自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 1-8.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.001

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自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

王善正，王宸，芮云峰

东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009

收稿日期:2012-11-02 修回日期:2012-12-15 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 王宸，教授，硕士生导师，东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210009 wangchen@medmail.com.cn
作者简介:王善正★，1987年生，江苏省新沂市人，汉族，东南大学在读硕士，主要从事骨与关节损伤的研究。wshz2007@ yahoo.com.cn
基金资助:
江苏省自然科学基金青年基金项目(BK2012334)；东南大学“创新基金”项目(3290002401)。

Effect of activated autologous platelet-rich plasma on chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro

Wang Shan-zheng, Wang Chen, Rui Yun-feng

Department of Orthopedics, Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Received:2012-11-02 Revised:2012-12-15 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: Wang Chen, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China wangchen@ medmail.com.cn
About author:Wang Shan-zheng★, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China wshz2007@yahoo.com.cn
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2012334*; Innovation Foundation of Southeast University, No. 3290002401*

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子，可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。
目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。
方法：取兔股骨骨髓，全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞；取第3代骨髓间充质干细胞，分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养，观察其向成软骨细胞分化情况。
结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形，传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44，而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原；实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P < 0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 富血小板血浆, 骨髓间充质干细胞, 软骨细胞, 分化, Ⅱ型胶原, Ⅱ型胶原α1链, 聚集蛋白聚糖, 兔, 关节软骨损伤, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-rich plasma, when activated, could secret multiple growth factors which may promote the proliferation and differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of activated autologous platelet-rich plasma on the chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: Rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells were isolated using the whole bone marrow adherence method. Passage 3 bone marrow-derived mesenchymal stem cells were in vitro cultured with 10% activated autologous platelet-rich plasma and 10% fetal bovine serum separately. Chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were successfully isolated and exhibited a long-shuttle-shaped appearance. Cells grew faster when passaged. Immunofluorescence staining showed that after induced by activated autologous platelet-rich plasma, bone marrow-derived mesenchymal stem cells exhibited type Ⅱ collagen expression. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression of α1 chain of type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA was significantly up regulated in the bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by activated autologous platelet-rich plasma than in the cells induced by fetal bovine serum (P < 0.01). Our findings in this study suggested that activated autologous platelet-rich plasma can promote the chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, platelet-rich plasma, bone marrow mesenchymal stem cells, chondrocytes, differentiation, type Ⅱ collagen, type Ⅱ collagen α1 chain, aggrecan, rabbits, articular cartilage damage, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

王善正，王宸，芮云峰. 自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 1-8.

Wang Shan-zheng, Wang Chen, Rui Yun-feng. Effect of activated autologous platelet-rich plasma on chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 1-8.

图/表（结果） 7

2.1 分离培养的兔骨髓间充质干细胞的形态原代细胞培养3 d首次换液，可见少量单个核细胞贴壁生长，多为圆形或多角形。经两三次换液后，去除大量漂浮的细胞，可见分散的骨髓间充质干细胞小集落，细胞逐渐转变为长梭形，胞核为圆形或椭圆形，胞浆内可见较多的颗粒，见图2。培养6-9 d，细胞迅速生长，小集落逐渐融合成大集落，可呈辐射状生长。培养第10天和第11天的细胞大部分融合，达90%以上。

注：可见多个骨髓间充质干细胞形成的小集落逐渐融合成大集落，呈辐射状生长图2 原代培养第6天的兔骨髓间充质干细胞的生长情况(倒置显微镜，×100)

Figure 2 Growth of primary cells on d 6 of culture (inverted microscope, ×100)

传代培养后，细胞形态呈较为均一的长梭形，排列更加整齐、紧密，见图3。传代后细胞增殖速度明显加快，培养五六天，细胞即可达90%以上融合，可再次进行传代。

注：细胞呈长棱形，排列整齐、均一图3 体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞的生长情况(倒置显微镜，×100)

Figure 3 Growth of passage 3 rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in vitro (inverted microscope, ×100)

图4 分离培养的第3代兔骨髓间充质干细胞的表型鉴定结果 Figure 4 Results of flow cytometry in passage 3 rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. The cells are negative for CD45 (a), but they are positive for CD29 (b) and CD44 (c)

