进一步研究。研究首次使用咖啡酸苯乙酯抑制帕金森细胞模型的损伤，用不同浓度的鱼藤酮诱导PC12细胞作为帕金森模型，采用细胞形态观察、细胞活性检测、5-脂氧酶蛋白表达、5-脂氧酶产物含量，观察咖啡酸苯乙酯对5-脂氧酶和白三烯的影响。探讨5-脂氧酶是否参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤作用，以及咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导的PC12细胞帕金森样改变的保护作用及这种作用的主要机制。

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材料方法

1.1 造模材料 高分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12(中科院上海细胞所)。

1.2 造模方法

细胞培养：实验使用第10-20代的PC12细胞。①细胞复苏：将从液氮中取出的冻存管放入37 ℃水浴锅中快速解冻，然后在生物安全柜中将细胞移入15 mL离心管中，之后放入离心机中，1 000 r/min离心5 min，弃上清。将5 mL含体积分数10%胎牛血清的培养液加入后重悬，移入培养瓶，放入体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h后换液；②传代：细胞长至80%-90%汇合度时，先把培养液吸出后，用PBS轻轻洗1遍细胞，然后用0.25%胰酶消化3 min，待细胞完全消化后用含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化，离心后弃上清。重悬后按6×10⁷ L^-1的细胞浓度铺板，视细胞状态在24 h或48 h后用药物进行处理；③冻存：将生长状态较好的PC12细胞用胰酶消化后，离心弃上清，按2×10⁸ L^-1的浓度重悬在冻存液中(体积分数20%胎牛血清+70% DMEM+10%DMSO)，之后分装至冻存管中，标明冻存日期代数和细胞种类，放入冻存盒之后置-80 ℃冰箱内过夜，最后移入液氮罐中长期保存。

细胞损伤诱导及形态观察：将PC12细胞按6×10⁷ L^-1的细胞浓度种于培养板中，待细胞贴壁24 h后：①将种好的96孔板除去边缘孔外，分5组培养，每组6孔，分别以0(对照)，0.01，0.1，1，10 μmol/L鱼藤酮干预，24，48 h后，在倒置显微镜、光镜下观察观察细胞形态变化，MTT法检测细胞活性，选择最佳诱导帕金森细胞模型的鱼藤酮浓度；②将种好的96孔板除去边缘孔外，分6组培养，以正常培养的细胞为空白对照，其余5分别加入0(对照)，0.01，0.1，1，10 μmol/L咖啡酸苯乙酯预处理30 min，之后加入1 μmol/L鱼藤酮处理24 h，MTT法检测细胞活性；③将种好的6孔板分3组培养，分别以0(对照)，1，10 μmol/L鱼藤酮干预24 h，采用Western blotting方法检测5-脂氧酶蛋白的表达；④将种好的24孔板分3组培养，每组6孔，分别以0(对照)，1，10 μmol/L鱼藤酮干预24 h，采用ELISA方法检测半胱氨酰白三烯生成释放量；⑤将种好的24孔分4组培养，分别以0(对照)，1，10 μmol/L 咖啡酸苯乙酯预处理30 min，之后补加1 μmol/L鱼藤酮，并设置空白对照组，24 h后采用ELISA法检测半胱氨酰白三烯生成释放量。

1.3 主要观察指标

MTT检测细胞活性：在药物处理终止时间点时，在96孔板细胞每孔加入100 µL MTT液(0.5 g/L，溶于DMEM)，之后放在体积分数5%CO₂、37 ℃的培养箱里。2-4 h后，用排枪将孔板中的液体吸出，之后加入DMSO 100 μL，随后在振荡器上充分振荡3 min。在570 nm波长处用酶标仪检测样品的吸光度A值。A值大小反映细胞的存活数，每次实验均设有对照组，细胞存活率(%)= A_实验组/A_对照组×100%。

5-脂氧酶表达的检测：Western blotting测定5-脂氧酶蛋白表达，以常规方法提取PC12细胞的总蛋白。提完4 ℃离心后，将蛋白30 μL每管分装，放入-80 ℃冰箱储存。用5-脂氧酶抗体(1∶800)进行Western blotting检测，观察鱼藤酮作用前后5-脂氧酶在PC12细胞上的表达变化，以GAPDH为内参(小鼠单克隆抗体1∶5 000)；结果以5-脂氧酶和GAPDH 的条带吸光度比值表示，每个浓度重复4次，取均值进行统计分析；用大鼠脑组织作为阳性对照。

