注射型猪小肠黏膜下层与脂肪间充质干细胞的体外共培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.016

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (38): 5730-5736.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.016

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注射型猪小肠黏膜下层与脂肪间充质干细胞的体外共培养

郭杏¹，周虹¹，李丹¹，高小春¹，代蕾¹，黄海俊¹，谭美云²

西南医科大学附属医院，¹整形烧伤科，²骨与关节外科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2016-08-19 出版日期:2016-09-16 发布日期:2016-09-16
通讯作者: 谭美云，副教授，西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000
作者简介:郭杏，女，1977年生，四川省宜宾市人，汉族，2006年西南医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事干细胞与组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31271049)

Injectable small intestinal submucosa is co-cultured with adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro

Guo Xing¹, Zhou Hong¹, Li Dan¹, Gao Xiao-chun¹, Dai Lei¹, Huang Hai-jun¹, Tan Mei-yun²

¹Department of Plastic and Burn Surgery, ²Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2016-08-19 Online:2016-09-16 Published:2016-09-16
Contact: Tan Mei-yun, Associate professor, Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Guo Xing, Master, Associate chief physician, Department of Plastic and Burn Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31271049

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
猪小肠黏膜下层：是近年来利用物理和化学的方法处理而获取的脱细胞天然细胞外基质。它可为细胞贴附生长提供一个良好的微环境，因为它经脱细胞处理后仍保留有纤维粘连蛋白、糖胺聚糖、生长因子等，而纤维粘连蛋白和糖胺聚糖在细胞与细胞和细胞与细胞外基质黏附中产生积极的影响，而生长因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α，能够促进细胞的增殖和组织的生长。
脂肪间充质干细胞：首先由Zuk等在2001年研究发现，具有很强的增殖与自我更新能力，其不但取材便捷、来源广泛、不易老化、体外扩增迅速，而且能分泌各种生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子、角化细胞生长因子、转化生长因子β1、肝细胞生长因子等，在组织工程中可成为优势种子细胞。

背景：经脱细胞处理的猪小肠黏膜下层是一种具有生物活性的细胞外基质，主要由胶原、糖蛋白、蛋白多糖等组成，富含胶原、氨基葡聚糖和各种生长因子，这些组分在促进组织细胞的分化和快速增殖中发挥了重要作用。
目的：制备可注射型猪小肠黏膜下层，观察其与大鼠脂肪间充质干细胞的体外共培养情况。
方法：制备可注射型猪小肠黏膜下层与SD大鼠脂肪间充质干细胞。①CCK-8法检测细胞增殖：将第3代脂肪间充质干细胞接种到可注射型猪小肠黏膜下层上(实验组)，以正常培养的细胞为对照组，培养1，3，5，7 d观察细胞增殖；②Live/dead染色法检测细胞存活：分别以猪小肠黏膜下层浸提液(实验组)与完全培养基培养(对照组)第3代脂肪间充质干细胞，培养1，3，5，7 d观察细胞存活。
结果与结论：①扫描电镜观察结果：脂肪间充质干细胞能在材料上很好黏附，呈椭圆形和条索状生长；②细胞增殖结果：实验组培养1，5 d的细胞A值高于对照组(P < 0.05)；③细胞存活：随时间延长，两组中细胞数量均呈上升趋势，共培养第1天时，两组细胞基本全部存活，随后可见两组均有死细胞出现，两组死细胞数在各时间点无明显差别；④结果表明：可注射型猪小肠黏膜下层具有良好的细胞相容性。