2.2 分离培养的兔骨髓间充质干细胞的表型见图4。

2.3 经自体激活富血小板血浆诱导的兔骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达见图5，6。免疫荧光细胞化学染色显示，兔骨髓间充质干细胞经自体激活富血小板血浆诱导2周后，荧光显微镜下可见大量发绿色荧光的Ⅱ型胶原免疫阳性细胞，见图5，说明自体激活富血小板血浆可诱导兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化。而对照组的骨髓间充质干细胞未见绿色荧光，即Ⅱ型胶原表达为阴性，见图6。可见自体激活富血小板血浆能够诱导兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化。

注：荧光显微镜下见大量发绿色荧光的Ⅱ型胶原阳性细胞，说明自体激活富血小板血浆可诱导兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化图5 自体激活富血小板血浆诱导2周的兔骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达(免疫荧光细胞化学染色，×200)

Figure 5 Type Ⅱ collagen expression in rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells after 2 wk induction by activated autologous platelet-rich plasma (immunofluorescence staining, ×200) 注：荧光显微镜下未见发绿色荧光的Ⅱ型胶原阳性细胞，可见胎牛血清诱导兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的能力很弱图6 胎牛血清诱导2周的兔骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原的表达(免疫荧光细胞化学染色，×200)

Figure 6 Type Ⅱ collagen expression in rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells after 2 wk induction by fetal bovine serum (immunofluorescence staining, ×200)

2.4 经自体激活富血小板血浆诱导的兔骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链和聚集蛋白聚糖mRNA的表达实时荧光定量PCR扩增结果显示，各基因PCR产物的熔解曲线峰形锐利，熔解温度较均一，见图7。

注：曲线峰形锐利，说明熔解温度较均一图7 Ⅱ型胶原α1链和聚集蛋白聚糖荧光定量PCR熔解曲线 Figure 7 Quantitative real-time PCR dissociation curves of type 2α1 collagen and aggrecan

统计学结果显示，与对照组比较，富血小板血浆组骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链和聚集蛋白聚糖mRNA的表达均明显增高，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表2。

表2 经自体激活富血小板血浆诱导的兔骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链和聚集蛋白聚糖mRNA的表达

Table 2 Analysis of type 2α1 collagen and aggrecan mRNA expression in rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells after induced by activated autologous platelet-rich plasma (x(_)±s, n=6, ΔCt)

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引言

关节软骨缺损通常会导致骨性关节炎，并受到诸如遗传、代谢、生化和生物力学等因素影响^[1]。作为无血管组织，软骨的自然修复能力极其有限。关节软骨缺损保护性治疗包括关节清理、软骨镶嵌、软骨膜移植、自体软骨细胞移植等，其治疗结果差异较大，长期满意度较低^[2]。人工关节置换是治疗较为严重的关节软骨缺损的常见方法，但是由于其对年轻患者的使用禁忌和严重的并发症难以普及。

近年来，生物学治疗尤其是成体间充质干细胞疗法为软骨缺损修复带来希望。成体间充质干细胞具有多向分化潜能，在促进骨折愈合、软骨损伤、椎间盘退变以及肌腱损伤修复的生物学治疗中发挥重要作用^[3-4]。其中，骨髓间充质干细胞取材方便，易于培养，自体移植无明显排斥反应，是较为理想的种子细胞^[5]。

富血小板血浆是通过离心法从全血中提取出来的血小板浓聚物，含有较高浓度的血小板、白细胞和纤维蛋白^[6]。血小板激活后能够释放释放转化生长因子β、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子等多种因子，可以有效地促进受损组织的修复。周海洋等^[7]以桡骨中下1/3处骨折为模型，应用自体富含血小板血浆凝胶进行干预，发现富含血小板血浆可通过增加骨痂中骨岛量和加速Ⅰ型胶原合成而明显促进长骨骨折愈合。耿震等^[8]的研究亦证实富血小板血浆可促进兔损伤肌腱的修复，改善其愈合质量，并且发现其机制可能与富血小板血浆中转化生长因子β1的表达有关。近年来，另有众多体外研究结果表明，富血小板血浆可以促进骨髓间充质干细胞定向分化，对未来基于干细胞增殖分化的组织工程学疗法提供了更多的选择^[9-10]。

目前大量研究报道了富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖和分化具有促进作用^[11-12]，对未来组织工程学受损组织修复具有重要意义^[13]。而当前富血小板血浆对骨髓间充质干细胞诱导分化研究结果仍存在差异，且成软骨分化研究报道较少。