半胱氨酰白三烯测定：PC12细胞经过药物处理后，取100 μL上清液，4 ℃离心5 min，之后放置-80 ℃冰箱保存，按试剂盒说明书进行白三烯浓度测定。药物处理后的细胞使用0.1 mol/L的NaOH溶解，之后检测蛋白浓度，计算出每孔中蛋白总量。根据测得的蛋白总量，计算单位蛋白释放出的半胱氨酰白三烯浓度。

1.4 统计学分析 计量数据用x(_)±s表示，用SPSS 19.0作统计学处理，认为P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

鱼藤酮是一种杀虫剂，可以抑制线粒体膜蛋白复合物Ⅰ，引起多巴胺能神经元特异性损伤和多巴胺的分泌量下降，是目前研究中复制帕金森模型的理想工具。它可已通过阻断电子从NADPH向CoA的传递，从而产生细胞毒性。PC12因为在形态、生化、生理功能等方面同神经细胞类似，逐渐成为目前使用广泛的研究神经细胞的工具细胞之一。PC12细胞质因富含合成多巴胺的酶(单胺氧化酶和络氨酸羟化酶)，这种功能与多巴胺能神经元非常接近^[24]。因此，研究选择合适浓度的鱼藤酮处理PC12细胞作为模拟帕金森病病理过程的细胞模型，研究咖啡酸苯乙脂的神经保护作用并对这种保护作用的机制进行探讨。

实验结果表明，0.1-10 μmol/L鱼藤酮作用24 h和48 h，可规律性地改变PC12细胞形态，降低PC12细胞存活率，并且这种变化呈现出时间和浓度依赖性，成功模拟了帕金森细胞模型。选定1 μmol/L 鱼藤酮作用PC12细胞24 h作为后续的造模条件，这一条件与文献报道基本一致^[16^，^24-25]。研究中发现咖啡酸苯乙酯可减轻鱼藤酮作用后的PC12细胞损伤，并且这种保护作用在0.1-10 μmol/L的浓度范围内呈现出浓度依赖性。依据这一结果推测，咖啡酸苯乙酯可能通过某种机制保护鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤。

之前的文献表明，在脑缺血损伤后，PC12细胞的5-脂氧酶的酶活性和蛋白表达量都比对照组增高，其产物半胱氨酰白三烯的释放量也比对照组明显升高；使用抑制剂(齐留通)后可减轻PC12细胞的脑缺血损伤^[26-29]。作者此次研究中，在不同浓度的鱼藤酮作用PC12细胞24 h后，5-脂氧酶的代谢产物半胱氨酰白三烯的生成释放增加，这些结果与文献报道一致^[30-34]。研究创新性地使用咖啡酸苯乙酯，探讨咖啡酸苯乙酯对PC12细胞帕金森样变化的作用，以及咖啡酸苯乙酯的作用靶点，期望对帕金森药物研究做出贡献。实验结果表明，咖啡酸苯乙酯在1-10 μmol/L浓度范围内，能明显抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞半胱氨酰白三烯生成释放增加，进而减轻细胞损伤，因此推测咖啡酸苯乙酯或许可作为炎症反应过程中关键酶5-脂氧酶的抑制剂，通过抑制5-脂氧酶的活性，抑制半胱氨酰白三烯生成释放的增加，抑制帕金森样改变中的炎症反应，减轻神经元损伤。

总之，研究在帕金森病的细胞模型中证明，鱼藤酮可成功诱导PC12细胞的帕金森样改变，且5-脂氧酶参与了这种变化；咖啡酸苯乙酯减轻鱼藤酮诱导的PC12细胞帕金森样损伤，其机制可能与抑制炎症反应过程的关键酶5-脂氧酶酶活性和炎症递质半胱氨酰白三烯生成释放有关，其可作为5-脂氧酶的抑制剂。为了进一步证明此观点，在今后的研究中需要对帕金森模型的5-脂氧酶激活及咖啡酸苯乙酯的抑制作用机制进一步探讨。咖啡酸苯乙酯有望成为治疗和预防帕金森氏病的临床药物^[35-38]。

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咖啡酸苯乙酯对鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的保护

Caffeic acid phenethyl ester against cellular injuries in the rotenone-induced Parkinson’s disease model

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