ORCID: 0000-0001-5764-3128(谭美云)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 可注射支架材料, 猪小肠黏膜下层, 脂肪间充质干细胞, 脂肪组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The decellularized porcine small intestinal submucosa is a kind of bioactive extracellular matrix, which is mainly composed of collagen, glycoprotein, proteoglycan and rich in collagen, glycosaminoglycan and various growth factors, and these components play an important role in promoting the differentiation and proliferation of tissue cells.
OBJECTIVE: To prepare the injectable small intestinal submucosa and to investigate its co-culture with rat adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: The injectable small intestinal submucosa and rat adipose-derived stem cells were prepared. Cell counting kit-8 test for cell proliferation: Passage 3 adipose-derived stem cells were seeded onto the injectable small intestinal submucosa (experimental group) and cells cultured under normal condition as control group. The cell proliferation was observed at 1, 3, 5 and 7 days of incubation. Live/dead staining test for the survival of cells: Passage 3 adipose-derived stem cells were respectively cultured in the injectable small intestinal submucosa extracts (experimental group) and complete culture medium (control group). Cell survival was determined at 1, 3, 5 and 7 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Scanning electron microscope oval and strip adipose- derived stem cells adhered onto the material. The absorbance values in the experimental group were higher than those in the control group at 1 and 5 days of incubation (P < 0.05). Cell survival: The number of cells appeared to be in a rising trend with time in both two groups; after 1-day co-culture, all cells in the two groups survived. Then dead cells appeared in both two groups, showing no significant difference. These results show that the injectable small intestinal submucosa exhibits a good cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Extracellular Matrix, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郭杏，周虹，李丹，高小春，代蕾，黄海俊，谭美云. 注射型猪小肠黏膜下层与脂肪间充质干细胞的体外共培养[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(38): 5730-5736.

Guo Xing, Zhou Hong, Li Dan, Gao Xiao-chun, Dai Lei, Huang Hai-jun, Tan Mei-yun.

Injectable small intestinal submucosa is co-cultured with adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(38): 5730-5736.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪间充质干细胞的形态及鉴定脂肪间充质干细胞呈贴壁生长，贴壁后的细胞呈长梭形、三角形和鱼群样生长，P3代细胞已足够纯化，约不到1 h时即贴壁，生长增殖迅速，形态均一，呈现明显的鱼群和旋涡状生长，肉眼观已无杂质和脂滴漂浮，见图1；P3代脂肪间充质干细胞表面标志物CD29、CD90阳性表达，表达率分别为95.12%、98.76%；CD45、CD31阴性表达，表达率分别为0.18%、0.20%，见图2。

2.2 注射型猪小肠黏膜下层的苏木精-伊红染色、扫描电镜情况及与细胞复合情况猪小肠黏膜下层冻干处理后呈白色半透明薄片状，-198 ℃下球磨仪研磨成粉末状后再经3%醋酸和0.1%胃蛋白酶的水溶液脱细胞处理，最终冷冻干燥后呈白色粉末状，见图3A；苏木精-伊红染色显示，无蓝染的细胞核及残留细胞与细胞碎片，见图3B；扫描电镜下观察，注射型猪小肠黏膜下层有较多大小不一的三维孔隙，纤维较为完整，见图3C；脂肪间充质干细胞能在材料上很好地黏附，呈椭圆形和条索状生长，箭头所指即为黏附在材料上的细胞，见图3D。

2.3 CM-DiI标记脂肪间充质干细胞及与材料共培养情况 CM-DiI标记脂肪间充质干细胞的细胞膜和细胞质，见图4A；倒置相差显微镜显示，注射型猪小肠黏膜下层在完全培养基中呈半透明团簇状，见图4B；荧光显微镜观察显示，脂肪间充质干细胞在注射型猪小肠黏膜下层上很好地黏附生长，呈椭圆形、长梭形、多角形，见图4C。

2.4 脂肪间充质干细胞增殖情况细胞与材料共培养后的第1，3，5天，实验组与对照组A值逐渐增加，实验组第1，5天A值高于对照组(P < 0.05)；第7天时两组A值呈下降趋势，两组间A值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1，图5。

2.5 Live/Dead 染色检测细胞在材料浸提液中的存活情况荧光显微镜观察培养后第1，3，5，7天的图像，显示随时间延长，两组中细胞数量均呈上升趋势，共培养第1天时，两组细胞基本全部存活，随着培养时间的增加，可见两组均有死细胞出现，但此时活细胞数量也逐渐增加。第1天时实验组和对照组死细胞比例分别为1.8%和1.5%，第3天时两组死细胞比例分别为2.1%和1.6%，第5天时两组死细胞比例分别为2.5%和2.4%，第7天时两组死细胞比例分别为3.9%和3.6%，两组各时间点死细胞数比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