实验旨在通过证实自体激活富血小板血浆诱导兔骨髓间充质干细胞成软骨分化，为骨髓间充质干细胞应用于软骨组织工程学修复提供理论依据。

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2012年5至8月在东南大学医学院外科学实验中心完成。

材料：

实验动物：健康3月龄新西兰大耳白兔10只，普通级，体质量2.0-3.0 kg，由江苏省农科院提供，许可证号：SCXK(苏)2007-0004。实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求^[14]。

方法：

骨髓间充质干细胞的分离纯化与培养：向新西兰大耳白兔耳缘静脉注射体积分数2.5%戊巴比妥钠将其麻醉，固定于兔台上，持16号骨穿针，倾斜刺入免髂骨骨髓腔，外接3 000 U肝素0.2 mL润洗过的10 mL无菌注射器，抽取骨髓1 mL，3倍体积DMEM混合后，1 000 r/min离心5 min，弃上清，将细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基(含青霉素和链霉素各100 U/mL)，重悬后接种到 25 mL塑料培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的细胞培养箱培养，3 d后首次换液，以后每3 d换液1次。10 d左右细胞接近融合时，2.5 g/L胰酶消化，按1∶2传代。倒置显微镜下逐日观察细胞生长情况。

自体激活富血小板血浆的制备：参照Zhang等^[15]方法制备自体激活富血小板血浆并进行改良。于兔耳缘静脉取血约10 mL，装入有枸橼酸抗凝剂的试管中，摇匀，注意全程无菌操作。

制备方法：第1次以离心力250×g离心10 min后，血液分为上清液和红细胞2层，保留全部上清液及交界面以下1.0-2.0 mm处，并再次以离心力1 000×g离心 10 min。吸除上层液体，约占总体积50%，剩余液体摇匀后并与体积分数2.5%CaCl₂溶液按体积比10∶1比例混合以激活，37 ℃水浴箱放置1 h，离心力2 000×g离心10 min。吸取上层液体，于-80 ℃存储，直至使用，制备流程见图1。

骨髓间充质干细胞的细胞表面标志鉴定：取培养扩增3代后的骨髓间充质干细胞，去掉培养液，用1∶1的 2.5 g/L胰蛋白酶消化后，用PBS洗涤后制成含有1.5×10⁶个骨髓间充质干细胞的单细胞悬液，分入4组试管，每管20 μL，其中3组为试验组，1组为对照组，试验组滴加适当的一抗(CD29、CD44、CD45单克隆抗体；每20 μL原液加10 μL一抗)，对照组加同样剂量PBS。室温下避光孵育30 min，PBS洗3次，分别加入FITC标记二抗(1∶40)混匀，4 ℃下避光孵育30 min。PBS洗2次，调细胞浓度到1.5×10⁹ L^-¹，上流式细胞仪，每次计数 10 000个细胞，根据荧光强度确定CD29、CD44、CD45的表达量。

实验分组：取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于内含盖玻片的12孔培养板内，按随机数字法分成2组，每组6个复孔。

(1)富血小板血浆组：予以低糖DMEM完全培养基中加入含体积分数10%的富血小板血浆培养。

(2)对照组：予以低糖DMEM完全培养基中含体积分数10%的胎牛血清培养。

免疫荧光细胞化学染色检测细胞Ⅱ型胶原的表达：富血小板血浆诱导2周后接种于六孔板中，待细胞融合度为50%-80%，甲醇固定10 min，PBS洗3次，每次3-5 min，用含体积分数5%小牛血清的PBST封闭60 min，羊抗兔Ⅱ型胶原一抗孵育60 min，PBS洗3次，3-5 min/次，FITC荧光标记的二抗避光孵育60 min，PBS洗3次，3- 5 min/次，荧光显微镜观察。

实时荧光定量PCR分析Ⅱ型胶原α1链和聚集蛋白聚糖mRNA在骨髓间充质干细胞中的表达：参考比较阈值法^[16]，该法以内参作均一化处理，实验组和对照组的△Ct=Ct_目的-Ct_内参，表示目的基因相当于内参表达的比例；ΔΔCt=实验组(Ct_目的基因-Ct_管家基因)-对照组(Ct_目的基因-Ct_管家基因)，2^-^△△Ct可反映实验组与对照组目的基因表达的差异(倍数)。将富血小板血浆组和对照组骨髓间充质干细胞平行培养2周后分别提取总RNA，并反转录为cDNA，应用嵌入荧光染料SYBR Green Ⅰ进行实时荧光定量PCR扩增。以β-actin为内参，PCR扩增应用的引物序列，见表1。

