血小板纤维蛋白支架对心肌梗死的治疗作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.018

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
血小板纤维蛋白支架：能够从血液中提取，可以代替异体的纤维蛋白胶，其血液收集和制备过程比较简单。血小板纤维蛋白胶呈三维结构，由纤维蛋白形成立体网络状，并且在不同区域纤维蛋白网的疏密状况不同，血小板纤维蛋白支架能够为种子细胞提供比较好的三维立体生存空间，而且能够释放多种细胞因子调节细胞的分化和增殖。
心肌再生生物材料：生物材料的发展为心肌梗死的治疗提供了新的思路，目前已有纤维蛋白胶、基质胶、细胞外基质乳液、藻酸盐等多种生物材料用于心肌再生的治疗，并且取得了一定疗效。用于治疗心肌再生的生物材料需要具备取材简单、制备方便、生物兼容性好、对患者损伤小、并且能够为受到损伤的心肌提供功能和结构上的支持。

背景：生物材料的发展为心肌梗死的治疗提供了新的思路，目前已有纤维蛋白胶、基质胶、细胞外基质乳液、藻酸盐等多种生物材料用于心肌再生的治疗。目前有关血小板纤维蛋白支架治疗心肌梗死的研究不多。
目的：探讨血小板纤维蛋白支架对大鼠心肌梗死的治疗作用。
方法：采用血小板纤维蛋白胶制备血小板纤维蛋白支架。将40只心肌梗死模型大鼠随机分为2组，血小板纤维蛋白支架组在大鼠的梗死心肌四周注射血小板纤维蛋白胶200 μL，对照组在心肌梗死四周相同的位置注射等量的DMEM。检测血小板纤维蛋白支架释放血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1等细胞因子的表达情况，观察血小板纤维蛋白支架植入后心肌梗死大鼠内皮细胞和心肌细胞的生成、心肌细胞凋亡、血管密度及其心脏功能。
结果与结论：①血小板纤维蛋白支架被成功制备，在纤维蛋白支架培养的第14天时血小板纤维蛋白支架释放的血管内皮生长因子为(115.7±19.45) ng/L，肝细胞生长因子为(23.98±12.32) ng/L，胰岛素样生长因子1为(288.4±16.74) ng/L；②血小板纤维蛋白支架组的vWF阳性细胞数及a-SA阳性细胞数均明显高于对照组(P < 0.05)，血小板纤维蛋白支架组的TUNEL阳性细胞数低于对照组(P < 0.05)；③血小板纤维蛋白支架组的毛细血管密度及有血流的毛细血管均明显高于对照组(P < 0.05)；④血小板纤维蛋白支架组的左心室舒张末期容积和左心室收缩末期容积均明显低于对照组(P < 0.05)；⑤结果提示，血小板纤维蛋白支架能够促进内皮细胞、心肌细胞以及毛细血管的生成，改善心脏功能，血小板纤维蛋白支架对心脏的保护作用可能与其分泌的细胞因子有关。

ORCID: 0000-0002-7996-9409(张燕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 血小板纤维蛋白支架, 大鼠, 心肌梗死, 心肌细胞, 内皮细胞, 毛细血管

Abstract:

BACKGROUND: The development of biomaterials provides a new idea for myocardial infarction treatment, and so far there are numerous biomaterials, such as fibrin glue, matrigel, emulsion of extracellular matrix and alginate, for myocardial infarction. But there is a lack of studies about the platelet-fibrin scaffold for myocardial infarction.
OBJECTIVE: To explore the effect of the platelet-fibrin scaffold on rat myocardial infarction.
METHODS: Platelet-fibrin was used to prepare a platelet-fibrin scaffold, and 40 rat models of myocardial infarction were randomly divided into two groups: 200 μL platelet fibrins were injected into the tissues around the rat infarcted myocardium as platelet-fibrin scaffold group, and the same amount of DMEM was injected into the tissues around the rat infarcted myocardium as control group. Subsequently, expressions of vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor and insulin-like growth factor 1 released from the scaffold were detected. Production of endothelial cells and cardiomyocytes, cardiomyocyte apoptosis, capillary density and cardiac function in rats after implantation were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The platelet-fibrin scaffold was successfully prepared. The expression of vascular endothelial growth factor, hepatocyte growth factor and insulin-like growth factor 1 in the scaffold group was (115.7±19.45), (23.98±12.32) and (288.4±16.74) ng/L, respectively. The number of von Willebrand factor-positive cells and a-SA-positive cells in the platelet-fibrin scaffold group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). The number of TUNEL-positive cells in the platelet-fibrin scaffold group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). The capillary density and capillaries with blood flow in the platelet-fibrin scaffold group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Both the left ventricular end-diastolic volume and left ventricular end-systolic volume in the platelet-fibrin scaffold group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). In conclusion, the platelet-fibrin scaffold can promote the generation of endothelial cells, cardiomyocytes and capillaries, and further improve heart function. Besides, the platelet-fibrin scaffold exerts protective effect on the heart probably by secreting cytokines.