参考文献

[1]Wilson A,Butler PE,Seifalian AM.Adipose-derived stem cells for clinical applications: A review.Cell Prolif. 2011; 44(1):86-98.
[2]Hong SJ,Jia SX,Xie P,et al.Topically delivered adipose derived stem cells show an activated-fibroblast phenotype and enhance granulation tissue formation in skin wounds. PloS One.2013;8(1):e55640.
[3]Dong Y,Hassan WU,Kennedy R,et al.Performance of an in situ formed bioactive hydrogel dressing from a peg-based hyperbranched multifunctional copolymer.Acta Biomaterialia. 2014;10(5):2076-2085.
[4]Gugerell A,Neumann A,Kober J,et al.Adipose-derived stem cells cultivated on electrospun l-lactide/glycolide copolymer fleece and gelatin hydrogels under flow conditions-aiming physiological reality in hypodermis tissue engineering. Burns.2015;41(1):163-171.
[5]Haubner F,Gassner HG.Potential of adipose-derived stem cells concerning the treatment of wound healing complications after radiotherapy. HNO. 2015;63(2): 111-117.
[6]Ozpur MA,Guneren E,Canter HI,et al.Generation of skin tissue using adipose tissue-derived stem cells. Plast Reconstr Surg.2016;137(1):134-143.
[7]Shalaby SM,Sabbah NA,Saber T,et al.Adipose-derived mesenchymal stem cells modulate the immune response in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis model.IUBMB Life.2016;68(2): 106-115.
[8]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.Tissue Eng.2001;7(2):211-228.
[9]Park BS,Jang KA,Sung JH,et al.Adipose-derived stem cells and their secretory factors as a promising therapy for skin aging.Dermatol Surg. 2008;34(10):1323-1326.
[10]Taha MF,Hedayati V.Isolation, identification and multipotential differentiation of mouse adipose tissue-derived stem cells.Tissue Cell. 2010;42(4): 211-216.
[11]Gimble JM,Katz AJ,Bunnell BA.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.Circ Res.2007;100(9): 1249-1260.
[12]Yamane S,Iwasaki N,Majima T,et al.Feasibility of chitosan-based hyaluronic acid hybrid biomaterial for a novel scaffold in cartilage tissue engineering. Biomaterials. 2005;26(6):611-619.
[13]Lutolf MP,Hubbell JA.Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.Nat Biotechnol. 2005;23(1):47-55.
[14]Shi L,Ronfard V.Biochemical and biomechanical characterization of porcine small intestinal submucosa (sis): A mini review.Int J Burns Trauma.2013;3(4): 173-179.
[15]Davies OG,Cooper PR,Shelton RM,et al.Isolation of adipose and bone marrow mesenchymal stem cells using cd29 and cd90 modifies their capacity for osteogenic and adipogenic differentiation.J Tissue Eng.2015;6:2041731415592356.
[16]Nie C,Yang D,Xu J,et al.Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis.Cell Transplant.2011;20(2):205-216.
[17]Kang KN,Kim da Y,Yoon SM,et al.In vivo release of bovine serum albumin from an injectable small intestinal submucosa gel.Int J Pharm.2011;420(2): 266-273.
[18]Kim K,Kim MS.An injectable hydrogel derived from small intestine submucosa as a stem cell carrier.J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2015.doi: 10.1002/jbm.b.33504. [Epub ahead of print]
[19]Guo X,Xia B,Lu XB,et al.Grafting of mesenchymal stem cell-seeded small intestinal submucosa to repair the deep partial-thickness burns.Connect Tissue Res. 2016:1-10.
[20]Cowles EA,Brailey LL,Gronowicz GA. Integrin-mediated signaling regulates ap-1 transcription factors and proliferation in osteoblasts. J Biomed Mater Res.2000;52(4):725-737.
[21]Andree B,Bar A,Haverich A,et al.Small intestinal submucosa segments as matrix for tissue engineering: Review.Tissue Eng Part B Rev.2013;19(4):279-291.
[22]杨浩,吴迪,李世和,等.猪小肠黏膜下层基质支架材料复合脂肪基质干细胞的生物相容性[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(3):415-418.
[23]房艳,倪伟民,单伟,等.海绵状的小肠粘膜下层促进成骨样细胞增殖分化[J].中国生物工程杂志,2013,33(6):18-23.
[24]田伟,王效杰.猪小肠黏膜下层海绵的三维重建、表面修饰和细胞黏附性[J].中国老年学杂志, 2014,34(14):3949- 3951.
[25]Choi JW,Park JK,Chang JW,et al.Small intestine submucosa and mesenchymal stem cells composite gel for scarless vocal fold regeneration.Biomaterials. 2014;35(18):4911-4918.
[26]Zonari A,Martins TM,Paula AC,et al. Polyhydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate structures loaded with adipose stem cells promote skin healing with reduced scarring.Acta Biomaterialia. 2015;17: 170-181.
[27]Zeng Y,Zhu L,Han Q,et al.Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing.Acta Biomaterialia. 2015;25: 291-303.
[28]Kono H,Teshirogi T.Cyclodextrin-grafted chitosan hydrogels for controlled drug delivery.Int J Biol Macromol. 2015;72:299-308.
[29]Kwon JS,Yoon SM,Shim SW,et al.Injectable extracellular matrix hydrogel developed using porcine articular cartilage.Int J Pharm.2013;454(1):183-191.
[30]Naderi-Meshkin H,Andreas K,Matin MM,et al. Chitosan-based injectable hydrogel as a promising in situ forming scaffold for cartilage tissue engineering. Cell Biol Int.2014;38(1):72-84.