反应体系为SYBR Green I Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物各1 μL，加去离子水补足体积至25 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，最佳退火温度15 s，72 ℃ 45 s，共40个循环，读取融解曲线。Ⅱ型胶原α1链基因、聚集蛋白聚糖基因的相对表达水平用△Ct表示，不同时间点之间的表达用2^-^ΔΔ^Ct比较。

主要观察指标：

(1)原代及传代细胞的形态。

(2)流式细胞仪分析结果。

(3)富血小板血浆诱导分化后骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原的表达。

(4)富血小板血浆诱导分化后骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原α1链和聚集蛋白聚糖基因的表达。

统计学分析：结果用x(_)±s表示，采用SPSS 17.0统计软件，以配对t 检验进行统计学处理，P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

富血小板血浆目前为骨科学及修复重建外科学研究的热点，作为治疗制剂具有广阔的生物学应用前景^[17-18]。同其他生物学制剂相比，其自体源性是最大的优势。体外实验已证实富血小板血浆可以促进干细胞的增殖和分化^[19]，局部直接应用也可以促进组织内源性再生^[20-21]。使用富血小板血浆促进组织再生的优势在于其来源于自体组织，无传播疾病及引起免疫反应的危险。富血小板血浆内的生长因子仅结合于细胞跨膜受体，并不进入细胞或其胞核，因此不具有致突变或诱发肿瘤的效应，而只是加速了正常的愈合过程^[22]。富血小板血浆最早被用来修复骨折，修复重建外科及牙科也利用富血小板血浆促进骨融合^[23]。目前富血小板血浆作为多细胞因子的鸡尾酒疗法属于骨科学研究的热点，其释放的多种细胞因子通过协同作用对间充质干细胞的分化及细胞外基质的代谢产生的积极的影响。实验通过两次离心法获取自体富血小板血浆，激活后对兔骨髓间充质干细胞进行干预，证实了其促进兔骨髓间充质干细胞成软骨的作用，为富血小板血浆在临床软骨缺损修复中的应用提供实验依据。

骨髓间充质干细胞目前尚缺乏统一的特异表型标志，它既表达间充质干细胞的表面抗原，又表达内皮细胞、上皮细胞表面抗原，包括CD29、CD44、CD71、和CD90等^[24]。不表达造血细胞表面标志，包括CD14、CD34及白细胞共同抗原CD45等^[25]。大多数依赖其形态、表型、多向分化能力来协助鉴定。实验通过全骨髓贴壁培养法成功培养出骨髓间充质干细胞，流式细胞仪数据显示第3代细胞高度表达CD29、CD44，而不表达CD45，表明实验培养的兔骨髓间充质干细胞表达间充质干细胞表面标志，纯度较高。

骨髓间充质干细胞是骨组织工程中种子细胞的主要来源，在一定诱导条件下，该细胞可以向多种中胚层组织分化，包括骨、软骨和脂肪等^[26]。寻找合适的条件促进骨髓间充质干细胞增殖并向成软骨细胞分化，是目前软骨组织工程学研究的方向之一^[27]。选取有效的生物活性因子促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化将是研究的重点。有报道称转化生长因子β1可以有效促进骨髓间充质干细胞成软骨分化^[28]，而联合应用一些生长因子亦可以在诱导骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的过程中产生协同作用^[29]。实验结果表明，自体富血小板血浆激活后释放一系列生长因子可诱导骨髓间充质干细胞的成软骨分化。富血小板血浆组中，Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色呈阳性，而对照组为阴性。Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因是软骨细胞中特异性增殖基因，编码主要的软骨基质蛋白Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖，这是软骨细胞特异性标志蛋白^[30-31]。实验中，实时荧光定量PCR数据显示富血小板血浆上调了骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因的表达，进一步证实了自体激活富血小板血浆促进了骨髓间充质干细胞的成软骨分化。

综上所述，实验结果证实自体激活富血小板血浆对兔骨髓间充质干细胞具有促进成软骨分化作用，为应用骨髓间充质干细胞构建工程化软骨，修复软骨缺损奠定了基础。而富血小板血浆所释放一系列生长因子是通过何种作用机制促进兔骨髓间充质干细胞分化，同时诱导后的软骨前体细胞进一步的分化结果仍有待研究。伴随着以上问题的解决，富血小板血浆的临床应用将具有广阔前景。

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

Effect of activated autologous platelet-rich plasma on chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro

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