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Key words: Capillaries, Endothelial Cells, Myocytes, Cardiac, Myocardial Infarction, Fibrin, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张燕，陈岩，李庆民，孟华. 血小板纤维蛋白支架对心肌梗死的治疗作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(34): 5129-5135.

Zhang Yan, Chen Yan, Li Qing-min, Meng Hua. Platelet-fibrin scaffold for treatment of myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(34): 5129-5135.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析纳入SD大鼠40只，随机分为2组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 血小板纤维蛋白支架的制备和鉴定 DMEM和含有血小板的血浆进行混合后，25 s出现凝结现象，125 s全部凝结形成胶状。苏木精-伊红进行染色，结果发现血小板纤维蛋白支架结构呈纤维样(见图1)。大鼠的心肌细胞在血小板纤维蛋白支架中培养，发现心肌细胞的形态和活性均正常，培养第14天时血小板纤维蛋白支架中培养的心肌细胞和正常培养液中培养的心肌细胞分别为92.15±2.76和94.23±3.12，两者之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

在培养第14天时ELISA法检测细胞因子表达情况发现，血管内皮生长因子为(115.7±19.45) ng/L，肝细胞生长因子为(23.98±12.32) ng/L，胰岛素样生长因子1为(288.4±16.74) ng/L，表明血小板纤维蛋白支架能够不断释放细胞因子用于心肌的修复。

2.3 内皮细胞和心肌细胞在血小板纤维蛋白支架中的生成情况血小板纤维蛋白胶注射入梗死心肌内第7天时，大鼠心脏组织学结果显示少量内皮细胞和心肌细胞包围在大鼠梗死心肌组织周围，在血小板纤维蛋白支架附近见存活的内皮细胞和心肌细胞，血小板纤维蛋白支架组的vWF及a-SA阳性细胞数均明显高于对照组(P < 0.05)，见表1。表明血小板纤维蛋白支架可以促进内皮细胞和心肌细胞的生成。

2.4 血小板纤维蛋白支架组和对照组的细胞凋亡情况血小板纤维蛋白胶注射入梗死心肌内第7天时，TUNEL染色法辨别细胞活性，结果显示，血小板纤维蛋白支架组的TUNEL阳性细胞数为(3.42±1.13)个/mm²，对照组为(7.48±1.57)个/mm²，表明血小板纤维蛋白支架能够降低心肌细胞的凋亡(P < 0.05，图2)，对心肌细胞具有保护作用。

2.5 血小板纤维蛋白支架组和对照组的毛细血管密度比较血小板纤维蛋白支架注射入梗死心肌内第21天时，血小板纤维蛋白支架组的毛细血管密度明显高于对照组(P < 0.05)，血小板纤维蛋白支架组有血流的毛细血管明显多于对照组(P < 0.05)，见表2。表明血小板纤维蛋白支架能够促进心肌内毛细胞管的生成，且生成的毛细血管是具有血供的。

2.6 血小板纤维蛋白支架组和对照组的心脏功能比较血小板纤维蛋白胶注射入梗死心肌内后当天和第21天时，心脏超声结果显示血小板纤维蛋白支架组的左心室舒张末期容积和收缩末期容积均明显低于对照组(P < 0.05)，见表3。表明血小板纤维蛋白支架能够改善心肌梗死大鼠的心脏功能。