引言

材料方法

1.1 设计体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015-11-01/2016-05-21在西南医科大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：4只6周龄雄性SPF级SD大鼠，体质量150-180 g，由西南医科大学实验物中心提供，生产许可证：SCXK(川)2013-17，使用许可证：SYXK(川) 2013-181。实验过程对动物处置符合动物伦理学要求。猪新鲜近端空肠由泸州市肉联加工厂提供。

主要试剂及仪器：DMEM/F12培养基(HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CD29、CD90、CD34、CD45、CD31抗体、流式细胞仪(BD公司)；CM-DiI、Live/dead染色试剂盒(美国Molecular Probe公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学)；生物安全柜(Telstar Bio ⅡA，西班牙)；酶标仪、CO₂培养箱(Thermo公司)；扫描电镜(Cambridge S-250，Britain)；球磨仪(德国Retsch公司)。

1.4 实验方法

脂肪间充质干细胞的分离、培养及传代^[4，7，15]：将SD大鼠麻醉后，无菌条件下切取两侧腹股沟处皮下脂肪组织，PBS中反复冲洗3次，剔除血管和筋膜后将其剪碎至糊状，用0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃恒温水浴中震荡消化 60 min，期间反复震荡混匀，加入等量完全培养基终止消化，200目滤网过滤去除杂质，1 500 r/min离心10 min，弃上清和上层脂肪液，PBS吹打混匀后1 000 r/min离心 5 min，再次弃上清，最后加入完全培养基重悬吹打混匀，以5×10⁸ L^-1细胞浓度接种，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。24 h后更换培养基1次，以后每二三天换液1次。6-8 d细胞可达80%-90%融合，用0.25%浓度的胰蛋白酶进行消化，按1∶3的比例进行传代，之后三四天可传1代，至第3代(P3)时细胞已足够纯化，选取P3-P5代细胞用于实验。

脂肪间充质干细胞的流式细胞鉴定^[3，15-16]：取P3代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，将细胞浓度调整为1×10⁹ L^-1，PBS清洗细胞后，与饱和浓度的CD29-APC、CD90-PE-Cy7、CD45-PerCP、CD31-PE抗体室温避光反应20 min，PBS重悬后，上流式细胞仪检测。

CM-DiI荧光标记脂肪间充质干细胞：先将CM-DiI与PBS液配成浓度为4 mg/L的工作液，再将细胞按照1×10⁶细胞数重悬于1 mL CM-DiI工作液中，将其置于 37 ℃ 20 min， 4 ℃ 15 min。荧光显微镜观察细胞的荧光标记情况。

注射型猪小肠黏膜下层的制备^[17-18]：取健康新鲜的猪近端空肠，生理盐水反复冲洗干净，挑选管腔粗细均匀且无淋巴结的部位，将其截取为多个长度为10 cm左右的肠断。将肠管纵向剖开，清洁纱布反复擦拭去除肠壁的黏膜层，翻转小肠利用同样的方法去除浆膜层和肌层。生理盐水再次反复冲洗，洗净小肠黏膜下层，完全去除小肠黏膜下层上的残留组织。接下来用冷冻干燥机-80 ℃冷冻干燥48 h，在-198 ℃下用冷冻球磨仪将干燥的猪小肠黏膜下层研磨成10-20 μm的粉末，再将其置于含3%醋酸和0.1%胃蛋白酶的水溶液中连续震荡搅拌48 h，用碳酸氢钠调节pH值为中性。再将中性水溶液冷冻风干成最后的粉末，并用环氧乙烷消毒，最后可用PBS配成注射型猪小肠黏膜下层。

猪小肠黏膜下层材料浸提液的制备：参照GB/T16886.12-2000所规定的浸提液制备方法，在无菌条件下，将完全培养基(浸提介质)加入盛有粉末状猪小肠黏膜下层材料的孔板中，设置材料/浸提介质比例为 0.1 g/mL，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中孵育24 h后，提取孔板中的液体，即可得100%浓度的浸提液。

注射型猪小肠黏膜下层的苏木精-伊红染色及扫描电镜观察：将注射型猪小肠黏膜下层分为2部分，一部分浸入体积分数10%新鲜甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，常规切片，脱蜡后行苏木精-伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，照相；另一部分用预冷的2.5%戊二醛固定24 h，PBS清洗，梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察摄片。

CM-DiI标记后的细胞与猪小肠黏膜下层共培养：取6孔板1个，将以CM-DiI标记后的脂肪间充质干细胞按1×10⁹ L^-1的细胞浓度接种到猪小肠黏膜下层浸提液中，荧光显微镜和扫描电镜观察二者复合情况。

CCK-8测细胞增殖：取4块96孔板，每块板分为实验组和对照组，实验组加入注射型猪小肠黏膜下层，对照组加入完全培养基，每组设5个复孔及3个平行对照孔。取生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞，按5× 10⁷ L^-1的细胞浓度接种到各孔中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每2 d换液1次。分别于接种后的第1，3，5，7天取出1块板，吸弃原有培养基，加入无血清培养基100 μL，再加入10 μL CCK-8试剂，放置于 37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内孵育2 h，置酶标仪在450 nm测各孔吸光度值。

Live/Dead染色检测细胞在材料浸提液中的存活情况：取4块6孔板，每块6孔板分为实验组与对照组。将生长状态良好的P3代脂肪间充质干细胞按5×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于各孔中，每孔接种1 mL细胞悬液，4 h待细胞贴壁后吸弃原培养基，实验组每3孔加入100%浓度猪小肠黏膜下层材料浸提液，对照组每3孔加入新鲜的完全培养基，每2 d换液1次。待培养第1，3，5，7天时各取出1块板，吸弃原培养液，PBS轻柔漂洗2次，加入新鲜配置的终浓度为4 μmol/L的eth-d1和2 μmol/L Calcein-AM染液，避光37 ℃孵育30 min后吸弃染液，PBS轻柔漂洗2次。立即于荧光显微镜下观察细胞的发光情况，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。每个时间点分别取孔板的中央和边缘随机3个高倍镜视野观察死细胞数，计算死细胞数/总细胞数比例。