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引言

心肌梗死是一种心肌缺血坏死性疾病，主要发生在欧美国家，随着生活水平的提高以及心血管疾病的增加，国内心肌梗死的发生率也出现上升趋势，心肌梗死的诱因主要有暴饮暴食、过度劳累、情绪激动、寒冷刺激以及大量吸烟饮酒等，心肌梗死的发病机制为冠状动脉粥样硬化，在某些诱因的作用下心肌耗氧增加、冠状动脉痉挛，引起粥样斑块破裂，血小板在破裂的斑块表明聚集，对冠脉的血流造成阻断，引起相应区域的心肌细胞缺血缺氧，发生心肌坏死^[1-5] 。心肌梗死大量心肌的缺血坏死，最终引起心力衰竭。目前心肌梗死的治疗主要为一般护理治疗、药物治疗、介入治疗、溶栓治疗以及冠状动脉旁路移植治疗等，目前的治疗方法主要是改善心肌梗死的临床症状，不能从根本上扭转已经缺血坏死的心肌细胞，因此治疗效果比较有限。心脏移植虽然能够代替缺血坏死的心肌组织，但价格昂贵，供体获得困难，在临床应用中受到限制。寻找新的方法代替死亡的心肌细胞和组织是临床面临的主要问题。生物材料的发展为心肌梗死的治疗提供了新的治疗思路，目前已有纤维蛋白胶、基质胶、细胞外基质乳液、藻酸盐等多种生物材料用于心肌再生的治疗，并且取得了一定疗效。用于治疗心肌再生的生物材料需要具备取材简单、制备方便、生物兼容性好、对患者损伤小、并且能够为受到损伤的心肌提供功能和结构上的支持。血小板纤维蛋白支架符合上述治疗心肌再生的特点^[6-9] ，血小板纤维蛋白支架是否能对心肌梗死心肌起到治疗作用？文章对此进行了研究。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年4月至2015年6月在河南省人民医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：8周龄、健康、清洁级、雄性SD大鼠43只；出生两至三天健康、清洁级、雄性新生SD大鼠3只，均购自河南省实验动物中心，按照实验动物的标准进行饲养。实验方法经过动物伦理学委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 血小板纤维蛋白支架制备及检测

制备血小板纤维蛋白支架：将3只8周龄大鼠麻醉成功后，开腹，找到腹主静脉进行采血，采集血液与枸橼酸钠混合，离心，取上清液，将DMEM预热后和血清上清液混合，观察并记录开始成胶以及完成成胶时间。

血小板纤维蛋白支架苏木精-伊红染色：将组织切片后，加入苏木精染色，盐酸乙醇分化，去离子水洗涤，伊红染色，常规脱水、透明和封固。显微镜下观察血小板纤维蛋白支架的苏木精-伊红染色情况。

检测血小板纤维蛋白支架细胞因子的释放：在24孔板中加入血小板纤维蛋白支架，再加入IMDM液，在培养的第14天采用ELISA法检测培养基中的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1等细胞因子的表达情况。

收集大鼠心肌细胞：将新生大鼠麻醉成功后，取出心脏，置入Hanks平衡液中，剪切成小块，加入培养基中孵育，胶原酶进行消化，离心，制成心肌细胞悬液。

大鼠心肌细胞与血小板纤维蛋白支架共培养的活性观察：将收集的大鼠心肌细胞用CM-Dil染色，将部分大鼠心肌细胞和血小板纤维蛋白支架进行共培养，同时将另一部分心肌细胞常规培养。在培养第14天时，PBS冲洗，加入EthD-1和Calcein AM液孵育，显微镜下进行观察，每个孔取5个视野观察，取平均值。

1.4.2 动物实验

制备大鼠心肌梗死模型：将40只8周龄大鼠麻醉成功后，连接6导联动物心电图，剪开大鼠胸部皮肤，进入胸腔内，暴露心脏，结扎冠状动脉前降支，根据大鼠心肌的颜色变化以及心电图图形判断冠状动脉结扎成功后逐层关腹。