1.5 主要观察指标可注射型猪小肠黏膜下层的细胞相容性。

1.6 统计学分析所得数据采用SPSS 19.0软件包进行统计分析，两组间均数比较采用两独立样本的t 检验，率的比较采用卡方检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前用于组织工程的支架材料主要分为人工合成材料和天然生物材料两种。人工合成材料的生物降解时间、微观结构、整体形态和机械性能等可提前设计和调控，但其不能识别细胞信号，且与细胞间缺乏生物性的相互作用。而天然生物材料具有良好的生物相容性、生物降解性和能够促进细胞黏附生长的生物信号，而且可以较准确地模拟细胞外基质微环境，诱导细胞增殖分化，是理想的组织工程支架材料。猪小肠黏膜下层是近年来利用物理和化学的方法处理而获取的脱细胞天然细胞外基质^[19]。它可为细胞贴附生长提供一个良好的微环境，因为它经脱细胞处理后仍保留有纤维粘连蛋白、糖胺聚糖、生长因子等，而纤维粘连蛋白和糖胺聚糖在细胞与细胞和细胞与细胞外基质黏附中产生积极的影响^[20]，而生长因子，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α能够促进细胞的增殖和组织的生长^[21]。实验将其放入含3%醋酸和0.1%胃蛋白酶的水溶液中连续震荡搅拌48 h，这一脱细胞过程有别于传统的物理化学方法脱细胞^[22]，省去一系列繁琐步骤，将步骤简化，提高了可操作性。近年来，国内外学者对猪小肠黏膜下层均有较多研究，这不仅包括对传统猪小肠黏膜下层膜的研究，还包括对猪小肠黏膜下层进行的改造塑形研究。房艳等^[23]将猪小肠黏膜下层重塑为海绵状猪小肠黏膜下层，将其与人脂肪干细胞复合培养，证明海绵状猪小肠黏膜下层在人脂肪干细胞来源成骨样细胞的增殖及成骨分化方面有明显促进作用。而田伟杰等^[24]将三维重建的猪小肠黏膜下层与骨髓间充质干细胞在体外复合培养，经过一系列的指标检测证明三维重建的猪小肠黏膜下层具有合理的结构和良好的弹性，可作为一种生物学材料。Choi等^[25]将猪小肠黏膜下层改造成注射型猪小肠黏膜下层，并与间充质干细胞混合治疗声带损伤，证明其对无瘢痕声带再生具有促进作用，说明注射型猪小肠黏膜下层能够很好地呈递细胞到达治疗部位，发挥作用。注射型生物材料是近年来研究热点^[26-30]，因为相对于多孔硬支架，注射型生物支架材料可任意塑形且操作简单，可将呈递的细胞快速作用于病灶区，以达到创伤小、恢复快的目的。研究则将猪小肠黏膜下层改造塑形成注射型猪小肠黏膜下层，并将其与脂肪间充质干细胞体外共培养，从体外复合细胞方面探讨其是否具有良好的生物相容性，为进一步临床应用奠定基础和提供依据。

将用CM-DiI标记的大鼠脂肪间充质干细胞与注射型猪小肠黏膜下层共培养，荧光显微镜下可见脂肪间充质干细胞能在注射型猪小肠黏膜下层上很好地黏附生长，扫描电镜观察也可见脂肪间充质干细胞黏附在材料上生长，呈椭圆形和条索状，这都证明注射型猪小肠黏膜下层可为大鼠脂肪间充质干细胞提供一个良好的贴附生长的微环境。材料与细胞共培养的第1，3，5，7天，用CCK-8试剂测得的A值显示，在第1天和第5天实验组细胞A值均大于对照组(P < 0.05)，虽然两组第3，7天比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但实验组细胞的A值是大于对照组细胞的，说明注射型猪小肠黏膜下层对细胞增殖的作用仍是促进的。Live/Dead染色对用100%浓度猪小肠黏膜下层浸提液和完全培养基培养的大鼠脂肪间充质干细胞进行检测，细胞在100%浓度猪小肠黏膜下层浸提液培养下仍可以较好的贴壁生长，形态无明显变化，在第1，3，5，7天这4个时间点死细胞比例与对照组均无明显差别，进一步说明了注射型猪小肠黏膜下层与细胞具有良好的细胞相容性，能促进脂肪间充质干细胞的黏附生长与增殖。

综上所述，注射型猪小肠黏膜与大鼠脂肪间充质干细胞具有良好的细胞相容性，其提供了一种呈递细胞新的注射形式。但研究尚未对注射型猪小肠黏膜下层的孔径大小、孔隙率、亲水性及机械强度这些能反应支架结构和特性的指标进行观察，后期还将结合动物实验这一体内实验来进一步研究。有理由相信注射型猪小肠黏膜下层有望成为脂肪组织工程一种注射型天然生物支架材料。

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[1]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[2]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[3]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[4]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[5]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[6]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[7]	张剑慧, 马贺然, 谭毅, 王芝辉. 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2969-2975.
[8]	高元慧, 向杨, 曹卉, 王顺兰, 郑琳麟, 何浩伟, 张应爱, 张淑芳, 黄邓高. 两种月龄近交系五指山小型猪脂肪间充质干细胞生物学特性的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2988-2993.
[9]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[10]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[11]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[12]	张传辉, 李建军, 杨军. 动态压力对负载胰岛素样生长因子1基因兔脂肪间充质干细胞增殖能力和机械性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1982-1987.
[13]	张晶莹, 孙晓林, 耿立霞. 脂肪间充质干细胞治疗系统性硬化症模型小鼠的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2011-2017.
[14]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[15]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.