大鼠分组与处理：将40只大鼠按随机数字表法分为2组，即血小板纤维蛋白支架组和对照组。血小板纤维蛋白支架组于造模后即刻在梗死心肌四周注射血小板纤维蛋白胶共200 μL，对照组于造模后即刻在心肌梗死四周相同位置注射等量DMEM。在血小板纤维蛋白胶注射后当天和第21天以超声心动图检查大鼠心功能情况。

制备大鼠的心脏病理冰冻切片：注射后第21天将大鼠脱颈处死后，取出心脏，PBS洗涤，蔗糖液脱水，O.C.T包埋剂包埋，放入2-甲基丁烷液中冷却，以4 μm厚进行切片。

检测血小板纤维蛋白胶注射后内皮细胞和心肌细胞的生成情况：血小板纤维蛋白胶注射后第7天，随机取5只大鼠脱颈处死，取出心脏，PBS洗涤，蔗糖液脱水，O.C.T包埋剂包埋，放入2-甲基丁烷液中冷却，以 4 μm厚进行切片。对切片进行免疫组化染色，DAPI对细胞核进行染色，以及DMEM染色，纤维镜下进行观察，NIH Image J软件进行分析。

免疫组化染色：将冰冻切片用甲醛固定，PBS洗涤，加入DAKO蛋白阻滞液孵育，PBS洗涤，加入一抗过夜孵育，PBS洗涤，加入二抗孵育，PBS洗涤，Prolong免疫荧光封固剂封固，细胞需要核染时用含DAPI的封固剂封固。显微镜下观察，每张切片取5个视野观察，均平均值。

内皮细胞、心肌细胞和毛细血管、细胞凋亡的检测：注射后第7，21天采用免疫组化进行染色，其中心肌细胞染色一抗和二抗分别为小鼠抗a-SA和FITC-山羊抗小鼠二抗；血管内皮细胞染色一抗和二抗分别为兔抗vWF和FITC-山羊抗小鼠二抗；毛细血管结构染色为FITC-isolectinB4染色；细胞凋亡检测采用TUNEL染色。

大鼠心脏超声检查：在血小板纤维蛋白胶注射后当天和第21天将大鼠麻醉成功后，剃去胸部鼠毛，二维超声检查大鼠的心脏功能情况。

1.5 主要观察指标 ①观察血小板纤维蛋白支架释放血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1的表达。②心肌梗死大鼠内皮细胞和心肌细胞的生成情况。③观察2组大鼠心肌细胞凋亡情况、血管密度及心脏功能。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行数据分析，计量资料用x(_)±s表示，数据间比较采用t 检验，取P=0.05为显著标准。

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讨论

心肌梗死是心内科一种发病率比较高，比较凶险的疾病，治疗不及时会造成严重后果，甚至死亡^[10-12]，目前心肌梗死的治疗主要有：①药物治疗^[13-15]：溶栓治疗是心肌梗死的常用治疗方法，能够快速解除血栓引起的栓塞，改善心脏的血流供应；抗凝治疗能够对预防血栓的再次闭塞；抗血小板治疗对血栓素A2的形成起到抑制作用；β受体阻滞剂能够减低心脏的耗氧量，改善心肌梗死的症状；血管紧张素转换酶抑制剂可以扩张血管，降低心脏耗氧量，改善心脏功能等。②经皮冠状动脉介入治疗^[16-19]：该方法可以挽救濒临死亡的心肌细胞，对左室重构起到积极作用，可以改善心肌梗死的预后。③冠状动脉搭桥^[20-22]：冠状动脉搭桥是改善心肌缺血的比较有效的方法，对于改善心肌缺血，延长患者寿命起到一定作用。目前心肌梗死的治疗常用的方法主要为改善临床症状，不能逆转缺血坏死的心肌细胞，因此寻找一种能够促进心肌细胞再生，从根本上治疗心肌梗死的方法至关重要。

生物材料是治疗心肌梗死的一种新的方法，来源于自身的生物材料能够最大限度的降低患者的免疫排斥作用。纤维蛋白基质能够在损伤部位形成，为损伤部位提供结构支持，血小板纤维蛋白支架能够从血液中提取，可以代替异体的纤维蛋白胶，其血液收集和制备过程比较简单。血小板纤维蛋白胶呈三维结构，由纤维蛋白形成立体网络状，并且在不同区域，纤维蛋白网的疏密状况不同，血小板纤维蛋白支架能够为种子细胞提供比较好的三维立体生存空间^[23-25]，而且能够释放多种细胞因子调节细胞的分化和增殖^[26-28]，激活后的血小板可以释放血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、血小板衍生生长因子、表皮生长因子受体等细胞因子，释放的细胞因子已被证实在干细胞、牙髓细胞等细胞的迁移、增殖以及分化具有调节作用，在口腔科、骨科等多个领域中已有应用^[29-35]。血小板纤维蛋白支架在心肌梗死中的研究不多。文章通过制备血小板纤维蛋白支架，建立大鼠心肌梗死模型，对心肌梗死大鼠的心肌梗死区域注射血小板纤维蛋白支架，并同时设立对照组，对照组在心肌梗死区域注射DMEM，观察血小板纤维蛋白支架细胞因子血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1的表达、心肌梗死大鼠的内皮细胞和心肌细胞的生成、心肌细胞的凋亡、血管密度、心脏功能。结果发现，血小板纤维蛋白支架能够被成功制备，在纤维蛋白支架培养的第14天时血小板纤维蛋白支架中培养的心肌细胞和正常培养液中培养的心肌细胞比较差异无显著性意义。在培养第14天时采用ELISA法检测培养基中的细胞因子表达情况发现：血管内皮生长因子为(115.7±19.45) ng/L，肝细胞生长因子为(23.98±12.32) ng/L，胰岛素样生长因子1为(288.4±16.74) ng/L，表明血小板纤维蛋白支架不仅不影响心肌细胞的生长，并且能够不断释放细胞因子用于心肌的修复。血小板纤维蛋白胶注射入梗死心肌内第7天时大鼠梗死心肌组织周围有内皮细胞和心肌细胞包围，在血小板纤维蛋白支架附近见存活的内皮细胞和心肌细胞，血小板纤维蛋白支架组的vWF阳性细胞数明显高于对照组，血小板纤维蛋白支架组的a-SA阳性细胞数也明显高于对照组。血小板纤维蛋白支架组的TUNEL阳性细胞数为(3.42±1.13)个/mm²，对照组的TUNEL阳性细胞数为(7.48±1.57)个/mm²，血小板纤维蛋白支架组的TUNEL阳性细胞数明显低于对照组。血小板纤维蛋白胶注射入梗死心肌内第21天时，血小板纤维蛋白支架组的毛细血管密度明显高于对照组；血小板纤维蛋白支架组有血流的毛细血管明显多于对照组。血小板纤维蛋白支架注射入梗死心肌内后当天和第21天时，心脏超声结果显示血小板纤维蛋白支架组的左心室舒张末期容积和左心室收缩末期容积均明显低于对照组的左心室舒张末期容积和左心室收缩末期容积。表明血小板纤维蛋白支架能够促进内皮细胞、心肌细胞以及毛细血管的生成，能够改善心脏功能。对心肌细胞具有保护作用。其机制可能为血小板纤维蛋白支架分泌细胞因子有关^[36]，血小板纤维蛋白支架分泌的细胞因子中，血管内皮生长因子具有促进毛细血管生成的作用^[37]；肝细胞生长因子具有促进心肌细胞增生，促进毛细血管生成，保护受损失的心肌组织^[38]；胰岛素样生长因子1作为肽类激素，能够刺激心肌细胞分化，诱导心肌细胞分裂，阻止心肌细胞凋亡的作用^[39]。可见血小板纤维蛋白支架分泌的细胞因子均具有保护心肌的作用。

综上所述，血小板纤维蛋白支架能够促进内皮细胞、心肌细胞以及毛细血管的生成，改善心脏功能，血小板纤维蛋白支架对心脏的保护作用可能与其分泌的细胞因子有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程